真核基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
真核基因在大肠杆菌中表达
增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源 基因的表达效率。
翻译终止子：必须存在终止密码子。
✓ 构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。
✓ 大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA ✓ 当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。
真核基因在大肠杆菌中表达
翻译起始序列：决定mRNA翻译起始效率。
未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降 低mRNA 5’-末端二级结构的形成，增加RBS中A、 T含量，碱基定点突变等。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
目前常用的表达系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物 和哺乳动物细胞等
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达系统的优越性
➢ 背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机 理研究的比较深入。
➢ 安全(被FDA批准为安全的基因工程受体生物)， 且有多种不同的菌株和质粒载体。
➢ 已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。 ➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进
物使外源基因获得表达，如IPTG、温度等。
真核基因在大肠杆菌中表达
转录终止子（TT）
✓ 上游启动子会抑制下游启动子 的转录功能(启动子封堵作用)， 因此需要在克隆基因编码区的 3’-末端接上一个有效的转录终 止子。
✓ 转录终止子能增强mRNA分子 的稳定性，从而提高蛋白质产 物的水平。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因在大肠杆菌中表达
内容提纲
基因工程问答题
探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。
16.Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。
被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。
17.Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。
被检对象为RNA,探针为DNA 或RNA。
18. Western杂交: Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方20.基因文库：将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。
21. cDNA文库：从组织细胞中分离得到纯化的mRNA，然后以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建cDNA 文库。
36. 末端转移酶: 一种从小牛胸腺组织中分离得到的酶 可使dnTp添加剂加到DNA分子的3’—oH末端上 不要求模板 但需Co2+的存在基因克隆载体 通过不同途径能将外源DNA片段载入受体细胞 并在其中得以维持的DNA分子称为基因克隆载体或DNA克隆载体2.限制性核酸内切酶的活性受那些因素的影响？ 1样品的纯度 2 DNA样品的甲基化程度 5 酶的纯度 3 缓冲液性质 6 DNA分子的构型 4酶切反应的温度与时间 7 限制性核酸内切酶的星号活性说明使用切口位移法进行说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤: 原理：在Mg2+存在时，用低浓度的DNA酶I（DNaseI）处理双链DNA，使之随机产生单链断裂，这时DNA聚合酶I的5′→3′外切酶活性盒聚合酶活性可以同时发生。
外切酶活性可以从断裂处的5′端除去一个核苷酸，而聚合酶则将一个单核苷酸添加到断裂处的3′端。
由于大肠杆菌DNA聚合酶I不能使断裂处的5′－P和3′—OH形成磷酸二酯键二连接，所以，随着反应的进行，即5′端核苷酸不断去除，而3′端核苷酸同时加入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象就成为切口平移。
提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率
提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率摘要：对于基因工程，无论是在原核生物中，还是在真核生物中，外源基因的表达效率一直是人们关注的问题。
这篇综述简要的从启动子、质粒、mRNA转录本、密码子的偏好性、宿主选择、培养条件方面论述如何提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率。
关键词：真核基因大肠杆菌表达效率前言：基因工程越来越被广泛应用，人们可以利用基因工程获得高产,稳产和具有优良品质的农作物,培育出各种具有抗逆性的作物新品种。
利用基因技术还可以高效率的生产各种高质量，低成本的药品，如：胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等。
通常要把目的基因导入大肠杆菌进行表达，因为大肠杆菌表达系统相对于其它，比如酵母细胞表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统有一定的优越性：对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机制有深刻的了解；拥有各类适用的寄主菌株和不同的载体；许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌中有效、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。
但也有缺点，比如说真核基因的转录信号同原核不同，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子，外源基因可能含有大肠杆菌终止子序列，表达产物音折叠错误或缺少翻译后修饰而没有生物活性，本身含有内毒素或毒性蛋白等。
所以真核基因在大肠杆菌中表达可能会遇到如下问题：●缺乏拼接机制：由于原核基因无内含子，目的基因表达后的mRNA内含子无法去除；●缺乏翻译、加工：不能对蛋白质进行糖基化、磷酸化等；●容易降解：细菌对外源蛋白有排斥作用。
正文：一、目标蛋白在大肠杆菌中表达首先要构建表达载体，表达载体包括以下几个部分：★复制起始位点★选择标记基因★启动子★核糖体结合位点★多克隆位点★转录终止序列用图表示即为：二、影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素有：●启动子●质粒●mRNA转录本●密码子的偏好性●宿主选择●培养条件（一）启动子在基因的表达调控中，转录的起始是个关键某个基因是否能正常的表达常常决定于特定启动子的起始过程，启动子是DNA分子与RNA聚合酶相结合的部位，是转录的基本信号。
生物技术制药复习知识点
生物技术制药复习知识点第一章绪论1.生物制药的研究内容包括基因工程制药, 细胞工程制药, 酶工程制药和发酵工程制药。
2.生物技术制药, 是采用现代生物技术人为地创造一些条件, 借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物, 是采用DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4.生物药物, 指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分, 甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。
5.现代生物药物四种类型: ①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。
②基因药物, 如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
③来自动植物和微生物的天然生物药物。
④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类: 治疗药物, 预防药物和诊断药物。
7.生物技术药物的特性：分子结构复杂, 具种属特异性, 治疗针对性强、疗效高, 稳定性差, 基因稳定性, 免疫原性、重复给药会产生抗体, 体内半衰期短, 受体效应, 多效性和网络效应, 质量控制的特殊性, 生产系统的复杂性。
8.生物技术制药特征：高技术, 高投入, 长周期, 高风险, 高收益。
9.基因诊断: 指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章基因工程制药1.利用基因工程技术生产药品的优点: （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等）, 为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质, 以便对其生理、生化和结构进行深入的研究, 从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处, 可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物, 扩大药物筛选来源。
分子生物学答案
分子生物学答案分子生物学答案一、名词1、鸟枪法（Shotgun method）：使用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆的方法。
使用限制性内切酶将带有目的基因的DNA链切成若干小段，再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中，并使其表达。
2、色氨酸操纵子（tryptophane operon）：负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。
3、酶切图谱（Macrorestriction Map）：描述限制性内切酶的酶切点的位置和距离信息的图谱。
4、原位杂交（in situ hybridization）：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。
5、结构域（domain）：是构成蛋白质三级结构的基本单元，是指生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，是蛋白质生理功能的结构基础，这种相对独立的区域性结构就称为结构域。
6、DNA杂交（Southern blotting）：又称为Southern杂交，即用放射性标记的探针与靶DNA进行杂交的技术。
7、基因组文库（genomic library）：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。
这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库（短答案：是指采用基因组克隆的方法，克隆的一套基因组DNA片段。
）8、粘性末端（cos site-carring plasmid）：当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸，叫做粘性末端。
9、一致序列（又称保守序列：conserved sequence）：遗传物质里的片段极少发生突变而且在不同生物中广泛存在。
生物技术制药复习知识点
生物技术制药复习知识点第一章绪论1.生物制药的研究内容包括基因工程制药，细胞工程制药，酶工程制药和发酵工程制药。
2.生物技术制药，是采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物，是采用DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4.生物药物，指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。
5.现代生物药物四种类型：①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。
②基因药物，如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
③来自动植物和微生物的天然生物药物。
④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类：治疗药物，预防药物和诊断药物。
7.生物技术药物的特性：分子结构复杂，具种属特异性，治疗针对性强、疗效高，稳定性差，基因稳定性，免疫原性、重复给药会产生抗体，体内半衰期短，受体效应，多效性和网络效应，质量控制的特殊性，生产系统的复杂性。
8.生物技术制药特征：高技术，高投入，长周期，高风险，高收益。
9.基因诊断：指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章基因工程制药1.利用基因工程技术生产药品的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
2.基因工程技术就是将目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
生物制药复习题（有答案）
生物制药复习题（有答案）《生物技术制药》习题（课后作业）一、下列概念：⑴生物制药：⑵生物药物：包括生物技术药物，天然生化药物，微生物药物，海洋药物和生物制品。
(3)生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。
(4)生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
（5）现代生物技术：以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。
（6）基因表达：⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。
2、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程（7）质粒的分裂不稳定：基因工程菌分裂时产生一定比例不含质粒的子代菌的现象,即重组分子从受体细胞中逃逸。
（8）质粒的结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
重组DNA分子某一区域发生变异，导致表观生物学功能的丧失；（9）显微注射：显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。
经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。
（10）悬浮细胞：（11）补料分批培养：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。
（12）连续培养行下去的一种培养方法。
（13）接触抑制：细胞在生长分裂时达到相互接触而停止分裂的现象,称为接触性抑制（14）单克隆抗体：由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。
（15）多克隆抗体：一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。
这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。
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功能启动子的分离： 一般程序： 1. 选用一种适当的核酸内切酶，消化切 割大肠杆菌的染色体DNA， 2. 接着将切割产生的DNA限制片断群体， 同一种无启动子的质粒载体重组，按 实验设计要求使克隆的片断恰好插入 在紧邻报告基因的上游位置 3. 随后把此重组混合物转联反应测定法 使DNA模板在细菌无细胞体系中， 进行转录－转译偶联反应。经过改 良的这种体系中，可以使克隆在细 菌质粒或噬菌体基因组上的外源片 断进行体外表达，就可以比较容易 的确定多肽片断是由编码模板上的 哪个小片段指导合成的。
优点： 1. 放射性标记参入到蛋白质的效率， 比体内标记法高的多，而且这个系 统十分敏感。经35S标记的多肽分子， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自 显影若干小时后可被迅速检出； 2. 应用这个体系，其它原核生物的基 因也能够得到有效的表达。
大肠杆菌中表达体系的不足： 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间 存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启 动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转 录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的 有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。
通过蔗糖梯度离心将微细胞与 正常细胞分开，含有质粒载体的 微细胞是适于检测重组子质粒所 携带的外源基因表达状况的理想 体系。
Example:
ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）, 在微细胞中不能合成出56103dal、 42103dal、30103dal、 28103dal四种多 肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。 当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插 入到卡那霉素基因内部时，便能在微细胞 中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多 肽分子。
3. 转译起始序列 5’-末端结构特征，决定mRNA的转 译起始效率。 在核糖体结合位点（RBS）的序列 结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱 氧核苷残基含量的比例，诱发碱基 发生定点突变；或使用转译偶联系 统进行克隆基因表达
4.转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中 的表达效率。 5. 转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码 子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA， 尤其是在其后加上U形成UAAU四联 核苷酸的情况下，转译终止的效率 便会得到进一步的增强。
4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要 经过转译后的加工修饰（正确折叠 和组装），而大多数的这类修饰作 用在细菌细胞中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真 核基因所表达的蛋白质分子，并把 它们降解掉。
克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件：应该能够进行正常的 转录和转译，以及在正常情况下还 与转译后加工及新生多肽在细胞中 的分布有关。
第三 这种启动子应是诱导型的，能通 过简单的方式使用廉价的诱导物而 得以诱导。 （IPTG）
2. 转录终止子 启动子封堵作用：由一个上游启动 子驱动的转录作用，当其通读过下 游启动子时，便会使该启动子的功 能受到抑制，将这种由一个启动子 的功能活性抑制另一个启动子转录 的现象，叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子 的稳定性，从而提高蛋白质产物的 水平。
巨细胞检测法 1. 经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrA细 胞，DNA停止合成，而质粒载体则可以 继续合成，在紫外线照射后6小时，细 胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右， 在紫外线照射后的几个小时内，加入经 放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白 质绝大部分是质粒基因所编码的。
2. 将含有外源基因的λ噬菌体重 组子，感染到事先经过紫外线严格 照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞 经紫外线照射使DNA受到了损伤， 自身基因的表达受到了严重的抑制。 通过同λ噬菌体载体编码的蛋白质 种类作比较，就可以鉴定出克隆基 因编码的蛋白质产物。
大肠杆菌表达载起点
组成部分
1.启动子： 最佳启动子具备的条件 第一 必须是将启动子，能够克隆基因的 蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%30%以上 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的 基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或 是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下， 使用高度抑制型的启动子是一种极为重要 的条件
报告基因（reporter gene）：特指那些 编码产物可以被快速测定的功能核苷酸 编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸 酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基 因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒） 是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和 组织；也可用来同任何一种目的启动子 连接，因此其表达活性可作为检测启动 子功能的依据。
重要条件：编码的蛋白质产物应能 维持正常的稳定性。
具有核糖体结合位点； 具有克隆基因的功能（强）启动子； 插入序列的正确取向。
真核基因在大肠杆菌中的表达
克隆基因表达活性的检测
1.微细胞检测法； 2.巨细胞检测法； 3.偶联反应测定法。
微细胞检测法： 这是一种适于检测质粒基因表达的 体内检测法。 微细胞：指由某些细菌突变体菌株 在其生长期间连续产生的一类微小 的圆形的无核细胞。
第四章 真核基因在大肠杆菌中的表达
• • • • 真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因 素
• 大肠杆菌表达体系 • 克隆基因正确表达的基本条件 • 克隆基因表达活性的检测
真核基因的大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系
优越性：
1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因 表达调控的分子机理有深刻的了解； 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥 有各类适用的寄主菌株和不同类型的载 体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆 菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本 低廉，易用于批量生产。