基因克隆及蛋白表达 PPT课件
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基因的克隆方法ppt课件
1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
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分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
克隆基因的表达
实际的启动子中很少具备与上述序列完全一 致的区域，启动子的这两个区域与上述保 守序列的相似程度越高，该启动子的表达 能力也就越强。
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
现代分子生物学ppt课件
现代分子生物学ppt课件
目录
• 分子生物学概述 • 基因与基因组 • DNA复制与修复 • RNA转录与加工 • 蛋白质翻译与修饰 • 基因表达调控 • 分子生物学技术与应用
01 分子生物学概述
分子生物学的定义与发展
分子生物学的定义
在分子水平上研究生物大分子的 结构和功能，以揭示生命现象本 质的科学。
重组DNA技术的应用
阐述重组DNA技术在基因克隆、基因表达、基因治疗等领域的应 用。
重组DNA技术的优缺点
分析重组DNA技术的优点，如高效、精确等，同时也指出其存在 的缺点，如安全性问题等。
PCR技术原理，包括引物设计、DNA聚合酶的作用 等。
PCR技术的应用
基因表达的调控
研究基因表达在时间和空间上的调控机制， 包括转录因子、表观遗传学等。
分子生物学与生物学的关系
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学研究生物大分子的结构和功能，是揭示生命现象本
质的基础科学。
分子生物学推动生物学的发展
02
随着分子生物学理论和技术的不断发展，生物学的研究领域不
断拓宽，研究水平不断提高。
microRNA调控
一类非编码小RNA分子，通过与靶mRNA结合抑制其翻译或促进 其降解来调节基因表达。
基因表达调控的生物学意义
适应环境变化
细胞分化和发育
能量代谢平衡
响应生物和非生物胁迫
基因表达调控使生物能够根据 不同环境条件调整其生理和代 谢状态，以维持生存和繁殖。
在细胞分化和发育过程中，基 因表达调控确保不同类型细胞 具有独特的表型和功能。
列举PCR技术在DNA片段扩增、基因突变分析、基因表达分析等领 域的应用。
目录
• 分子生物学概述 • 基因与基因组 • DNA复制与修复 • RNA转录与加工 • 蛋白质翻译与修饰 • 基因表达调控 • 分子生物学技术与应用
01 分子生物学概述
分子生物学的定义与发展
分子生物学的定义
在分子水平上研究生物大分子的 结构和功能，以揭示生命现象本 质的科学。
重组DNA技术的应用
阐述重组DNA技术在基因克隆、基因表达、基因治疗等领域的应 用。
重组DNA技术的优缺点
分析重组DNA技术的优点，如高效、精确等，同时也指出其存在 的缺点，如安全性问题等。
PCR技术原理，包括引物设计、DNA聚合酶的作用 等。
PCR技术的应用
基因表达的调控
研究基因表达在时间和空间上的调控机制， 包括转录因子、表观遗传学等。
分子生物学与生物学的关系
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学研究生物大分子的结构和功能，是揭示生命现象本
质的基础科学。
分子生物学推动生物学的发展
02
随着分子生物学理论和技术的不断发展，生物学的研究领域不
断拓宽，研究水平不断提高。
microRNA调控
一类非编码小RNA分子，通过与靶mRNA结合抑制其翻译或促进 其降解来调节基因表达。
基因表达调控的生物学意义
适应环境变化
细胞分化和发育
能量代谢平衡
响应生物和非生物胁迫
基因表达调控使生物能够根据 不同环境条件调整其生理和代 谢状态，以维持生存和繁殖。
在细胞分化和发育过程中，基 因表达调控确保不同类型细胞 具有独特的表型和功能。
列举PCR技术在DNA片段扩增、基因突变分析、基因表达分析等领 域的应用。
高中生物基因工程课件
毒性和提高免疫原性。
基因工程疫苗的应用
03
预防传染病，如乙型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗等，降低人
群发病率。
基因工程抗体
基因工程抗体的种类
包括单克隆抗体、双特异性抗体、人源化抗体等。
基因工程抗体的制备
通过基因工程技术克隆和表达抗体的重链和轻链可变区基因，与适 当的恒定区基因融合，在哺乳动物细胞中表达。
公众参与与透明度
加强公众参与和透明度，促进利益相关方的对话 和协商，共同制定符合各方利益的决策。
3
国际合作与协调
加强国际合作与协调，共同制定国际性的伦理准 则和法律法规，促进全球范围内的公平和平等。
谢谢
THANKS
生物固氮
通过基因工程技术将固氮基因转入植物，提高植 物的固氮能力，减少化肥使用。
生物农药
通过基因工程技术生产具有杀虫、杀菌作用的生 物农药，减少化学农药的使用。
基因编辑技术
利用基因编辑技术如CRISPR-Cas9等对作物进行 精确的基因改造，提高作物的抗逆性和产量。
05 基因工程与环境保护
CHAPTER
生物的遗传性状。
基因工程原理
基因工程基于分子生物学和遗传学 原理，通过改变生物体的基因组， 实现对生物性状的遗传改良。
基因工程操作步骤
基因工程的操作步骤包括基因克隆 、载体构建、受体细胞转化、基因 表达和产物分离纯化等。
基因工程的历史与发展
基因工程的起源
基因工程的未来发展
基因工程起源于20世纪70年代，当时 科学家发现了限制性内切酶和DNA连 接酶，为基因操作提供了工具。
基因工程在土壤修复中的应用
土壤修复是指通过各种手段改善土壤质量，降低土壤污染 对环境和人体健康的影响。基因工程技术可以帮助我们培 育出具有特定功能的植物，用于土壤修复。
分子克隆ppt课件
精选ppt课件
22
重组DNA的筛选与鉴定
重组DNA的筛选与鉴定方法
1 平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 2 限制酶切图谱筛选 3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
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• 平板筛选
是指利用载体的遗传性标记在平板上直接 筛选的方法。具有抗药性标记的载体转化 宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet） 的培养平板上生长；未转化的则不能生长
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长 度仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
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8
λ噬菌体结构
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上 有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把 噬菌体的DNA注入细菌内
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cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半 乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落
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LOGO
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3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
4
有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
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从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
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5
第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件
一条互补DNA，即第一条 DNA链 ， 形 成 RNA- DNA 杂合双链。然后合成第2 条链。
12
13
14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
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n基于EST信息的基因克隆
EST
23
由杨树EST库获得基因序列
PCNA
24
克隆的核酸酶
25
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2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
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菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
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文 库 的 抗 体 筛 选
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(2) T-DNA标签克隆基因
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14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
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n基于EST信息的基因克隆
EST
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由杨树EST库获得基因序列
PCNA
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克隆的核酸酶
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2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
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菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
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文 库 的 抗 体 筛 选
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(2) T-DNA标签克隆基因
《蛋白质工程》课件
生物医学
蛋白质工程可用于研究 和治疗疾病，例如设计 和优化抗体、酶和细胞
因子等。
农业与食品工业
蛋白质工程可用于改良 农作物和食品品质，提
高产量和营养价值。
环保与能源领域
蛋白质工程可用于设计 和优化微生物，以实现 废物处理、生物燃料生
产等目标。
CHAPTER 02
蛋白质的结构与功能
蛋白质的一级结构
重要性
功能域和活性位点是理解蛋白质功能的关键，对蛋白质工程和药物 设计具有重要意义。
影响因素
功能域和活性位点的形成受一级结构、二级结构和高级结构的影响 ，同时与蛋白质与其他分子的相互作用有关。
CHAPTER 03
蛋白质工程的遗传操作
基因突变技术
随机突变
01
通过化学诱变、物理诱变等方法在基因序列中引入随机突变，
定义
蛋白质的二级结构是指局部主链的折叠方式，常见的二级结构包括 α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等。
重要性
二级结构是构成蛋白质三级结构的重要基础，对蛋白质的功能具有 重要影响。
影响因素
二级结构的形成受一级结构的影响，同时与蛋白质所处的环境条件有 关。
蛋白质的高级结构
定义
蛋白质的高级结构是指整条肽链 中不同二级结构的组合方式，包 括蛋白质的构象、亚基聚合方式 以及与其他分子间的相互作用等
通路分析
通过分析蛋白质在生物体内的相互作用网络，揭示其在信号转导、代谢等通路中的作用，为药物研发 和疾病治疗提供靶点。
CHAPTER 05
蛋白质工程的实验技术
蛋白质的分离与纯化
蛋白质的分离与纯化是蛋白质工程实 验技术的关键步骤之一，其目的是将 目标蛋白质从复杂的生物样本中分离 出来，并提高其纯度。