动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择
大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术简介大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(rollerbottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。
第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。
随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
动物细胞大规模培养 ppt
目前, 大规模动物细胞培养中已经普遍使用 无血清培养基, 在此之前使用过天然培养基、 合成培养基。无血清培养基避免了血清培养基 污染的可能性, 并减少了纯化的难度。 但无血 清培养基没有广泛的适应性, 不同的细胞甚至 不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血型培 养基配方。采用无血清培养而诱发细胞凋亡也 成为动物细胞无血清培养技术中急待解决的问 题。在培养基中加入某些化合物, 如金精三羧 酸(ATA )、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等, 在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导 致的细胞凋亡。
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贴壁培养细 胞转瓶机
2、贴壁培养的优点：
●容易更换培养液：细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。 ●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的
目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效 的表达一种产品。
●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。
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三.生物反应器分类
按其培养细胞的方式不同，可分三类：
1.悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中 空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、 气升式反应器； 2.贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微 载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反 应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器； 3.包埋培养用反应器：如流化床反应器、 固化床反应器。
2、共价贴附法: 利用共价键将动物细胞与固相载体结合的 固定化方法称为共价贴附法（attachment by covalent bonding）。此法可减少细胞的泄漏， 但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因 贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。
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动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
(三) 培养基与细胞系
• 动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重 要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清 培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。
• 无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质 量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于 产品纯化等不良影响。
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•动物细胞大规模培养技术
1悬浮培养技术
基本操作 (1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液\ 过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适 宜培养液的培养系统中。传代时按比例 稀释即可继续培养。
•动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
• 对贴壁性•细2微胞载，最体初培采养用技在术培养液中加
人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的 贴壁面积。此方法构造简单，成本低， 重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的 增加。但产率低，劳动强度大，占空间 大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程 度上改变了以上这些不足。微载体是直 径60—250um的微珠。
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• 采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获 得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。 胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果 较好。
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(6)分离细胞：
• 对于回收率要求不高的细胞种类，分组 沉降简单易行。
• 脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液 中分离收集细胞，400r／min，2min离心加速 微载体沉淀。
• 1.病毒疫苗 • 2.非抗体免疫调节剂 • 3.多肽生长因子 • 4.酶类 • 5.激素 • 6.肿瘤特异性抗原 • 7.单克隆抗体 • 8.病毒杀虫剂
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动植物细胞大规模培养
动物细胞大规模培养技术-培养基组成
二、动物细胞培养基组成及制备
1、培养基组成
天然培养基
使用最早，营养成分高，也最为有效。 成分复杂，个体差异大，来源也缺乏，因而使用受到限制。 动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基
合成培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合 成的，具有一定的组成。 它给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标 准化的体外生存环境。 合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、 碳水化合物、无机盐和一些其它辅助性成分。
营养成分 尽管植物细胞能在简单的合成培养基生长，但营养成
分对植物细胞培养和次生代谢产物的生成仍有很大的影响。营养 成分一方面要满足植物细胞的生生长所需，另一方面要使每个细 胞都能合成和积累次生代谢产物。普通的培养基主要是为了促进 细胞生长而设计的，它对次生代谢产物的产生并不一定最合适。
植物细胞大规模培养技术-培养因素
从培养方式来看，动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养， 均可采用分批式、分批补料式、半连续式、连续式等多种培 养方式。从培养系统来看，主要采用中空纤维培养系统和微 载体系统，且以灌注式连续培养方式为佳。
动物细胞大规模培养技术-培养方法
三、动物细胞培养方法和环境要求
2、动物细胞培养的环境要求
影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有细胞生长 的支持物、气体交换、培养温度、pH、渗透压及其它因素等 方面。
一、植物细胞培养基组成及制备
植物细胞培养，不同培养阶段必需采用不同培养基。培养基 主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些 复合物质组成。
碳源
蔗糖或葡萄糖是常用的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可 增加培养细胞的次生代谢产物量。
大规模细胞培养技术的操作方式
大规模细胞培养技术的操作方式规模细胞培养的操作方式可分为：分批式、流加式、半连续式、连续式和灌注式五种。
一、分批式培养（batch culture）分批式培养（batch culture）是细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。
该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:操作简单。
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。
反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；直观反映细胞生长代谢的过程。
因培养期间细胞生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反映细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；可直接放大。
由于培养过程工艺简单，对设备和控制的要求较低，设备的通用性强，反应器参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，在工业化生产中分批式培养操作是传统的、常用的方法，其工业反应器(Genetech)规模可达12000L。
分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。
分批培养的周期时间多在3-5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗劫或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。
收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。
二、流加式培养（feeding culture）1.流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。
蛋白质类药的生物合成与工艺创新
蛋白质类药的生物合成与工艺创新蛋白质类药物是一类重要的治疗性药物，它们通过作用于特定的蛋白质靶点，调节生物体内的生理活性，发挥治疗作用。
与化学药物相比，蛋白质类药物具有更高的靶向性和选择性，因此在治疗许多疾病方面表现出明显的优势。
正确理解和掌握蛋白质类药物的生物合成过程以及工艺创新对于进一步提高药物研发和生产效率具有重要意义。
蛋白质类药物的生物合成是指通过基因表达和翻译过程合成出具有特定生物活性的蛋白质。
首先，研究人员需要通过基因工程手段，将目标蛋白质的基因序列转入适宜的宿主细胞中，例如大肠杆菌、酵母菌或昆虫细胞等。
接着，利用宿主细胞的基因表达和翻译系统，将目标蛋白质的mRNA转录并翻译成蛋白质。
最后，通过纯化和处理等步骤，获取纯度较高的蛋白质类药物。
生物合成蛋白质类药物的关键步骤包括基因克隆、表达优化、翻译调控和纯化工艺等。
首先，在基因克隆过程中，正确选择适合的载体和宿主细胞，并将目标基因成功克隆至载体中，确保基因的稳定传递和高效表达。
其次，通过表达优化，合理设计启动子、信使RNA序列和转录终止子等元件，调控基因的转录活性和稳定性，提高目标蛋白质的表达水平。
同时，选择适宜的表达温度、诱导条件和培养介质等参数，优化蛋白质的合成效率和产量。
蛋白质类药物的翻译调控是生物合成过程中的另一个重要环节。
可以通过改变转译调控序列、调整翻译起始位点以及优化转译复合物组装等策略，提高目标蛋白质的翻译效率和质量。
此外，还可以利用蛋白质工程手段，改变蛋白质的稳定性和溶解性，增强其表达和纯化的可行性。
为了提高蛋白质类药物的纯度和稳定性，对其进行适当的纯化和处理至关重要。
常用的纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析和逆流层析等。
此外，还可以利用一些化学修饰手段，如PEG化、糖基化和聚合物修饰等，改善蛋白质的稳定性和药效。
最终，经过纯化和处理的蛋白质类药物可以进行临床试验和大规模生产，为患者提供有效的治疗手段。
随着生物技术的不断发展，蛋白质类药物的生物合成和工艺创新也取得了长足的进步。
第五章 动物细胞的大规模培养
第一节 动物细胞大规模培养概述
一、动物细胞大规模培养技术的概念
动物细胞大规模培养技术，是在人工条件下（除满足培养过程 必须的营养要求外，还要进行pH和溶氧量的最佳控制），在细胞生 物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品 目前可用于大规模培养的细胞有鸡胚胎、猪肾、CHO、BHK-21 等
微载体的要求：直径大约60-250微米 操作过程：培养初期、贴壁、维持培养、细胞收获、微载体培养的放大 优点：表面积/体积 大，产率高，放大容易，占地空间小 缺点：连续搅拌会损伤微载体表面的细胞
3.固定化培养
（1）吸附培养
（2）包埋培养
海藻酸钙凝胶包埋、琼脂糖凝胶包埋 （3）微囊化培养 是指在无菌条件下将拟培养细胞、生物活性物质以及生长介质共同包裹 在半透膜中形成微囊，在将微囊放入培养体系进行培养 优点：防止细胞损伤 易于后期提纯分离 缺点：操作复杂，成功率低 操作过程： 注意事项：温和、快速不损伤细胞，试剂和膜材料对细胞无伤害，营养物 质和代谢物质自由通过，膜有足够的强度
通常采用搅拌罐式生物反应器、气升式生物反应器
2.贴壁培养
是指细胞贴附在一定的固相表面进行培养
优点是：容易更换培养液 缺点是：扩大培养比较困难
（1）旋转瓶培养法 （2）中空纤维培养 模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管”来培养
（3）细胞工厂培养
（4）微载体培养
是指在培养容器内加入培养液及对细胞无伤害的颗粒，作为为载体
填充式等生物反应器
二、动物细胞大规模培养的应用
1. 生产疫苗
乙型肝炎疫苗
2.生产多肽类和蛋白类药物
白细胞介素-2、生长激素等
3.生产免疫调节剂及单克隆抗体
大规模动物细胞培养问题及对策
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动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择3米力陈志南33(第四军医大学细胞工程中心国家863西安细胞工程基地西安710032摘要目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。
动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。
当前被FDA 批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,工艺设计是流加或灌流培养。
其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的工艺控制手段,规模化培养中氧气的限定与溶解C O 2浓度累积的控制等。
关键词动物细胞大规模培养生产蛋白收稿日期:20032042103国家重大科技专项(2002AA2Z 344133通讯作者,电子信箱:chcerc2@动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。
专家预言:蛋白治疗药物如糖蛋白,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场,预计在下一个10年或20年会有一个更为快速的发展。
蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过目前全世界的生产能力[1]。
由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产工艺的复杂性,大大促进了该技术的深入研究与发展。
80年代初首先兴起了生物反应器研究,许多形式的生物反应器被用于哺乳动物细胞培养工艺的研究,如中置搅拌系统,固定单层培养和中空纤维系统等。
近10年的研究在解决动物细胞大规模培养的关键屏障技术,如限制性氧气的提供,消耗产物的积累,成熟精确的过程控制,剪切力的敏感性,和贴壁细胞培养规模化放大等问题都取得可喜的进展[2]。
目前动物细胞工业化生产中主要致力于提高单位细胞的生产力,确保产品质量和过程工艺设计的一致性,减少工业化生产中的污染与自动化控制等[3]。
以转基因动物和转基因植物为载体的重组蛋白生产在生物制药领域仍具有重要的地位,特别对于每年100kg 的超大规模需求量生产。
目前被美国FDA 批准的生物技术产品和已公开发表的生产工艺,都是较为成熟的工艺,并不代表当前动物细胞研究发展的趋势。
因此动物细胞大规模培养生产蛋白或抗体的工艺选择,应综合考虑产品特点、工艺难度与工艺研发时间,以加速其产品产业化的进程。
以下就目前动物细胞大规模培养成熟工艺与当前研究的问题、对策作一简述。
1目前美国FDA 批准的产品与生产工艺1996年1月至2002年12月美国获得成功批准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种,其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种(美国FDA 网页http :ΠΠw w w.fda.g ov 。
蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳腺癌的Herceptin ,免疫球蛋白肿瘤坏死因子(T NF 受体融合蛋白治疗类风湿性关节炎的Enbrel 和灭活的甲肝疫苗Vaqta 等。
动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术,并逐步形成商业化操作水平。
按技术应用专利的分类,我们将这些产品分为重组治疗药物、疫苗、组织培养产品和诊断试剂并连同他们的生产形式列于表1。
总结表1的数据,在21种产品中有11种产品是用3种主要的细胞系CH O 、SP2Π0、NS O 生产的重组蛋白治疗药物。
首先重组治疗药物,主要是重组蛋白或抗体,对产品应用最有代表性的需要是生产第23卷第7期中国生物工程杂志CHI NA BI OTECH NO LOGY2003年7月表1 B LA哺乳动物细胞培养系统来源产品详细数据a(1996~2000 BLA产品名厂商批准日期产品形式细胞系方法培养液重组蛋白T enecteplaseΠT NK ase急性心肌梗死G enentech6Π2Π00重组糖蛋白CHO无报道无报道抗血友病因子G enetics Institute3Π6Π00重组糖蛋白CHO连续灌流无血清T rastuzumabΠHerceptin转移性乳腺癌G enentech9Π25Π98嵌合抗体CHO搅拌生物反应器,悬浮无血清InfliximabΠRem icadeCrohn’s diseaseC entocor8Π24Π98嵌合抗体NS0搅拌,悬浮灌流培养无血清PalivizumabΠSynagis预防呼吸道病毒M edImmune6Π19Π98嵌合抗体NS0搅拌,悬浮流加培养无血清BasiliximabΠS imulect 预防急性器官排斥N ovartisPharmaceuticals5Π12Π98嵌合抗体鼠骨髓瘤搅拌,悬浮灌流培养无血清DaclizumabΠZ enapax预防急性器官排斥H offman2LaR oche12Π10Π97嵌合抗体SP2Π0无报道无报道Rit uximabΠRituxan淋巴瘤IDEC PharmaceuticalΠG enentech11Π26Π97嵌合抗体CHO搅拌,悬浮培养含庆大酶素C oagulation factorⅨ重组凝集因子G enetics Institute2Π11Π97重组糖蛋白CHO搅拌,悬浮,反复批式培养无血清Interferon21aΠAv onex治疗复杂性硬化Biogen5Π17Π96重组糖蛋白CHO搅拌,悬浮培养无报道疫苗轮状病毒W yeth Laboratories8Π31Π98肝过滤病毒疫苗FRh L22N ot revealed 含胎牛血清狂犬病毒Chiron Behring10Π20Π97灭活狂犬病毒无报道无报道无报道甲肝疫苗M erck&C o3Π29Π96灭活病毒人二倍体纤维母细胞Adherent,NCF to C ostar Cubes连续流加培养含血清组织培养产品自体同源培养chondrocytesΠCarticel软骨缺陷修复G enzyme T issue Repair8Π22Π97自体同源细胞软骨细胞组织培养饼含血清诊断试剂产品人T淋巴细胞病毒用于酶联E LIS A Abbott Laboratories8Π15Π97抗体慢性感染人T、B淋巴细胞无报道无报道Capromab pendetide 肿瘤诊断Cytogen10Π28Π96鼠IgG1杂交瘤中空纤维反应器无血清含牛血清白蛋白,转铁蛋白N ofetum omabΠVerluma肿瘤诊断Dr K arl Thomae8Π20Π96鼠IgG2b Fab抗体杂交瘤无报道无血清Imciromab pentetate心肌诊断Centocor7Π3Π96鼠IgG2Fab抗体杂交瘤无报道血清,含庆大酶素a2000年至今又有7个动物细胞表达的重组蛋白和抗体药物被FDA BLA批准,但因多数无有关工艺的报道,此表未显示产量与质量,其生产形式至少70%是采用搅拌式生物反应器悬浮培养形式,50%以上采用无血清培养;疫苗和组织替代品其产品来源许多不用的细胞系,它需要特殊的生物反应器系统和培养液;虽然用于诊断的产品主要是单克隆抗体,类似于重组治疗,但需求量明显低,这就允许考虑多种特殊的生产形式和生物反应器系统。
因此,目前用哺乳动物细胞大规模培养生产蛋白的工业化过程,可以看作是以搅拌式生物反应器悬浮培养作为通用技术平台,使用常用的3种细胞(CH O、SP2Π0、NS O依托该平台工艺并使其生产能力提高。
平台工艺的特点是采用无血清培养和成熟的流加和灌流工艺。
2目前公开发表工艺的研究目前被批准的生物技术产品以及公开发表的工业化生产工艺,都建立在这个产品进入临床研究之前,因此这些技术不代表当前动物细胞研究发展的趋势,在工业化逐级放大生产过程中有些已体现出一定的滞后问题[3]。
2中国生物工程杂志第23卷当前哺乳动物细胞培养工艺中占有主流优势的是悬浮搅拌式培养工艺,特别是在重组治疗性蛋白和抗体的规模化生产。
在工业化生产中,悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制比其它培养系统较易理解和掌握,因此在规模化动物细胞培养生产中多选择悬浮细胞培养工艺(表1。
M oran等[4]和Schenerman等[5]悬浮流加培养CH O、NS O细胞,在Ⅰ2Ⅲ期临床研究单抗的生产放大中使用了202 452100L生物反应器,工业化生产放大到500220002 10000L,放大过程的工艺性能和产品特点都非常相似。
Sauer等用搅拌式生物反应器,无血清流加培养SP2Π0、NS O细胞生产人源化IgG抗体,工艺优化过程从3L215L2750L直接放大,其细胞密度,特异性抗体产生率和产品质量非常相似。
作者认为一个好的细胞培养平台系统可适用于许多不同重组蛋白或抗体的生产,选择适宜的平台系统可有意义地减少工艺过程所需的时间[6]。
悬浮贴壁细胞培养的传统方法是采用转瓶、堆积床和微载体悬浮培养,转瓶和堆积床培养的放大生产受到很大的限制,悬浮微载体培养是目前疫苗生产常采用的一种形式。
Wiktor等用悬浮微载体培养Vero细胞生产狂犬疫苗,初始工作种子在1L 生物反应器培养,然后是放大至5L225L2150L生物反应器,以后还可在放大到1000L或采用多个150L 的生物反应器,最后有效地感染病毒[7]。
非传统的贴壁细胞培养选用气升式生物反应器、膜透析生物反应器和填充床灌流培养等。
211悬浮细胞培养工艺悬浮培养适于许多细胞培养,如杂交瘤、鼠骨髓瘤(SP2Π0,NS O,对适于贴壁培养的细胞(CH O, BHK可进行细胞生长形式的驯化。
目前已发表的大量文献,就继续深入研究和进一步解释如何提高单位细胞的生产力;如何优化培养环境获得最高的产量,同时保持最好的产品质量;如何去除培养液中动物来源的成分,使大规模生产中的污染最小化;如何控制培养过程中的C O2的积累等进行了论述。
在大规模细胞培养中,细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的最大障碍,由于在悬浮培养工艺中,细胞的死亡主要是因凋亡所致。
通过导入凋亡抑制基因(Bcl22来调节细胞抗凋亡的机制,延长细胞生存时间,促细胞活力和增加抗体的产量[8]。
悬浮培养工艺中影响细胞生产数量和质量的因素,主要应考虑细胞培养环境(营养条件、产物积累、pH、温度和渗透压,终产物(乳酸和氨毒性累积和必需营养物的添加等。
设计适应细胞生长的无血清培养基,控制营养物的添加,减少产物消耗积累是解决问题的有效手段。
1996年X ie等[9]运用化学计量法,根据动物细胞生长的需求,设计定量添加浓缩的培养液,将葡萄糖、谷氨酰氨的浓度维持在一个低水平,以改变细胞代谢方式。
在杂交瘤细胞流加培养周期超过550h,比较一般流加工艺特异性乳酸生成率减少了4倍,特异性氨生成率减少了10倍,细胞密度5×107Πml,峰值的活细胞密度大于115×107Πml,抗体累积浓度为214mgΠml[10]。