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crispr cas9原理简介
crispr cas9原理简介CRISPR-Cas9基因编辑技术，是一种通过靶向剪切基因组中特定DNA序列的方法。
该技术最初源自一种天然的细菌免疫系统，可用于编辑生物体的基因组。
CRISPR（簇状规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是细菌和古细菌基因组中的一种特殊DNA序列，以重复、间隔和短回文特点而命名。
CRISPR序列常常与Cas（CRISPR-associated protein）基因一起出现，这些Cas基因编码一类能够识别并修剪DNA的酶。
CRISPR-Cas系统中最常用的是Cas9酶，它是通过向CRISPR-Cas9复合物中引入特定的RNA分子来实现DNA靶向。
这种RNA分子称为单导RNA（sgRNA），它是一种具有20个核苷酸的短链RNA，结合了用于指引Cas9定位到特定目标序列的脱氧核苷酸。
sgRNA与Cas9酶形成复合物后，可以通过碱基互补配对与基因组DNA中的目标序列结合。
当sgRNA与Cas9复合物与目标DNA序列配对时，Cas9酶便会被激活并剪切其靶向序列。
这一过程引发DNA修复机制，使得目标序列得以重组或删除。
如果提供了外源DNA修复模板，修复机制还可以将该模板中的DNA片段插入到被剪切的部分，实现想要的基因修饰。
CRISPR-Cas9技术的优势在于其简单性和高效性。
相较于传统的基因编辑技术，CRISPR-Cas9可以更加准确地指定目标序列，并在短时间内完成基因组的编辑。
它已被广泛应用于基础科学研究、生物医学研究以及农业领域，为基因治疗和作物改良等领域带来了突破性的进展。
CRISPR-Cas9技术的发展与应用
普通生物学课程论文论文题目：CRISPR-Cas9技术的发展与应用姓名李沛哲专业班级：草业科学1702学院：动物科技学院学号：2017046402018年6月目录1．研究背景 (3)2.CRISPR的发展历程 (4)3．CRISPR的工作原理 (5)4．CRISPR/Cas9技术在疾病研究中的应用 (6)5．Cas9的应用优势 (7)6. 存在的问题 (7)7.展望 (8)【摘要】：CRISPR/ Cas9是一种用于靶向特定基因的DNA修饰工具，产生于细菌和古细菌，是一种适应性免疫系统，就像文字纠错软件，可以检测到病毒DNA并将其消灭并修复。
经过不断发展，已有多个物种应用这一系统用于研究，还可能将应用于基因编辑的科研、临床治疗等，现已证明CRISPR/ Cas9技术拥有一定优势，比如设计简单，操作容易，但是背后还存在道德伦理问题，以及该技术本身存在的问题如脱靶效应。
【关键词】：CRISPR/ Cas9 基因编辑疾病治疗免疫防御1．研究背景20世纪70年代DNA重组技术开始发展，这标志着生物学进入了一个新阶段。
分子生物学家第一次获得了操纵DNA分子的能力，使研究基因和利用它们开发新的药物和生物技术成为可能。
广义来说，基因组工程指的是对基因组进行有针对性的修改、其上下片段(如表观遗传标记)或其输出(如转录本)的过程。
在真核生物中，特别是在哺乳动物细胞中能够十分容易且有效地做到这一点，对改变基础科学、生物技术和医学有着巨大的作用生物的遗传信息储存在基因中，蛋白质是由编码基因决定的。
基因突变时，其编码的蛋白质的氨基酸组成也会改变，有些蛋白质会提前终止翻译，遗传疾病就会发生。
特异性的修饰基因组靶点，可以用来治疗遗传病，人们研究修饰位点时，在细菌和古细菌中找到了某种RNA，它可以用来标记位点，命名为gRNA。
CRISPR/Cas9蛋白和gRNA彼此之间相互作用，使得切割都发生在正确的位置。
CRISPR/ Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种用于靶向基因特定DNA修饰的工具，细菌在其成长环境中需要不断对抗病毒，CRISPR指的是一种适应性免疫系统，其产生于细菌和古细菌，它们为了应对病毒的攻击而逐渐进化，产生了这种系统，在CRISPR作用之下，可以检测到病毒的DNA并将其消灭，该机制中，Cas9是一种蛋白质，作用是寻找并切断病毒的DNA，使其降解，crRNA（CRISPR- derived RNA）与tracrRNA（trans- activating RNA）会结合形成一种复合物，该复合物能特异性识别靶基因序列，引导Cas9核酸内切酶在定位点将双链DNA剪断，然后，其非同源末端与修复机制相连接，将重新连上断裂处的基因组DNA，精准插入特定的DNA片段，这就是说，假如能够造成双链断裂，则可以诱发细胞进行修复，方式为干预或融入新基因，另外还有一种修饰DNA的方法即将外源DNA的一个片段整合进断裂处。
CRISPR-Cas9技术的发展与应用
CRISPR-Cas9技术的发展与应用CRISPR/Cas9技术的发展与应用Zujia.W摘要：成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas)技术是近两年出现的一种定点基因组编辑新工具，具有灵活、高效、廉价且易于操作等优点。
这种新的基因编辑工具的出现，为基因功能、疾病分子机制的研究带来了便利,并且在研究和使用过程中不断创新发展，扩大了其应用范围。
关键词：成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白基因编辑转录调控基因治疗ABSTRACT: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated proteins (CRISPR/Cas) has been developed as a new targeted genome editing tool since the last 2 years. Because it's flexible, efficient, cheap and easy to operate, it quickly surpass the previous technologies to become the hottest genome editing tool.The emergence of this new gene editing tool have brought great convenience for researcher in gene function, molecular mechanisms ofdisease.In the process of research and use,this technology is going through continuous innovation and development, expanding its scope of application.Key words: CRISPR/Cas genome edting transcription regulation gene therapy基因编辑技术指采用一定的方法技术对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的的突变，敲除、插入等改变。
cas9原理
cas9原理CRISPR-Cas9是一种基因组编辑技术，其原理是利用一种来源于细菌的DNA切割酶Cas9，与CRISPR序列相结合，对特定基因组区域进行精确的编辑。
CRISPR序列是在细菌和古细菌中发现的一种特殊的基因组片段，其中包含一系列重复的DNA序列和间隔序列。
这些序列在细菌中起到了抵御病毒侵袭的作用。
CRISPR-Cas9系统的工作过程如下：1. 选择目标基因组区域：科学家首先选择需要编辑的基因组区域，并设计与该区域相互匹配的引导RNA（gRNA）。
2. Cas9与gRNA结合：引导RNA（gRNA）能够与Cas9酶相结合，形成一个复合物。
在这个复合物中，gRNA通过碱基配对与目标基因组区域的DNA序列相互匹配。
3. DNA切割：一旦形成复合物，Cas9酶就会识别并切割目标DNA序列。
这种切割过程会导致基因组中的一种修复机制介入。
4. DNA修复：基因组修复机制可以通过两种方式修复被切割的DNA。
一种是非同源末端连接（NHEJ），通过将两端连接在一起并随机插入或删除核苷酸来修复断裂的DNA。
另一种是同源重组（HDR），该过程依赖于一个外源DNA模板，使得在特定位点产生精确的修复。
5. 基因组编辑：经过修复后，目标基因组区域可以被编辑，例如插入、删除或修改特定的DNA序列。
6. 表达变化：修复后的基因组区域将会在细胞分裂和繁殖过程中被遗传给后代细胞，从而实现在整个生物体中引入新的基因组变化。
总的来说，CRISPR-Cas9利用Cas9酶与gRNA的复合物来导向特定的基因组区域，并通过切割和修复机制，实现对基因组的精确编辑。
这使得研究人员能够研究基因功能、治疗遗传性疾病以及开发创新的生物技术应用。
CRISPR基因编辑技术及其应用前景
CRISPR基因编辑技术及其应用前景生物科技领域日新月异，全球科学家们也在不断探索新的方法和技术，以期达到更好的治疗效果和使人类健康更有保障的目的。
CRISPR-Cas9是近年来在基因编辑领域中出现的最重要的技术之一，因其独特的特性和通用的使用性已经在许多领域得到了广泛的应用。
本文将介绍CRISPR-Cas9技术的原理、应用和未来发展方向。
1. CRISPR-Cas9技术的原理CRISPR基因编辑技术是通过改变生物体中的DNA序列来修改其基因表达的方式。
其核心组成部分是Cas9蛋白和RNA分子。
Cas9是一种蛋白质酶，而RNA分子则用于识别目的DNA序列。
通常，在实验室中，研究人员会将CRISPR-Cas9系统导入细胞中，继而使用特定的酶来剪断细胞中特定位置的DNA序列。
一旦DNA序列被剪断，细胞会自然地寻找一种方式来修复其自身的DNA。
2. CRISPR-Cas9技术的应用CRISPR-Cas9技术已经被应用于人和动物体内的基因编辑、疾病治疗和植物的基因改良等方面，是目前各种基因编辑技术中最受欢迎的一种。
其应用前景可谓无限。
下面，我们详细介绍CRISPR-Cas9技术在人类医学领域、农业领域和环境领域的应用。
2.1 人类医学领域CRISPR-Cas9技术已经被用于治疗因基因突变引起的一些疾病，如克隆氏症等遗传病。
研究人员还已经开始使用这种技术治疗某些因感染导致的疾病，如HPV等。
此外，CRISPR-Cas9技术还可以用于自体细胞治疗和癌症治疗等方面。
2.2 农业领域在农业领域，CRISPR-Cas9技术也被广泛应用，用于植物基因改良。
例如，该技术可以用来增加植物的耐旱性、增加产量和防止病害等。
2.3 环境领域在环境领域，CRISPR-Cas9技术可以用于改变某些细菌的遗传元素，以分解有毒物质或净化自然环境。
3. CRISPR-Cas9技术未来的发展方向CRISPR-Cas9技术无疑是目前基因编辑领域中最重要的技术之一，未来的发展方向也备受关注。
CRISPRCas9的应用及脱靶效应研究进展
CRISPRCas9的应用及脱靶效应研究进展一、本文概述CRISPR-Cas9是一种基于细菌防御机制的基因编辑技术，自其问世以来，已经在生物学、医学等多个领域产生了深远的影响。
本文旨在全面概述CRISPR-Cas9技术的应用现状以及脱靶效应的研究进展。
我们将首先介绍CRISPR-Cas9技术的基本原理及其在基因编辑、疾病治疗、农业生物技术等领域的广泛应用。
随后，我们将重点关注CRISPR-Cas9技术中的脱靶效应问题，探讨其产生机制、影响因素以及目前的检测与防控策略。
通过综述最新的研究成果，我们希望为相关领域的研究者提供有价值的参考，推动CRISPR-Cas9技术的安全、高效应用。
二、CRISPR-Cas9的应用CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，已经在众多领域展现了广阔的应用前景。
自从其问世以来，科学家们已经在基因组编辑、基因功能研究、疾病治疗、农业生物技术以及药物开发等多个领域取得了令人瞩目的成果。
在基因组编辑方面，CRISPR-Cas9系统提供了一种精确、高效且相对简单的手段来修改生物体的基因组。
通过设计特定的sgRNA，研究人员可以精确地定位到目标DNA序列，并利用Cas9蛋白的切割活性在特定位置造成双链断裂。
随后，细胞内的DNA修复机制将介入修复这些断裂，从而导致目标基因的突变或删除。
这种技术已经被广泛应用于各种生物体，包括人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇、植物等。
在基因功能研究方面，CRISPR-Cas9系统提供了一种高通量的方法来研究基因的功能。
通过构建基因敲除或敲入的细胞系或动物模型，研究人员可以系统地研究特定基因在生物体发育、生理和疾病过程中的作用。
CRISPR-Cas9还可以用于研究基因间的相互作用以及基因调控网络。
在疾病治疗方面，CRISPR-Cas9系统为遗传性疾病的治疗提供了新的希望。
通过纠正致病基因中的突变或删除致病基因，CRISPR-Cas9有可能根治许多遗传性疾病，如囊性纤维化、镰状细胞贫血、杜氏肌营养不良症等。
CRISPR-Cas9文库技术原理及应用
CRISPR-Cas9文库技术原理及应用CRISPR-Cas9技术原理CRISPR-Cas9技术凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR-Cas9技术迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。
CRISPR-Cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现，是细菌中抵抗外源病毒的免疫系统。
CRISPR-Cas9系统由两部分组成，一部分是用来识别靶基因组的，长度为20bp左右的sgRNA 序列，另外一部分是存在于CRISPR位点附近的双链DNA核酸酶——Cas9，能在sgRNA的引导下对靶位点进行切割，最终通过细胞内的非同源性末端连接机制（NHEJ）和同源重组修复机制（HDR）对形成断裂的DNA进行修复，从而形成基因的敲除和插入，最终实现基因的（定向）编辑。
与前两代技术相比，CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑，更重要的是可以同时对多个基因进行编辑，这也为全基因组筛选提供了有效的方法。
目前比较常见的文库类型包括：●CRISPR-Cas9 knock out文库●CRISPR panal文库●CRISPRa/i文库●psgRNA文库CRISPR-Cas9文库建库流程●靶位点确认及sgRNA文库设计●sgRNA文库芯片合成●sgRNA文库构建●QC验证文库质量●sgRNA文库慢病毒包装●感染稳定细胞株●药物筛选实验●细胞表型筛选●NGS测序验证功能基因CRISPR-Cas9文库应用方向1、药物靶点确定与验证CRISPR-Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中，通过大规模筛选技术，可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因，从而为疾病治疗提供相关数据。
SCIENCE发表文章[1]，研究人员利用CRISPR-Cas9文库筛选人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。
cas9的原理与应用
CAS9的原理与应用1. CAS9基本概述CRISPR-associated protein 9（CRISPR相关蛋白9，CAS9）是一种常见的基因编辑工具，是细菌免疫系统中发现的一种蛋白质。
CAS9通过结合特定的DNA序列，进行DNA切割和编辑，从而实现基因组的改变。
2. CAS9的工作原理CAS9的工作原理主要包括以下几个环节：2.1 CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种具有免疫功能的细菌防御系统。
该系统通过识别并消灭外来DNA，以保护细菌免受外部威胁。
CAS9是CRISPR-Cas9系统中的核心组分之一。
2.2 gRNA的设计gRNA（guide RNA）是CAS9工作的关键。
它是一条RNA序列，能够与目标DNA序列特异性结合。
通过设计合适的gRNA，可以指导CAS9与目标DNA序列结合，从而实现基因组的改变。
2.3 CAS9的结构与功能CAS9蛋白质是CRISPR-Cas9系统的核心酶，在基因编辑中发挥关键作用。
CAS9蛋白质由多个结构域组成，其中包含一个与gRNA结合的RNA导向结构域和一个具有核酸酶活性的核酸结合结构域。
通过这两个结构域的配合，CAS9能够在靶位点附近识别并切割目标DNA。
2.4 CAS9的DNA切割与修复CAS9蛋白质通过与gRNA配对，生成一个CAS9-gRNA复合物。
该复合物能够识别并结合目标DNA序列，从而形成一个基因座。
之后，CAS9通过其核酸酶活性，切割目标DNA序列。
这样一来，细胞中的修复机制会介入，通过非同源末端连接(Non-homologous end joining)或同源重组修复(Homology-directed repair)等方式修复DNA。
3. CAS9的应用领域CAS9的应用非常广泛，已经成为现代生物技术中的重要工具。
以下是CAS9的主要应用领域： - 基因治疗: CAS9可以用于修复产生基因突变的遗传病，甚至可以用于治疗某些癌症等疾病。
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2 CRISPR-Cas系统靶向要求
最主要的要求： PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。
2 CRISPR-Cas系统靶向要求
在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。
2 CRISPR-Cas系统靶向要求
3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰
3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换
2013以后，研究者们在包括《science》和《nature biotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas 系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确 的基因修饰。
1 CRISPR-Cas概述
CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas 蛋白对靶向基因进行修饰的技术。
3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换
3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰
2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的 《efficient genome editing in zebra fish using a CRISPRCas system》一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导 Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。
Le C, F Ann R, David C, et al. 2013, Science, (6121):819-823.
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Models generated by CRISPR/Cas9 system
Dumpier nematodes
Zebrafish embryos
Fruit flies
Monkey
最详细：CRISPR-Cas9系统原 理应用及发展
1
中山大学生命科学学院
1 基因修饰的方法 与各自优势
质粒- 瞬时转染 - 某些细胞效率偏低 - 表达结果不稳定，有 内源表达的干扰； 质粒- 稳定细胞 - 表达结果不稳定，筛选效率不高，在重组 插入基因组中可能干扰其它基因表达； 病毒- 瞬时感染 - 表达结果不稳定，质粒容易在细胞复制过 程中丢失，随机插入基因组中可能会干扰其它基因表达； 新一代的基因编辑技术- 利用重组酶在基因组水平修饰基 因，产生的遗传性质稳定，直接作用于内源，减少表达干扰， 目前有成熟的技术如CRISPR/Cas9；
DNA修复的机制与 基因编辑原理
NHEJ and HDR
DNA
DNA sequence disrupted
+donor DNA
DNA sequence replaced
NHEJ: Non-homologous end joining
非同源性末端接合修复机制(Nonhomologous end joining, NHEJ)
1 CRISPR-Cas概述
CRISPR-Ca
CRISPR： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）
CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于 细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守 的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR 就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。
2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的 《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系 统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向 修饰。
2 CRISPR-Cas系统的发现
2 CRISPR-Cas系统的发现
2 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免 疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主 防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细 菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥 是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间 隔序列（spacer）来实现的。
HDR: homology directed repair
同源介导的修复机制(Homologydirected repair, HDR)
ZFN与TALEN基因 编辑原理
ZFN and TALEN
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Genome Editing in Mammalian Cells
I: Genome modification II: Genomic deletion
Rice
Pennisi E. 2013. Science, (6148):833-6.
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1 CRISPR-Cas概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌 编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时， 发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA 片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的 两端还存在一段不太长的特有的序列。
3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰
3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰
3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰
Cas9
sg-RNA
3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰
2013年2月15日在《science》上发表的《Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems》一文 中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的 crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。
1.1 CRISPR结构
1.2 Cas家族
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在
guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
2 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统， 通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进 行切割，从而达到对自身的免疫。