单抗制备常见问题分析
抗体纯化常见问题回答
用户园地Q & A30鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相互作用，使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体纯化提供很好的解决方案。
然而要得到高质量高纯度的抗体，需要我们从样品处理，纯化介质的选择以及纯化方法上悉心考虑，这里我们就这些大家常见的问题来讨论。
1，对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品，有哪些样品处理的方法？在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿命。
对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂蛋白，酚红，小分子污染物等等。
腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。
方法一是在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球蛋白。
很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。
酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。
对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。
最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，把样品换到合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分子。
更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。
2，实验室需要纯化小鼠的IgG1，我是选择ProteinG还是ProteinA？首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强度”表（图1）来获取选择哪种配基的指导，针对小鼠的IgG1， ProteinA结合相对弱，可以选择ProteinG配基的介质。
但由于Protein G结合力较强，因此有时需要pH低于2.0才能有效洗脱，容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。
浅析单抗原液的生产工艺
浅析单抗原液的生产工艺单抗即单克隆抗体，是通过将抗原注入到宿主动物体内启动机体免疫应答而产生的。
单抗药物在病毒性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤及烈性传染病的防治领域有着突出的作用。
单抗都是采用哺乳动物细胞进行表达，主要以中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）为主。
在抗体纯化过程中除了要考虑回收率和纯度以外，还需有效的灭活和清除病毒。
单抗原液车间生产的原液不适用热力灭菌工艺，通常选择无菌操作的非最终灭菌生产工艺。
单抗生产中病毒污染风险：CHO细胞系是制造许多治疗性蛋白质的主力。
CHO细胞的生物安全等级为一级，CHO本身存在内源性逆转录病毒，这是已经被证实了的，但这种病毒对人类不具有致病性。
从药物质量安全角度出发，遵循SFDA 公布的《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》，加入病毒去除和灭活方法。
此外，基于哺乳动物细胞进行的培养发酵，产品被病毒污染是考虑的主要生产风险之一。
病毒污染的其他潜在来源可能还有：使用已经被污染了的主细胞种子库或工作细胞种子库；操作员可能带进病毒，污染工艺；细胞线残留上一级仍有活力的病毒。
因为哺乳动物细胞为带入的病毒污染物提供了合适的宿主细胞，因此病毒量可能会随着细胞培养而放大，进而可能增加生产过程的整体风险。
单克隆抗体药品生产通常包含四个模块：上游培养、下游纯化、分析质控和制剂。
单抗的生产工艺：单抗原液的生产工艺主要概括为两个阶段：上游细胞的培养、发酵和下游的纯化。
细胞种子经摇瓶、WAVE反应器、一、二、三级种子培养扩增后进入发酵罐进行发酵培养。
发酵结束后经离心机进入下游进行纯化。
离心后的料液经过层析、超滤后变成原液。
具体的工艺流程描述如下：（1）细胞复苏：细胞复苏和冻存讲究“慢冻快溶”，复苏时一定要将冻存在液氮或-80℃中凝固的细胞冻存液快速融化至37℃，使胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
（2）细胞传代培养：①悬浮细胞培养：是指细胞在培养液中呈悬浮状态进行生长繁殖，能连续培养和连续收获的培养技术。
抗体亚型鉴定常见问题解析
抗体亚型鉴定常见问题解析一、单抗亚型鉴定(亚型,单抗,腹水,阳性克隆)筛选出阳性克隆后，制备了腹水，可是鉴定亚型的时候，发现亚型不纯，有好几种，不知道是什么原因。
亚型鉴定选用的是SBA的亚型分选试剂盒。
腹水没有纯化，离心后直接测得。
请大家帮我分析一下是什么原因？答：你要测亚型必须用细胞培养上清或者是纯化后的抗体，绝对不能用腹水：腹水的成分很杂，包含小鼠本身的IgG。
另外还有可能是你的细胞株本身就不是单克隆，SBA的亚型试剂盒我没有用过，我用过sigma的是ELisa方法测定亚型，很不好用。
用serotec试纸条或bethly免疫扩散效果很好；HBT的试纸条也不错，操作简单，2-3小时搞定，推荐用细胞上清来检测，不易出现多亚型误检。
缺点是价格偏高；谢谢了。
从大家的分析来看亚型不纯由以下原因产生：1.腹水需要纯化后再测亚型。
2.单克隆筛选不纯。
二、单抗亚型鉴定为何全部是IgM在小鼠免疫阶段，是按照经典方法进行免疫的：经过基础免疫，三次加强免疫（间隔三周），小鼠效价达到1：12800以上，末次冲击免疫三天后，取脾细胞与SP2/0细胞融合，然后根据间接ELISA检测效价上清结果和有限稀释法进行筛选和亚克隆，其中的酶标二抗用的是辣根酶标记的羊抗鼠IgG（Fc片段），三轮亚克隆后得到五铢全阳株，可是经过取他们的细胞上清进行亚型鉴定结果全是IgM。
并且最近师兄们做的其他抗原筛选到的单抗，经过腹水鉴定也全是IgM。
不知道原因何在。
请院子里的战友指点迷津：1.在制备单抗过程中，如何能最大限度的制得IgG型单抗，影响其为IgM的因素都有哪些？？如果说免疫方法和筛选阶段所用的酶标二抗有最大影响的话：我上面的免疫程序和用的酶标二抗都是朝着IgG而设计的。
2.在进行亚型鉴定过程中，在对单抗株细胞上清进行浓缩的时候，会不会也将细胞上清中的小牛血清也进行了同等的浓缩，10% 的小牛血清和1～5mg/L的单抗浓度相比，在鉴定亚型过程中有没有可能只是鉴定出来了小牛血清中的各种抗体亚型？？3.能否请有志之士给出亚型鉴定两种方法（ELISA和免疫双扩）的详细步骤（经过实践证明了得，可行的）？？例如：在免疫双扩的时候上清中抗体浓度应该在什么范围之内？？而腹水浓度又应该设在什么范围之内？？4.请大家给推荐几个性价比高的鉴定亚型的试剂盒。
WB问题分析
WesternBlot问题解答1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。
2.条带歪斜、或漂移:因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。
当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。
使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。
另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。
3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。
做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。
同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。
气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。
4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高,转膜过程中注意降温。
在冰水混合物中转膜，效果很好。
5背景过高:1）封闭不全， 5%脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。
如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。
2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。
这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。
如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决 3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。
4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。
那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。
5)曝光时间的控制:通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。
如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。
单抗配制过程护士要注意事项_概述说明
单抗配制过程护士要注意事项概述说明1. 引言1.1 概述本文旨在概述单抗配制过程中护士需要注意的事项。
随着单克隆抗体治疗的普及，单抗配制成为了临床工作中不可或缺的环节。
正确而规范地完成单抗配制过程对于确保治疗效果、保证患者安全至关重要。
因此，本文将介绍在单抗配制过程中，护士应该关注和遵循的几个主要方面。
1.2 文章结构本文按以下几个部分进行阐述：引言、单抗配制过程护士要注意事项、警示和风险提示、术语解释与常见问题解答以及结论。
通过这些部分的详细介绍，读者将能够全面了解在单抗配制过程中所需遵循的步骤、注意事项和相关知识。
1.3 目的本文旨在提供给从事临床工作的医务人员参考，特别是与单克隆抗体治疗有关的护士。
通过详细描述单抗配制过程中需要注意和遵循的各个方面，我们的目标是帮助他们更好地理解并正确执行单抗配制工作，提高临床操作的准确性和安全性。
以上为“1. 引言”部分内容。
2. 单抗配制过程护士要注意事项:2.1 确认患者信息和医嘱:在开始单抗配制之前，护士必须仔细核对患者的个人信息，包括姓名、年龄、性别等，并与医嘱进行一致性确认。
确保所使用的单抗是给予正确的患者，并且符合医生指示。
2.2 准备工作环境和材料:在开始单抗配制之前，护士需要确保工作环境整洁无菌。
清理工作台面并使用消毒剂对其进行消毒。
同时，检查所有所需材料是否齐全并处于有效期内，包括注射器、针头、试剂、溶剂等。
2.3 配置单抗的步骤与规范操作:以下是配置单抗的步骤和规范操作：1) 准备好所有需要用到的药物及溶液。
2) 戴上手套和口罩以确保个人卫生，并避免污染药品。
3) 按照医嘱中规定的剂量准确称量所需药物。
4) 将溶剂转移到药品瓶中，并轻轻摇动使其充分溶解。
5) 将药品抽取并注入空白的注射器中。
6) 顺利进行专用贴纸（标签）的填写以确保能够识别瓶上的药物信息。
7) 在专门的装满可回收容器中丢弃废弃物和使用过的药品容器。
请注意，以上步骤只是一个基本的示例，并且应根据实际情况和医生指示进行调整。
贝伐单抗注射液批生产工艺设计与验证
贝伐单抗注射液批生产工艺设计与验证贝伐单抗（Bevacizumab）注射液是一种抗肿瘤药物，广泛应用于多种癌症的治疗。
本文将根据提供的任务名称，详细介绍贝伐单抗注射液的批生产工艺设计与验证。
一、贝伐单抗注射液的成分和性质贝伐单抗注射液主要成分为贝伐单抗（Bevacizumab），它是一种嵌合的人源单克隆抗体。
贝伐单抗结构稳定，药理作用和安全性良好。
通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）的活性，贝伐单抗能够抑制肿瘤血管生长，从而达到抗肿瘤的治疗效果。
二、贝伐单抗注射液的批生产工艺设计1. 前处理与准备贝伐单抗的原料需要经过悬浮培养、纯化和过滤等步骤进行前处理。
培养过程中，需要合理调节培养基的组成和条件，确保贝伐单抗的表达和纯化效果。
纯化过程中常采用蛋白A亲和层析技术，以去除其他杂质。
2. 形成复合物贝伐单抗通过与VEGF结合来发挥治疗作用，因此在生产过程中需要与VEGF 进行复合反应。
复合反应的条件需控制在适宜的pH值和温度下进行，以保证复合物的稳定性。
3. 灭菌处理贝伐单抗注射液作为一种无菌制剂，需进行灭菌处理。
灭菌方法通常采用高温高压灭菌法，如蒸汽灭菌或高压灭菌。
灭菌过程需考虑到产品的稳定性和设备的操作性。
4. 填充与包装灭菌处理后的贝伐单抗注射液，需要进行填充与包装。
填充过程中需要遵循无菌原则，采取适当的容器和包装材料，并确保严密密封，以保持药物的质量和稳定性。
三、贝伐单抗注射液批生产工艺的验证1. 工艺验证工艺验证是为了确认工艺过程能够稳定可靠地生产出符合质量标准的产品。
验证过程中，应验证关键工艺参数的可接受范围，如培养条件、纯化效率、复合反应的条件等。
同时需要对工艺中的关键步骤进行确认，确保产品的稳定性和一致性。
2. 清洁验证贝伐单抗注射液的生产设备需要进行清洁验证，以确保设备在不同批次间的清洁程度。
清洁验证应采用适当的方法和指标，如残留物检测和微生物检测等。
3. 稳定性验证贝伐单抗注射液的稳定性验证是为了确认产品在储存和运输过程中的稳定性。
单抗制备技术近十年来进展
说了这么多，还是很沮丧，虽然看起来选择很多，但是能真正用到工作中的选择并不多，有时候是条件问题，有时候则是成本和精力问题。第一个话题就写这么多吧。
动物免疫
动物免疫故事比较多，简单点说。
实验动物的选择： 做单抗的动物最开始是小鼠，后来又有像epitomics这样的公司用兔子的，还有一些人用大鼠神马的，当然其它的动物的也有，据不完全统计，现在能用传统方法制备单抗的动物已经有二三十种了。 但是最主流的还是小鼠和兔子了。兔子不讨论，epitomics对其有特殊的专利，这个基本上和咱们没关系。小鼠，用得最多的还是Balb/C了，因为大多数骨髓瘤细胞（SP2/0, X63, Ag8.653,FO和NSO）都来自于Balb/C小鼠，为了使hybridomas稳定，所以实验小鼠基本上还是Balb/C。 不过有文献提到了用NZB/W小鼠制备高同源性单抗的，原因是NZB/W小鼠是一种容易发生自身免疫疾病的小鼠模型，一般在5个月以下时基本不会发病，但是对自身的蛋白仍然有潜在的排斥反应。
另外还有体外免疫的，即把脾脏从正常小鼠体内取出无菌培养，直接向培养基中添加抗原。 这种方法成功例子也非常多，毛病在于很难得到高亲和力的抗体，几乎所有的抗体都是IgM亚型的，不过也有少数人踩狗屎运得到其它亚型的情况。这种免疫方式可能更多地用于很难免疫成功的抗原，特别是小鼠自身抗原的单抗的制备，比如说要制备抗小鼠白蛋白的单抗神马的，可以看看这篇文章：In vitro immunization effect of growth and differentiation factors on antigen-specific b cell activation and production of monoclonal antibodies to autologous antigens and weak immunogen。只当是一种备用方案了。
单克隆抗体生产过程中的杂质去除技术之现状与展望
单克隆抗体生产过程中的杂质去除技术之现状与展望生物制剂在临床治疗和商业上的成功，推动了全球对生物产能的巨大需求。
生物制剂上游产能已经得到显著提升，但同时也给下游去杂和纯化过程造成障碍，开发高通量去杂和纯化技术成为新的瓶颈。
细胞培养环境的多样性使得制品中的杂质复杂多样，痕量的杂质残留都会在人体产生严重的免疫反应，因此必须使制品所含杂质的成分和浓度控制在制品的质量要求之下。
制品中的杂质主要由两部分组成，一种与制品本身相关，另一种由生产过程中带入。
与制品相关的杂质包含制品组分的多聚体、降解产物、错误翻译产物等；生产过程中带入的杂质包括残留的细胞组分、添加剂、培养基等。
其中宿主细胞蛋白质（HCPs）和核酸（DNA）是最主要的杂质。
杂质去除始于制品纯化的初始阶段，以减轻下游纯化的负担，也有利于保护下游纯化设备、提高纯化效率。
所使用去杂技术的的适用性、去杂效率、运行成本等都需要纳入考虑范畴。
本文主要介绍三种去杂技术：沉淀、絮凝和深层过滤。
沉淀技术沉淀技术长期用于血浆蛋白纯化、抗体分离和富集，通过降低目标组分的溶解度实现。
沉淀极大浓缩产物，实现溶剂置换。
改变培养液pH、电导率和加入沉淀剂等可选择性地改变沉淀对象。
改变细胞培养液pH，尤以使培养液pH低于杂质等电点，可有效地去除HCPs和DNA。
沉淀剂是一类低溶解度物质。
沉淀剂破坏胶体的平衡状态，触发沉淀。
降低培养液pH与沉淀剂共同作用，低pH条件进一步降低沉淀剂的溶解度从而引起共沉淀。
辛酸及其钠盐用于沉淀血浆、血清和腹水蛋白质。
酸性条件下，酸性蛋白质（如HCPs）被沉淀，偏碱性的抗体保持溶解状态。
有研究发现，辛酸对抗体的纯化效果优于抗体片段（FC片段），可能由于抗体的疏水基团包裹于内。
辛酸破坏包膜病毒的脂质层，使病毒失活，但对非包膜病毒效果不明显。
有机溶剂通过分步沉淀达到纯化混合蛋白质的目的。
但高浓度的有机溶剂引起蛋白质变性，其疏水基作用产生的高温同样使蛋白质变性。