第二代测序数据分析原理PPT课件
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第二代测序技术ppt课件
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
454 (GS-FLX)
▪ Roche：（2005，2007，2008）
▪ 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
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454 (GS-FLX)流程
▪ 包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
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SOLiD流程
▪ 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
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454 (GS-FLX)
▪ Roche：（2005，2007，2008）
▪ 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
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454 (GS-FLX)流程
▪ 包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
SOLiD流程
▪ 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
第二代测序原理及过程 共20页PPT资料
Next-Generation DNA Sequencing Methods
The Roche/454 FLX
454/enablingtechnology/the-system.asp
The method used by the Roche/454 sequencer to amplify single-stranded DNA copies from a fragment library on agarose beads. A mixture of DNA fragments with agarose beads containing complementary oligonucleotides to the adapters at the fragment ends are mixed in an approximately 1:1 ratio. The mixture is encapsulated by vigorous vortexing into aqueous micelles that contain PCR reactants surrounded by oil and pipetted into a 96-well microtiter plate for PCR amplification. The resulting beads are decorated with approximately 1 million copies of the original single-stranded fragment, which provides sufficient signal strength during the pyrosequencing reaction that follows to detect and record nucleotide incorporation events. sstDNA, singlestranded template DNA.
The Roche/454 FLX
454/enablingtechnology/the-system.asp
The method used by the Roche/454 sequencer to amplify single-stranded DNA copies from a fragment library on agarose beads. A mixture of DNA fragments with agarose beads containing complementary oligonucleotides to the adapters at the fragment ends are mixed in an approximately 1:1 ratio. The mixture is encapsulated by vigorous vortexing into aqueous micelles that contain PCR reactants surrounded by oil and pipetted into a 96-well microtiter plate for PCR amplification. The resulting beads are decorated with approximately 1 million copies of the original single-stranded fragment, which provides sufficient signal strength during the pyrosequencing reaction that follows to detect and record nucleotide incorporation events. sstDNA, singlestranded template DNA.
二代测序原理与技术(IonProton)
一条基因
一根探针 60bp
整个基因中，仅以与这60bp探针互补杂 交到的基因表达量来代表整个基因的表 达量。
20 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
二代测序
二代测序与芯片技术的比较
一条基因
通过测序技术直接获 得这些基因的序列片
2.碱基配对结合
9 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
3.释放氢离子
10 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
6.读取模版的连续两个相同碱基
13 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
7.芯片上几十万、几百万甚至上千万个DNA片段同时读取序列信息
14 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
高通量芯片内进行测序反应
dNTP H+
Sensing Layer Sensor Plate
Bulk
Drain
Source
Silicon Substrate
∆ pH ∆Q
∆V
Rothberg J.M. et al Nature doi:10.1038/nature10242
4种dNTP依次流过Ion芯片 DNA 聚合反应产生的氢离子的直接检测 每个碱基的检测只需要几秒
第二代dna测序的原理
第二代dna测序的原理第二代DNA测序技术，也被称为高通量测序技术，是指一类能够快速、经济地获得DNA序列信息的方法。
相比于第一代测序技术，第二代测序技术具有高通量、高速度、低成本等优势，因此已经成为了现代基因组学和生物学研究的重要工具。
目前，第二代测序技术主要包括Illumina HiSeq、Ion Torrent、PacBio SMRT等几种。
Illumina HiSeq是目前最流行的第二代测序技术，其原理可以分为文库构建、模板扩增、测序和数据分析四个主要步骤。
首先是文库构建。
该步骤主要是将DNA样品通过多个步骤进行前期处理，包括DNA的纯化、切割、链接连接适配体等，最终得到文库。
适配体是一小段已知序列，它可以与模板DNA的末端链接，用于测序反应的起始点。
接下来是模板扩增。
首先将文库DNA通过PCR反应扩增成为桥式文库。
PCR 反应过程中，适配体的序列被引物扩增，使得文库DNA与测序芯片上的引物产生结合。
然后，通过测序芯片上的固定位置的红外激光对测序模板进行扩增。
然后是测序。
基于桥式文库的测序技术主要依赖于合成DNA链的方法。
利用测序引物和缺失碱基，通过反复的碱基加入和扩增，合成出与模板DNA互补的新链。
在每一轮的测序中，只能加入一种缺失的碱基，而不能加入其他碱基。
利用红外激光激发这些碱基，通过监测发出的荧光强度，可以确定每个位置的碱基。
最后是数据分析。
经过测序仪产生的大量序列数据需要进行相应的数据处理和分析。
首先，需要对序列数据进行质量控制，去除低质量的数据。
然后，利用计算算法将测序的碱基与模板DNA进行比对，以此确定模板DNA的序列。
最后，通过基因组学分析软件进行数据解读和注释，比如寻找SNP（单核苷酸多态性）、查找功能基因等。
总结起来，第二代DNA测序技术通过文库构建、模板扩增、测序和数据分析等步骤，实现了高通量地获取DNA序列。
其中，Illumina HiSeq是最常用的技术之一，利用DNA链的合成方法进行测序，并通过数据处理和分析得到最终的DNA序列信息。
DNA第2代测序技术ppt课件
么要发展第2代测序技术
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
微生物遗传学时期
• 大致是1940～1960年，在这一时期中，采用微生物作为 材料研究基因的原初作用、精细结构、化学本质、突变机 制以及细菌的基因重组、基因调控等，取得了已往在高等 动植物研究中难以取得的成果，从而丰富了遗传学的基础 理论。
分子遗传学时期 • 这一时期从1963年沃森和克里克提出DNA的双螺旋模型 开始，但是50年代只在DNA分子结构和复制方面取得了 一些成就，而遗传密码、mRNA、tRNA、核糖体的功能 等则几乎都是60年代才得以初步阐明。 • 20世纪70年代初，建立了遗传工程这一新的研究领域。 遗传工程是在细菌质粒和噬苗体以及限制性内切酶研究的 基础上发展起来的，它不但可以应用于工、农、医各个方 面，而且还进一步推进分子遗传学和其他遗传学分支学科 的研究。
• 在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀— 深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色 质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以 直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip， ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、 结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。
• 孟德尔于1866年发表了论文《植物杂交试验》，首次提 出分离和独立分配两个遗传规律，并认为性状遗传是受细 胞里的遗传因子控制的。 • 但是，孟德尔的这一重要理论当时未能收到重视，直到 1900年，狄· 弗利斯﹑柴马克和柯伦斯三人才同时发现。 • 1900年孟德尔遗传规律的重新发现，被公认为遗传学建 立和发展的一年，并于1906年将遗传学作为一个学科的 名称。
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
微生物遗传学时期
• 大致是1940～1960年，在这一时期中，采用微生物作为 材料研究基因的原初作用、精细结构、化学本质、突变机 制以及细菌的基因重组、基因调控等，取得了已往在高等 动植物研究中难以取得的成果，从而丰富了遗传学的基础 理论。
分子遗传学时期 • 这一时期从1963年沃森和克里克提出DNA的双螺旋模型 开始，但是50年代只在DNA分子结构和复制方面取得了 一些成就，而遗传密码、mRNA、tRNA、核糖体的功能 等则几乎都是60年代才得以初步阐明。 • 20世纪70年代初，建立了遗传工程这一新的研究领域。 遗传工程是在细菌质粒和噬苗体以及限制性内切酶研究的 基础上发展起来的，它不但可以应用于工、农、医各个方 面，而且还进一步推进分子遗传学和其他遗传学分支学科 的研究。
• 在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀— 深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色 质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以 直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip， ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、 结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。
• 孟德尔于1866年发表了论文《植物杂交试验》，首次提 出分离和独立分配两个遗传规律，并认为性状遗传是受细 胞里的遗传因子控制的。 • 但是，孟德尔的这一重要理论当时未能收到重视，直到 1900年，狄· 弗利斯﹑柴马克和柯伦斯三人才同时发现。 • 1900年孟德尔遗传规律的重新发现，被公认为遗传学建 立和发展的一年，并于1906年将遗传学作为一个学科的 名称。
第二代测序的原理及其应用
第二代测序的原理及其应用1. 前言随着DNA测序技术的发展，第二代测序技术的出现为科研人员和生物医药领域带来了革命性的变化。
本文将介绍第二代测序的原理及其在科研和生物医药领域的应用。
2. 第二代测序的原理第二代测序是相对于第一代测序而言的，其主要特点是高通量和快速测序。
相比第一代测序，第二代测序技术可以在短时间内完成大规模的DNA测序。
第二代测序的原理基本上是通过将DNA样本分子化，并通过扩增、固定和测序的过程来获得测序结果。
具体步骤如下：•DNA片段的制备：首先，DNA样本需要进行切割，生成适当长度的DNA片段。
•适配体连接：将DNA片段连接到适配体上，适配体上含有特定序列，用于扩增和固定DNA片段。
•DNA扩增：通过PCR反应，对连接好的DNA片段进行扩增，以增加测序的灵敏度。
•DNA固定：将扩增的DNA片段固定在测序芯片或流式细胞中，以便进行后续的测序反应。
•测序反应：通过各种不同的测序技术（如Illumina、Ion Torrent 等），对DNA片段进行测序，得到碱基序列。
•数据分析：通过计算机算法，将得到的碱基序列进行比对和分析，得到最终的测序结果。
3. 第二代测序的应用第二代测序技术的高通量和快速特性使其在科研和生物医药领域有着广泛的应用。
以下是第二代测序技术的一些主要应用：3.1 基因组学研究•通过对整个基因组的测序，可以帮助科研人员了解基因组的结构、功能和变异情况。
•基因组测序还可以用于研究不同物种之间的遗传差异，揭示物种的进化历史。
3.2 转录组学研究•转录组测序可以帮助科研人员了解特定组织或细胞中的转录活动。
•通过比较不同条件下的转录组数据，可以探索基因表达的调控机制。
3.3 蛋白质组学研究•第二代测序技术结合质谱分析，可以用于高通量的蛋白质组学研究。
•可以通过测序和质谱分析，研究蛋白质的翻译后修饰和亚细胞定位。
3.4 癌症基因组学研究•通过对肿瘤患者的基因组测序，可以寻找与癌症相关的突变。
DNA第2代测序技术ppt课件
1.3 第2代测序技术的特点
• 速度快 • 准确度高
• 成本低
• 覆盖度深
• 产出巨大
1.4 第2代测序技术的原理
• 第2代测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司 的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 • 下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介 绍。
1.6 第2代测序技术的前景
• 大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全取代目前的 芯片测序技术。 • 新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。 • 但是，基因芯片也有其自身的缺点，就在于它是一个“封 闭系统”，它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变 异)。而高通量测序的强项， 就在于它是一个“开放系 统”， 它的发现能力和寻找新的信息的能力，从本质上 高于芯片技术。
高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达 谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。
• 2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行 了RNA 深度测序。分析测得的序列，有大于90%的数据 显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息 通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式、3’ 端非翻译区、变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体。454测序技术流程
• 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物 (homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A) 的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数 目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。 也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷 酸的替换，而是来自插入或缺失。 • 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
二代测序原理及报告解读
解决方案：
1.设计引物时，设计范围向外扩展一部分，能够覆盖住剪切位点，部分 内含子，以及调控区域。
2.对于panel里面覆盖的基因，对于报道的常见的非编码区的热点突变， 额外加用捕获引物或用其他方法补齐。
阴性结果原因分析3
❖ 另外一条染色体各种修饰作用异常（DNA甲 基化，核小体修饰等）
DNA双链 甲基化 组蛋白修饰
2.1 基因变异所致疾病及遗传方式
使用孟德尔遗传数据库查找基因所致疾病及遗传方式
显性与隐性遗传共存在
多种遗传方式
不完全显性
2.结果具体分析
1）该基因突变致病疾病类型及遗传方式 2）该样本的此处突变是否为致病性突变 明确致病和可疑致病 3）该样本的突变型最终是否患病
2.2 查找突变位点的致病性
➢ 可能与当前症状有关的但又无报道致病性不明的突变位点。除非未发现其他典 型致病点，可考虑出报告结果。
注明：仅有在报告结果中的位点是经过一代验证的，其他选点表中的突变点都是未验证的。
选点数据举例
一肝病panel 阴性结果报告，选点数据
阴性结果原因分析1
❖ 该基因上存在杂合性缺失。
外显子 内含子
仅从检测得到的碱基序列上看， 完全正常，并为纯和序列。
2.3 总结突变与患病的关系
• 从遗传方式看有没有患病的可能性 • 从突变类型看有没有患病的可能性
ACMG突变解析指南
未报道致病位点，致病可能性的评估指南，节选其中可能致病性很强列表如下：
3.基因与疾病背景介绍
• 基因介绍来自于Gene数据库 • 疾病介绍来自于OMIM、罕见病数据库或其他外文权威
数据库
4.附表
1. 检测基因包基因列表 2. 可疑阳性报告，附不明突变致病性预测指南附表 3. 检测到的其他突变位点（已去掉正常多态位点）
1.设计引物时，设计范围向外扩展一部分，能够覆盖住剪切位点，部分 内含子，以及调控区域。
2.对于panel里面覆盖的基因，对于报道的常见的非编码区的热点突变， 额外加用捕获引物或用其他方法补齐。
阴性结果原因分析3
❖ 另外一条染色体各种修饰作用异常（DNA甲 基化，核小体修饰等）
DNA双链 甲基化 组蛋白修饰
2.1 基因变异所致疾病及遗传方式
使用孟德尔遗传数据库查找基因所致疾病及遗传方式
显性与隐性遗传共存在
多种遗传方式
不完全显性
2.结果具体分析
1）该基因突变致病疾病类型及遗传方式 2）该样本的此处突变是否为致病性突变 明确致病和可疑致病 3）该样本的突变型最终是否患病
2.2 查找突变位点的致病性
➢ 可能与当前症状有关的但又无报道致病性不明的突变位点。除非未发现其他典 型致病点，可考虑出报告结果。
注明：仅有在报告结果中的位点是经过一代验证的，其他选点表中的突变点都是未验证的。
选点数据举例
一肝病panel 阴性结果报告，选点数据
阴性结果原因分析1
❖ 该基因上存在杂合性缺失。
外显子 内含子
仅从检测得到的碱基序列上看， 完全正常，并为纯和序列。
2.3 总结突变与患病的关系
• 从遗传方式看有没有患病的可能性 • 从突变类型看有没有患病的可能性
ACMG突变解析指南
未报道致病位点，致病可能性的评估指南，节选其中可能致病性很强列表如下：
3.基因与疾病背景介绍
• 基因介绍来自于Gene数据库 • 疾病介绍来自于OMIM、罕见病数据库或其他外文权威
数据库
4.附表
1. 检测基因包基因列表 2. 可疑阳性报告，附不明突变致病性预测指南附表 3. 检测到的其他突变位点（已去掉正常多态位点）
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释放出的光学信号而间接确定的。 除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像 ，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更
增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。 直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常 可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。 在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNA Electronics，IBM, NabSys， Oxford Nanopore Technologies，Sequenom 等都在进行纳米孔测序的开发
外显子组分析工具
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
3
第一代测序技术 ： Sanger测序法 ——简便、快速
4
逐渐被遗忘的测序 技术： Maxam-Gilbert的 DNA化学降解法
5
Sanger测序的局限
通过几十年的改进，第1 代测序仪的读长可以超过1000bp， 原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的
成本是0.5 美元, 每天的数据通量可以达到60万碱基。 但是，不管怎么改进，第1 代测序技术在速度和成本方面都 已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖, 使其难以进一 步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化
降低测序成本）。 在此种情况下，第二代测序技术（Next-generation
sequencing)应运而生。
6
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • Illumina SOLID Polonator Complete Genomics
ChIP-seq
RNA-seq
Experiments
• DNA-seq: de novo, resequencing • RNA-seq:mRNA, ncRNA, smRNA... • ChIP-seq: Chromatin ImmunoPrecipitation • Methyl-seq: methylated DNA (epigenome)
，不同的只是采用的方法或策略。
18
19
20
Second generation sequence
• Roche 454 illumia Solexa
ABI SOLiD
Metagenomics De novo sequencing RNA-seq De novo sequencing Re-sequencing RNA-seq (ChromatinImmunoprecipitation，ChIP) Meth-seq Re-sequencing
问题出发
• 正常样本与异常样本，如肿瘤等； • 药物处理前后样本状态变化，如尼古丁刺激前后； • 发育不同阶段的样本改变
.............
第二代测序数据分析原理
徐汪节
三代DNA测序技术之比较
第一代测序技术：Sanger测序法 第二代测序技术：454测序……
第三代测序技术：？ 直接测序法：？
using pir-end reads. • N50 size. As applied to contigs or scaffolds, that size above which
50% od the assembled
全基因组de nove分析工具
分析所需工具
• Bowtie software SAM tools TopHat softare Cufflinks software CummeRbund software -
14
第二代测序技术的局限
与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台 速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基
的序列不足为奇。 但是, 除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台 的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成
的。 而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
Sequencing Glossary
• Reads. A collection of clones that over-sample the target genome. • Pair-end reads.Sequence reads derived from both ends of a
is taken. • Contig. The result of joining an overlapping collection of sequence
reads. • Scaffold. The result of connectiing non-overlapping contiges by
15
第三代测序技术：单分子测序
Helicos Biosciences VisiGen
Pacific Biosciences Mobious Nexus I
……
16
17
直接测序法
在所有上述三 代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助 下，通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中
……
8
454
9
SOLID
10
Illumina
11
其他
Polonator Complete Genomics
……
12
13
第二代测序技术的共同点
1 将目标DNA剪切为小片段 2 单个小片段DNA分子结合到固相表面
3 单分子独立扩增 4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号
5 高分辨率的成像系统 。
sequencing-library clone. • Mate-pair reads.Sequence reads derived from both ends of a mat
pair library clone which insert size is usually>1kb. • Insert size. The size of the clone-insert from which a clone-end pa
增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。 直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常 可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。 在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNA Electronics，IBM, NabSys， Oxford Nanopore Technologies，Sequenom 等都在进行纳米孔测序的开发
外显子组分析工具
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
3
第一代测序技术 ： Sanger测序法 ——简便、快速
4
逐渐被遗忘的测序 技术： Maxam-Gilbert的 DNA化学降解法
5
Sanger测序的局限
通过几十年的改进，第1 代测序仪的读长可以超过1000bp， 原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的
成本是0.5 美元, 每天的数据通量可以达到60万碱基。 但是，不管怎么改进，第1 代测序技术在速度和成本方面都 已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖, 使其难以进一 步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化
降低测序成本）。 在此种情况下，第二代测序技术（Next-generation
sequencing)应运而生。
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• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • Illumina SOLID Polonator Complete Genomics
ChIP-seq
RNA-seq
Experiments
• DNA-seq: de novo, resequencing • RNA-seq:mRNA, ncRNA, smRNA... • ChIP-seq: Chromatin ImmunoPrecipitation • Methyl-seq: methylated DNA (epigenome)
，不同的只是采用的方法或策略。
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Second generation sequence
• Roche 454 illumia Solexa
ABI SOLiD
Metagenomics De novo sequencing RNA-seq De novo sequencing Re-sequencing RNA-seq (ChromatinImmunoprecipitation，ChIP) Meth-seq Re-sequencing
问题出发
• 正常样本与异常样本，如肿瘤等； • 药物处理前后样本状态变化，如尼古丁刺激前后； • 发育不同阶段的样本改变
.............
第二代测序数据分析原理
徐汪节
三代DNA测序技术之比较
第一代测序技术：Sanger测序法 第二代测序技术：454测序……
第三代测序技术：？ 直接测序法：？
using pir-end reads. • N50 size. As applied to contigs or scaffolds, that size above which
50% od the assembled
全基因组de nove分析工具
分析所需工具
• Bowtie software SAM tools TopHat softare Cufflinks software CummeRbund software -
14
第二代测序技术的局限
与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台 速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基
的序列不足为奇。 但是, 除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台 的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成
的。 而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
Sequencing Glossary
• Reads. A collection of clones that over-sample the target genome. • Pair-end reads.Sequence reads derived from both ends of a
is taken. • Contig. The result of joining an overlapping collection of sequence
reads. • Scaffold. The result of connectiing non-overlapping contiges by
15
第三代测序技术：单分子测序
Helicos Biosciences VisiGen
Pacific Biosciences Mobious Nexus I
……
16
17
直接测序法
在所有上述三 代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助 下，通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中
……
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454
9
SOLID
10
Illumina
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其他
Polonator Complete Genomics
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第二代测序技术的共同点
1 将目标DNA剪切为小片段 2 单个小片段DNA分子结合到固相表面
3 单分子独立扩增 4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号
5 高分辨率的成像系统 。
sequencing-library clone. • Mate-pair reads.Sequence reads derived from both ends of a mat
pair library clone which insert size is usually>1kb. • Insert size. The size of the clone-insert from which a clone-end pa