第9章转基因表达
09转基因动物与生物反应器-HXY78页PPT
转基因动物技术路线
外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物
转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系
哺乳动物生殖生理
哺乳动物受精和妊娠，整乳动物的制备方法
显微注射法 逆转录病毒载体感染 胚胎干细胞介导法 精子载体介导法 YAC介导的基因转移
1 显微注射法
雄性原核
显
受精卵
微
注
射
显微注射
法
操
作
胚胎移植
流
程
后定检测
显微注射法的优点
a、转移率较高、整合效率达30%； b、外源基因长度可达50Kb； c、方法简单，导入过程直观；
缺点
a、设备昂贵、操作复杂； b、随机整合、首尾相连的多拷贝； c、常造成插入位点附近宿主DNA大片
段缺失、重组等突变，出现动物严重 生理缺陷； d、外源基因能否稳定整合要到子一代 中筛选得到。
1987年美国科学家戈登（Gordon）等 人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋 白──tPA（组织型纤溶酶原激活物）， 展示了用动物乳腺生产高附加值产品的 可能性。利用动物乳腺生产高价值产品 的方式称为乳腺生物反应器。
微生物反应器 植物反应器 动物反应器
(一) 优点 1可以利用发酵工程 技术大规模生产。 2 胞外活性物质制备 容易。 （二）不足 1哺乳动物或人类的 基因往往不能表达。 有些表达了，却没有 活性，需要进一步修 饰。 2真核生物蛋白质翻 译后加工的精确性有 限。 3需要大型发酵设备 和车间。 4细菌发酵常形成不 溶聚合物，使下游加 工成本增加。
疾病模型
基因转移方法
转导的基因
细胞工程思考题
２）ES细胞的分化抑制培养
在ES细胞的培养过程中，一方面要给以足够的营养物质以满足其增殖的需要，另一方面要抑制其分化，其中前者由基础培养基来解决，后者则由分化抑制物来完成。
分化抑制物的选择目前有三种分化抑制物比较常用：
饲养层（feeder layer）：常用的有STO（一种已成系的小鼠成纤维细胞）、小鼠原始胚胎成纤维细胞（PMEF)
Mammary gland bioreactor:乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中的表达，并从转基因动物的乳汁中获取重组蛋白。
正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)
同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。
2.简介转基因动物技术的应用
1)动物品种改良；
2)生物制药(乳腺生物反应器)；
3)建立人类疾病的动物模型；
4)生产可移植用的动物器官；
5)基因治疗(动物模型)；
6)基因打靶。
3.简介转基因哺乳动物的制备方法
显微注射法
逆转录病毒载体感染
精子载体介导法
胚胎干细胞介导法
细胞核移植技术
YAC介导的基因转移
4.请阐述胚胎干细胞途径的基因打靶的基本原理及实验流程
动物细胞工程
动物细胞工程第一章动物细胞工程概论一、动物细胞工程的概念1.动物细胞工程的定义动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的技术方法对动物细胞进行各种操作并使其在体外生长、增殖、分化以生产有用产品或引向成体化（产生新型生物个体）的技术体系，是生物技术（生物工程）的重要组成部分。
狭义细胞工程指对细胞个体进行的各种操作，广义的细胞工程包括对细胞、组织、器官所进行的各种操作。
2.动物细胞工程研究的主要内容以狭义细胞工程为主，兼顾组织、器官工程等内容的研究。
(1)狭义细胞工程：研究体外分离、培养、增殖、分化动物细胞的条件以及保存、操作及利用动物细胞的工艺技术体系。
(2)组织工程：研究体外培养、增殖动物组织的条件以及保存、操作及利用动物组织的工艺技术体系。
(3)器官工程：研究体外培养、增殖器官的条件以及保存、操作及利用动物器官的工艺技术体系。
(4)动物胚胎工程：研究动物胚胎生产、保存、操作及移植的工艺技术体系。
3.动物细胞工程研究的意义(1)是动物繁殖的重要技术手段加快动物繁殖速度：A.体外受精生产胚胎 B.胚胎移植生产动物(2)是人类辅助生殖技术的重要组成部分体外受精—胚胎移植技术，可以克服雄性不育和雌性不孕；(3)是动物遗传育种的重要技术手段对精子或卵子进行遗传操作，或利用细胞融合、胚胎嵌合技术可以使若干个动物性状进行有机组合，产生新的生物个体；(4)生产药物直接培养细胞或组织，从细胞或组织代谢物中直接获得药物;对细胞进行遗传操作，生产转基因动物，利用转基因动物生产药物（生物反应器）；(5)保存珍惜动物资源由于动物克隆技术的成功，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生命个体，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生物种群(6)提供人类器官移植的材料人类器官移植发展很快，目前可以进行心脏、肝、肾脏移植，可以进行皮肤、角膜、骨髓细胞移植。
三、动物细胞工程讲授的主要内容1.动物细胞、组织培养2.动物细胞融合3.动物细胞重组4.向细胞内引入高分子物质5.动物细胞冷冻保存6.动物胚胎工程四、动物细胞工程实验（实习）内容1.实验仪器设备的识别与使用2.动物细胞培养用液的制备3.动物胎儿成纤维细胞分离与培养4.动物细胞常规检查和生物学检测5.培养细胞的冻存与复苏五、动物细胞工程研究取得的重要进展1.精液采集、精液冷冻与人工授精技术的成熟和发展，为充分发挥利用雄性动物生殖潜力奠定了基础；2.雌性动物卵母细胞体外成熟培养技术的成功，使人们在体外完成动物生殖过程成为可能；3.体外受精与胚胎移植技术的成功，产生了试管婴儿，试管牛，试管猪，试管山羊，试管兔；4.细胞核移植技术的成功，使人们克隆高等哺乳动物的梦想得以实现体细胞核移植、胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植技术的成功，为克隆动物和转基因动物生产提供了技术支撑；5.胚胎干细胞与组织干细胞成功分离、体外扩增与诱导分化研究的成功，为人类医学发展提供了宝贵的材料；胚胎干细胞，胰腺干细胞，神经干细胞，骨髓干细胞，皮肤干细胞，角膜干细胞6.转基因细胞（细胞转染基因）技术的成功，为转基因动物的生产创造了条件；7.胚胎嵌合技术一种或两种动物胚胎共同生长发育形成一个生物个体的技术，即在一个生物体内，含有来源于两个不同胚胎的细胞和组织；8.细胞融合技术将两种或两种以上的细胞融合，形成一个具有新性状的细胞，这种技术称为细胞融合技术。
转基因食品卫生管理办法-卫生部令第28号
转基因食品卫生管理办法正文：---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 中华人民共和国卫生部令（第28号）《转基因食品卫生管理办法》已于2001年12月11日经卫生部部务会讨论通过，现予发布，自2002年7月1日起施行。
部长：张文康二00二年四月八日转基因食品卫生管理办法第一章总则第一条为了加强对转基因食品的监督管理，保障消费者的健康权和知情权，根据《中华人民共和国食品卫生法》（以下简称《食品卫生法》)和《农业转基因生物安全管理条例》，制定本办法。
第二条本办法所称转基因食品，系指利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植物和微生物生产的食品和食品添加剂，包括：(一)转基因动植物、微生物产品；(二)转基因动植物、微生物直接加工品；(三)以转基因动植物、微生物或者其直接加工品为原料生产的食品和食品添加剂。
第三条转基因食品作为一类新资源食品，须经卫生部审查批准后方可生产或者进口。
未经卫生部审查批准的转基因食品不得生产或者进口，也不得用作食品或食品原料。
第四条转基因食品应当符合《食品卫生法》及其有关法规、规章、标准的规定，不得对人体造成急性、慢性或其他潜在性健康危害。
第五条转基因食品的食用安全性和营养质量不得低于对应的原有食品。
第六条转基因食品的生产企业须达到国家有关食品生产企业卫生规范的要求。
转基因食品的生产经营者应当保证所生产经营的转基因食品的食用安全性和营养质量。
转基因食品的生产者应当保留转基因食品进（出）货记录，包括进（出）货单位、地址、数量，相关记录至少保留二年备查。
第二章食用安全性与营养质量评价第七条卫生部建立转基因食品食用安全性和营养质量评价制度。
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
第9章 转基因技术
重组目的基因的结构示意图
限制性核酸内切酶
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DNA连接酶
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转入受体进行表达
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二、中游部分
1、外源基因的导入 2、外源DNA整合、转录及表达的检测
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1、外源基因的导入
1）受精卵原核显微注射法 2）逆转录病毒感染法 3）胚胎干细胞法 4）精子载体法 5）细胞核移植法 6）脂质体介导法 8）基因打靶 9）原始生殖细胞技术
效率高
感染率高、细胞损伤小，胚胎存活率高。
宿主范围广泛，外源DNA在整合位点附近较少发生缺失 和重排
呈单位点、单拷贝整合，并且不受胚胎发育阶段的限制。
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缺点：
逆转录病毒载体容量有限，只能转移≤10kb的DNA，转 入的基因一般没有其邻近的调控序列。
载体病毒基因有潜在的致病性，携带外源基因的病毒 载体在导入受体细胞过程中有可能激活受体细胞DNA序 列上的原癌基因或其它有害基因，威胁受体动物的健 康安全。
基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
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第二节
原理 同源重组(homologous recombination)
发生在同源序列间的重组，通过链的断裂 和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链 或双链片段的交换。 细胞水平实现基因的定位修饰
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优点：
可对阳性细胞选择，实现外源DNA的定点整合，避免 了随即整合的缺点。
，是一项旨在培育肉多低脂且环境友好型家禽的研究组成部
分。无毛鸡能够减少养殖户用在防止鸡遭受高温侵袭的通风
设施上的投入
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约翰斯-霍普金斯大学的科学家注视着两只小老鼠，左边的 是一只普通老鼠，右边的是一只转基因老鼠，肌肉发达程 度是普通老鼠的2到3倍。在对一种新发现的基因进行研究 时，科学家培育了转基因鼠。这只转基因鼠有助于科学家 寻找伴随癌症或者艾滋病出现的肌肉萎缩症的治疗手段。
第09章 诱变育种
常用方法浸泡法，另外有注射涂抹、熏蒸法 等。可处理种子、茎、叶或花序部分，但根系对 药剂敏感，不能从根系吸收诱变剂。
不同诱变剂诱发的突变类型和频率是不同的。 注意诱变剂的浓度，处理持续时间。
化学诱变剂特点：
1. 诱发突变率较高（点突变），而染色体畸变 较少
2.具有一定专一性，对处理材料损伤轻，有的 诱变剂只限于DNA的某些特定部位发生变异 3.需要渗透组织内部具有局限性(腊质化角质化） 4.方便成本低，但具有致癌的危险性
• 思考题 • 1、主要物理诱变剂的种类、辐射源和主要特征是什么？ • 2、试述辐射诱处理的材料与相应的处理方法？ • 3、什么是照射强度和剂量强度？其单位是什么？如何进行新旧单位
的换算？
• 4、如何确定最适宜的辐射剂量？ • 5、主要化学诱变剂的种类、性质和诱变原理是什么？使用中应注意
哪些问题？
图7－1嵌合体的形成方式
诱变育种的实例
瑞典由Bonus经X射线处理育成的矮秆抗倒 的Pallus，中国育成的盐辐矮早三。 大麦对白粉病抗性是用诱变方法获得了抗 性基因ml-o， ml-o基因对白粉病免疫的， 该基因与坏死斑点性状紧密连锁。 各种作物经常诱发早熟突变体，如早熟大 麦突变体Mari品种的熟期提早8d。
4.敏感部位
二、诱变剂量的选择
一般在改良个别性状时，处理剂量要求稍 低些(早熟性)，若期望产生较多类型的突变体， 则采取较高的剂量(降低株高)。 三、处理群体的大小
突变率是很低的，可能只要万分之一到百 万分之一。
四、种植和选择
通常M1不进行选择。 M2 大群体，选择单株， 但无益突变较多，注意株高、早熟性、抗性。 M2优良株系选择单株。
第三节 理化诱变剂的复合处理
《基因工程》课程教学大纲
《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。
2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
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• （2）反式失活（trans-inactivation），指转基因 以顺式方式插入并发生失活，作为一个沉默子 （silencer）而引起不同DNA分子上同源的等位或 非等位的目标基因失活
第9章 转基因沉默机制
第9章转基因表达
一、植物转基因的一些问题
• 1. 转基因的沉默, 技术和科学问题，涉及到 转基因的应用。
• 2．转基因植物对生态环境的影响和转基因 食品的安全性等问题。
第9章转基因表达
• 外源基因与受体基因组整合，但该基因不表达或表 达水平降低，或者植物新获得的遗传特性随着植物 自身的繁殖在后代中又消失，这种现象转基因沉默 （transgene silencing）或转基因失活（transgene inactivation）。
第9章转基因表达
2．位置效应
• 外源基因整合到染色体的物理位置就直接 决定着外源基因的表达，这种情况称为位 置效应（position effect）有两种情况，（1） 外源基因插入染色体中高度甲基化的区域 或异染色质区，外源基因的甲基化而导致 基因沉默。
• （2）外源基因的碱基组成与整合区域的不 同而被受体细胞的防御系统所识别，不进 行转录使基因沉默。
> Small molecular (26.9 KD) and fusion at both N-and C- terminal provide protein localization and intercellular protein trafficking
第9章转基因表达
Transgenic Barley, 2N=14
第9章转基因表达
转录水平的基因沉默
1．DNA的拷贝数和其结构
• 转基因沉默与转基因的拷贝数和其构型有关。 DNA-DNA相互作用。
• 多拷贝的整合方式并未使基因表达水平有所增加， 反而使DNA发生甲基化或其他原因引起基因失活。 农杆菌介导的转化方法比DNA 直接转化法所产生 的拷贝数低。外源基因的拷贝数低也并一定能导 致基因的充分表达，所以转基因拷贝数的多少对 基因表达没有定论。倾向于多拷贝导致基因沉默。
第9章转基因表达
Posttranscriptional gene silencing (PTGS)
• PTGS mediated by sense transgenes • PTGS mediated by antisense transgenes • PTGS mediated by DNA/RNA viruses
第9章转基因表达
Gene silencing in transgenic plant Transcriptional gene silencing (TGS)
• TGS mediated by DNA methylation • TGS mediated by surrounding heterochromatin • TGS mediated by copy number of insert • TGS mediated by endogenous repetitive sequences
第9章转基因表达
Green fluorescent protein (GFP)
> GFP sources from jellyfish Aequorea victoria > GFP as a new vital reporter in plant for detection
in living cell by light at 395 or 470 nm
第9章转基因表达
• 诱导重复DNA甲基化（repeat—induced DNA methylation），转基因作为串联重复 或反向串联重复插入基因组同一位点则倾 向于失活，因重复会导致甲基化，通常， 在一个位点内拷贝数愈高，失活愈严重。
第9章转基因表达
• 外源基因的构型是指多拷贝的外源基因以正向或 反向串联的形式整合在植物基因组中。
第9章转基因表达
Seeding of line
第9章转基因表达
• GFP expression on root tips in different transgenic barley lines
第9章转基因表达
• Molecular analysis of T1 generation
for gfp gene
• 转基因的拷贝数和构型 • 转基因在基因组中的整合位点 • 转基因的转录水平和翻译水平 • 环境因子对转基因表达的作用默主要分为两类， • 转录水平的基因沉默（transcriptional gene
silencing，TGS），发生在核内 • 转录后水平的基因沉默
（Posttranscriptional gene silencing， PTGS） 发生在细胞质中 • 都是核酸的相互作用，即DNA-DNA， RNA-DNA，RNA-RNA。
A1
A2
A3
D
F1
F2
C
E
Igri
第9章转基因表达
• 对于育种来说，这无疑是不受欢迎的实质性障碍。 • 对于基因表达来说，转基因植株为研究目的基因的
表达调控提供了优良的材料。通过深入研究可加深 理解自然植物在DNA水平上调控基因的表达，或在 细胞质中通过mRNA水平来调控基因的表达。
第9章转基因表达
二、转基因沉默的可能机制
• 转基因沉默并不是所转化的基因发生了丢 失或突变，而是整合进植物基因组的外源 基因在转化体的当代或其后代中出现了基 因失活或表达受到抑制的现象。
A
+
pc nc I
CE
+
nc I pc
D
pc nc I
Amplified PC第R9章w转基ith因表G达FP primers for transgenic barley
• GFP expression and inheritance on pollen in T1 and T2 generation