核与线粒体分离提取方案
细胞核和线粒体的分离和观察课件
目录
CONTENTS
• 细胞核和线粒体的基础知识 • 细胞核和线粒体的分离技术 • 细胞核和线粒体的观察方法 • 实验操作注意事项 • 实验结果分析
01
CHAPTER
细胞核和线粒体的基础知重要的亚 细胞结构，由核膜、核仁和染色 质等组成。
细胞核和线粒体的分离效果
通过染色和显微镜观察，可以清晰地看到细胞核和线粒体被成功 分离，没有明显的杂质。
细胞核和线粒体形态特征
分离后的细胞核呈现圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密；线粒体 呈现长条形或杆状，表面有细微的皱褶。
荧光染色效果
通过荧光染色技术，可以观察到细胞核和线粒体分别发出蓝色和绿 色荧光，荧光信号强且均匀。
数据分析
对观察结果进行统计分析 ，得出结论。
实验后的处理
清洗和整理实验器材
实验结果总结
实验结束后，及时清洗和整理实验器 材，确保其完好无损。
对实验结果进行总结，撰写实验报告 ，并进行分析和讨论。
废弃物处理
按照规定处理实验废弃物，避免对环 境和人体造成危害。
05
CHAPTER
实验结果分析
实验结果展示
差速离心法是一种简单、快速和经济 的方法，适用于分离大量细胞。
密度梯度离心法
01
密度梯度离心法是一种 利用连续的密度梯度介 质对细胞进行分离的方 法。
02
在密度梯度离心法中， 细胞悬浮在密度梯度介 质中，然后在离心机中 旋转。
03
由于不同细胞组分的密 度不同，它们在介质中 沉降的速度也不同，从 而实现分离。
电子显微镜观察
总结词
电子显微镜提供了高分辨率的图像，能够更精确地观察细胞核和线粒体的超微结 构。
线粒体DNA提取SOP
线粒体DNA提取SOP
一、蛋白酶K法
1、使用液氮将50mg新鲜组织样本研磨至粉末状；
2、转入1.5mL离心管中加入溶液A（4℃）1mL，冰浴中吹打分散后沉降大块沉淀；
3、4℃，1000r/min离心1min，分离颗粒细胞核和细胞碎片；
4、回收上清至新的1.5mL离心管，12000r/min离心10min；
5、弃上清，尽量去除干净；
6、加50uL蛋白酶K，55℃水浴2.5h，期间每隔15min轻轻混匀；
7、加水至500uL；
8、加入等体积的酚、氯仿、异丙醇抽提，轻柔上下翻转离心管15min；
9、1000r/min离心10min；
10、水相转移至新管并加入各500uL的氯仿和异丙醇，轻柔上下翻转离心管15min；
11、1000r/min离心10min；
12、水相转移至新管，加入2倍体积的冰乙醇沉淀，静置10min；
13、12000r/min离心2min，沉淀即为mtDNA；
14、70%乙醇清洗线粒体DNA，置于空气中自然干燥后加入适量TE液溶解，于4℃保存。
差速离心分离线粒体
差速离心法分离线粒体课程名称： 细胞生物学 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 差速离心法分离线粒体 同组学生姓名： 喻儿一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的1.学会差速离心方法及活体染色一般方法。
2.掌握鼠肝线粒体的分离与鉴定方法二、实验原理1.差速离心法:在一定的离心场中，大小不一的颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
2.悬浮介质的选择：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
离心力 RCF=1.119 ⨯ 10-5 ⨯ r ⨯ n2 （单位：重力常数 g ； r 离心场半径；n 转速）3. 詹纳斯绿活染法鉴定线粒体： 线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。
在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染液中染色15min 以上，才能放上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接触）后，线粒体被染色。
活性样品检测的关键环节：整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
三、实验材料与试剂材料：小白鼠肝脏器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光学显微镜，试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液四、实验步骤I 差速离心法分离线粒体1．小白鼠断颈致死，用75%乙醇消毒外部 皮肤后，剖腹取肝；2．用预冷至0℃的匀浆介质洗肝，干净滤纸 吸干水分后称重；3．往平皿中先加入适量匀浆介质，将肝剪 碎，按每克肝组织加8mL 匀浆介质，加至10mL 玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆；4．待肝组织基本碎裂后，将匀浆液移至10mL 离心管中，平衡后， 4℃下4800rpm 离心15min ，吸取上清液；（染色观察）；5.将1mL 上清液转移至Eppendorf (EP)管 中，4℃，11000rpm(10000g)离心 20min ；(位置)6．转移上清液至新EP 管中；7．沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬 浮液。
细胞生物学实验手册：细胞核与线粒体的分级分离
实验八细胞核与线粒体的分级分离【实验目的】通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，以了解其原理及过程。
【实验用品】一、材料和标本小白鼠、冰块。
二、器材和仪器玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml 烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。
三、试剂 0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。
【实验内容】一、原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、细胞核的分离提取(一)操作步骤。
细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离
实验二细胞核，叶绿体，线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。
4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法。
二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
细胞组分的分离在等渗溶液（0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行。
●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞。
●在3000r/min的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟，所得沉淀即为线粒体，可反复离心一次。
三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶，洗净搽干后去除叶梗和粗脉，称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中，放入组织捣碎机(间歇)；低速匀浆1min；间歇匀浆。
2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中。
3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离。
5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮。
（浓度不要太高，不利于观察）➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上，加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙染料，加盖玻片即可在荧光显微镜下观察。
第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟，所得沉淀即为线粒体，可反复离心一次。
收集沉淀涂片，用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。
实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
线粒体的分离与观察一、实验目的1.初步掌握用差速离心
三、实验用品
1.材料：鸡肝脏 2.器材：高速离心机、解剖刀剪、烧杯、冰浴、漏斗、纱布、匀浆器、高压灭菌锅 3.试剂：0.9%灭菌的生理盐水、1%詹纳斯绿B 染液、 0.25mol/L 蔗糖十
盖玻片，镜检。 结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验报告
1. 分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的 细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)
2. 描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体 的纯度如何?
六、实验建议
1.注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长， 以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。
2.将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀 浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
3.姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。
差速离心提取鸡肝线粒体流程如下图：
分离细胞核
鸡肝2克匀浆
↓
匀浆过滤
↓
滤液
↓
将滤液2ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上
↓
1200rபைடு நூலகம்min 离心10min
↓
↓ 沉淀（涂片①自然干燥）
↓ 上清液1
（细胞核及碎片）
↓
洗涤（加0.25mol/L预冷蔗糖溶液 2ml 混匀，2500r/min 离心15min）
上清液
3. 分离物鉴定
(1) 细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹 干，滴1滴Gimesa染液染色10min。自来水冲洗，干燥后，镜检。
细胞核与线粒体的分离
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。
• 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀；
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/2100水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。
线粒体与体细胞核移植
有 效地协 同工作是 影响核基 因组 重编程效率 的一个重 要 因 素 。ｍｔ ＤＮ Ａ 在不 同物种之间、同一物种 不同个体间均存在 大 量 的核 苷 酸差 异 ，这 种 由 ｍｔ Ｄ ＮＡ 多 态 性产 生 的不 同 ｍｔ ＤＮＡ 单倍 型也 可 导致种 内核 一线粒 体互 作产 生不 同效 应 。此外 ，克隆胚胎 中，存在受体卵母细胞和供体细胞 两种 来源 的线粒体 ， 这两种线粒体 的相互作用影 响着重 构胚 的发 育 。本文对 Ｓ Ｃ ＮＴ 中线粒 体的功能与特性 以及两种来源 的 线粒体 的异质 性及其对 克隆 效率和重 构胚发育 的影响进行
构， 增加 了供体核与卵胞质 中重编程 因子 的相 互协 调作 用使 得受体卵母细胞更容易重编程供体核［ １ 。Ｅ ｎ ｒ ｉ ｇ ｈ ｔ等＿ １ ｌ 】 用一 种 组蛋 白去乙酰化酶抑 制剂古 曲霉 素 Ａ （ Ｔ Ｓ Ａ）处理供体 细 胞，发现 Ｔ Ｓ Ａ 可增加供体核 的组 蛋白乙酰化水平 ，促进 发育相 关基 因的表达 ，提高克隆囊胚率 。 线 粒体作为 哺乳动物 细胞 中唯一具有 自身遗传物 质 的
综述和讨论 。
２ Ｓ Ｃ Ｎ Ｔ 中线 粒体 与供 体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 相容 性 的研究
核质 的互作 与协调是 细胞 正常活动的基础， 体细胞核移
植 重 构 胚 正 常核 型 的 维持 和 核 基 因 组 重 编 程 的 完 成 ， 同样 取
决于供体核 与受体 卵母细胞 的同步协调和相互作用 。 核质互
膜 内外一系列 的生化变化 ，如诱导细胞色素 ｃ 释放 ，活化 ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ蛋 白酶家族 ，呼吸链 与氧化磷酸化失偶联 ，三磷酸 腺苷合 成停止 ，线粒体膜 通透性 改变 ，释放 凋亡诱 导因子
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线虫细胞核和线粒体提取
N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。
初步计划收集10个皿线虫。
1.细胞核分离
细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。
查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。
方法如下：
1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合
2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。
吸出PBS。
3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。
转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。
4.以10000rpm短暂离心5-10秒。
5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中
6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次
7.用棉布过滤匀浆
8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。
丢弃上清液。
用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。
4℃ 600g 离心10分钟。
丢弃上清液。
10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。
在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。
11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。
12.翻转管子去除蔗糖。
从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。
核在这个阶段保留其膜。
要卸下膜，请执行步骤13。
13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。
在4℃下以600g离心10分钟。
重复该过程。
最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。
14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。
分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。
2.线粒体提取
查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下：
1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。
用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。
2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。
3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。
4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。
5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。
6.小心地清除上清液
7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。
细胞使用钝头针头和注射器进行破
碎。
注射器吹打溶胞产物。
重复10次。
或者使用Dounce或Potter匀浆器。
8.在4℃下将裂解物以1000x离心10分钟并小心将上清液转移到干净的1.5ml管中。
颗粒含有细胞核，细胞碎片和未破碎细胞。
如果需要，可以通过重复步骤7和8从细胞沉淀中再提取蛋白质使用500μl冰冷的破碎缓冲液。
每次提取的上清应在下一步之前混合。
9.离心步骤8的上清液以6000×g离心10分钟4℃。
10.小心取出上清液。
11.第10步沉淀重悬到750μl线粒体纯化缓冲液中，用1ml枪头吹打。
将750μl线粒体纯化缓冲液吸入2ml微量离心管并缓慢吸取在线粒体纯化缓冲液下500μl Disruption Buffer。
小心吸取在线粒体纯化缓冲层顶部的线粒体悬液。
12.在4℃下以14,000xg离心15分钟。
13.小心地除去1.5毫升的上清液，不要搅动线粒体层或颗粒。
14.小心地吸取线粒体层或颗粒至一个新的管子，留下0.5ml溶液在管底并。
15.用1.5ml线粒体储存液稀释步骤14的悬液，并在4℃下以8000xg离心10分钟。
16. 吸掉1.5毫升上清液，5毫升线粒体存储缓冲液稀释剩余物悬浮液，4℃下离心8000×g 10分钟。
17.重复步骤16，直到线粒体在底部形成颗粒的管子。
18.重悬线粒体沉淀在线粒体储存缓冲液中进一步分析。
分离的线粒体可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。