qPCR
qpcr的原理及应用
qpcr的原理及应用1. qPCR的基本原理qPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种基于聚合酶链反应（PCR）的技术，用于定量检测DNA或RNA的存在和数量。
它是PCR技术的一种改进型，在PCR扩增过程中引入了荧光探针或染料，可以实现对反应产物的实时监测和定量分析。
qPCR的基本过程包括： - 样品制备：提取待检测的DNA或RNA，并对其进行适当的纯化和稀释处理。
- 引物设计：设计与目标基因或序列互补的引物，用于扩增目标序列。
- 反应体系组装：将适当浓度的模板DNA（或RNA）、引物、酶和缓冲液等组合在一起，构成PCR反应体系。
- PCR扩增：通过一系列的温度循环，使DNA在DNA聚合酶的作用下进行反复扩增。
- 实时监测：在PCR反应过程中，利用荧光探针或染料对扩增产物进行实时监测，并记录荧光信号的变化。
- 数据分析：根据实时监测得到的荧光信号，绘制荧光曲线，并根据标准曲线或基准样品确定待检测样品中目标序列的含量。
2. qPCR的应用领域-qPCR在遗传学研究中的应用： - 定量基因表达分析：通过测量目标基因的mRNA水平，研究基因在生物体内的表达变化，并深入了解基因调控机制。
- 疾病诊断和监测：通过检测患者样本中特定基因的表达水平，诊断和监测相关疾病的发展状态。
- 基因型鉴定：通过检测DNA样本中特定位点的遗传变异，确定个体的基因型。
- 微生物检测和鉴定：通过检测环境样本或患者样本中微生物的核酸，实现对微生物的快速检测和鉴定。
-qPCR在食品安全中的应用： - 食品质量控制：通过检测食品中特定基因的存在和数量，判断食品的品质和安全状况。
- 食品真实性检测：通过检测食品中的特定基因或DNA序列，鉴定食品的真实性和来源。
- 食品中污染物的检测：通过检测食品中的污染物的DNA或RNA，进行快速、灵敏的检测，以保障食品安全。
-qPCR在生态环境研究中的应用： - 物种多样性研究：通过检测环境样本中不同物种的DNA或RNA，分析物种多样性和分布情况，研究生态系统的结构和功能。
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用实时定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种快速、灵敏及准确的基因表达分析技术，它结合了聚合酶链式反应（PCR）和荧光探针技术，可以对目标基因在样品中的数量进行定量分析。
qPCR的原理：1.制备DNA模板：通过DNA提取技术，从感兴趣的样品中纯化出目标DNA。
2.PCR反应：将目标DNA及特异性引物和酶（聚合酶）放入PCR反应体系中，进行多个温度循环，使DNA的两条链分开，随后引物与DNA链特异性结合。
3.DNA合成：引物与DNA链结合后，酶开始合成新的DNA链，双链变为双链。
4.指数增加：经过多个PCR循环，目标DNA序列指数级增加。
5.荧光检测：利用荧光物质（荧光标记的探针）与PCR产物结合，通过荧光信号检测PCR产物的数量。
6.数据分析：根据荧光信号的强度，可以定量计算出目标DNA的初始数量，并进行数据分析。
qPCR的应用：1.基因表达分析：qPCR可以快速、准确地测量特定基因在不同样本中的表达水平，从而了解基因的功能及调控机制。
2.点突变检测：通过使用特异性引物和荧光标记探针，qPCR可以检测特定突变位点的存在与否，有助于基因突变的诊断和疾病的预测。
3.病原体检测：qPCR可以快速鉴定和定量病原体的存在，对于疾病的早期诊断、疫情监测有重要意义。
4.基因组拷贝数分析：qPCR可以快速、准确地测量基因组DNA的拷贝数变化，为研究基因组结构和进化提供重要线索。
5.表观遗传学研究：qPCR可以定量测量DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学修饰的水平，有助于揭示表观遗传学的调控机制。
总结：qPCR作为一种高分辨率、灵敏度高的基因表达分析技术，在分子生物学和医学领域具有广泛的应用前景。
它可以快速、准确地定量测量目标DNA的数量，因此在疾病诊断、病因研究、基因功能分析等方面具有重要作用。
随着技术的不断发展和创新，qPCR将会在更多领域得到应用，为科学研究和临床诊断提供更多有价值的信息。
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用QPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）即定量聚合酶链式反应，是一种可以对DNA进行定量检测的分子生物学技术。
通过测定DNA模版的初始数量，能够准确地对靶DNA在样品中的量进行定量分析。
QPCR技术已经广泛应用于医学、农业、环境科学等众多领域，并且在疾病诊断、基因表达研究、生物安全监测等方面具有重要意义。
QPCR的原理：QPCR主要基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的原理。
PCR技术通过DNA聚合酶，利用DNA引物和酶切的DNA模板来扩增特定DNA序列。
在PCR的每一个循环中，DNA模板会被酶切成两段，然后引物结合到目标DNA上并扩增。
然后，扩增的DNA产物作为下一个PCR循环的模板，以此循环反复扩增。
在QPCR中，扩增的DNA产物通过酶的同步检测来实时监测。
QPCR使用一种荧光探针，在引物结合区域的扩增过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增DNA的数量呈正比。
通过检测荧光信号的强度，可以确定DNA的初始数量。
QPCR的应用：1.疾病诊断：QPCR可以快速、准确地检测疾病相关基因的表达水平，从而帮助进行疾病的早期诊断和病情监测。
比如，QPCR可以检测癌症相关基因的表达水平，辅助肿瘤的早期诊断和治疗。
2.基因表达研究：QPCR能够定量检测基因的表达水平，从而帮助研究基因在细胞和组织中的功能调控机制。
比如，研究在药物处理、细胞因子刺激等条件下，特定基因的表达水平的变化。
3.遗传病筛查：QPCR可以对遗传病相关基因进行定量检测，从而帮助进行遗传病的筛查。
通过检测特定基因的突变和表达水平，可以早期发现遗传病，并进行相应的干预和治疗。
4.放射性污染监测：QPCR可以快速、敏感地检测放射性物质污染的程度和范围。
比如，监测环境中的放射性同位素污染，以保护公众健康。
5.植物基因改良：QPCR可以帮助筛选目标基因在转基因植物中的表达水平。
通过检测基因的表达水平，可以确定转基因植物是否具有目标特性，从而加速植物基因改良的进程。
qpcr原理
qpcr原理qPCR（quantitative real-time polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的快速、准确、灵敏的核酸定量分析方法。
它可以实时监测PCR反应过程中的产物累积量，从而可以在反应进行过程中进行定量分析。
qPCR在医学、生物学、环境科学等领域都有着广泛的应用，成为了分子生物学研究中不可或缺的技术手段。
qPCR原理的核心是通过荧光信号来监测PCR反应过程中的产物累积量。
在PCR反应中，每一轮的DNA复制都会产生指数级增长的DNA片段。
而在qPCR 中，我们通过添加荧光探针（例如SYBR Green或TaqMan探针）来标记PCR反应产物，当PCR反应进行时，荧光信号的强度与PCR产物的累积量成正比。
因此，通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，我们可以得到PCR产物的累积量，从而实现对待测样品中目标基因或DNA序列的定量分析。
qPCR的原理可以简单概括为以下几个步骤，首先，将待测样品中的DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中；随后，通过PCR仪器进行PCR反应，同时实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化；最后，利用PCR仪器的软件分析荧光信号的变化曲线，从而得到待测样品中目标基因或DNA序列的相对或绝对定量结果。
qPCR技术的优势在于其快速、准确、灵敏。
相比传统的终点PCR方法，qPCR可以在PCR反应进行过程中实时监测PCR产物的累积量，避免了终点PCR中可能存在的信号饱和和非线性扩增的问题，从而可以获得更加准确的定量结果。
另外，qPCR还可以通过荧光探针的设计来实现多重PCR反应的同时进行，大大提高了实验效率。
而且，qPCR还可以通过对PCR反应条件的优化和标准曲线的建立，实现对待测样品中目标基因或DNA序列的绝对定量分析，为科研和临床诊断提供了更为准确的数据支持。
总之，qPCR作为一种快速、准确、灵敏的核酸定量分析方法，已经成为了分子生物学研究中不可或缺的技术手段。
数字pcr和qpcr的区别
数字PCR和qPCR的区别1. 引言PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因分型、病原体检测、DNA测序等领域。
随着技术的发展，PCR也分为了数字PCR（digital PCR）和qPCR（quantitative PCR）两种类型。
本文将介绍数字PCR和qPCR的区别。
2. 数字PCR数字PCR是一种精确计数目标序列拷贝数的方法。
它通过将待检测样本分成许多独立的反应区块，每个区块中只存在0个或1个目标序列。
数字PCR的主要步骤包括样本划分、PCR扩增、读取结果等。
数字PCR的主要优点是能够精确计数目标序列拷贝数，而不受PCR扩增效率的影响。
这种方法对于低拷贝目标的检测非常敏感，并且能够检测目标序列的变异情况。
另外，数字PCR的结果可以通过可视化的方式展现，对于分析数据非常方便。
然而，数字PCR的缺点是相对较为复杂，需要使用特殊的设备和试剂盒。
此外，数字PCR的通量相对较低，不能进行高通量的样本处理。
3. qPCRqPCR是一种定量检测目标序列拷贝数的方法。
它基于标准曲线法，通过PCR扩增的同时测量扩增产物的数量。
qPCR的主要步骤包括模板DNA制备、引物探针设计、PCR 扩增、扩增曲线分析等。
qPCR的优点是简单快速，可以同时检测多个基因或样本。
它可以精确地定量目标序列的拷贝数，并且具有高通量的优势。
另外，qPCR还可以分析目标序列的表达水平和变异情况。
然而，qPCR的缺点是对PCR扩增效率敏感，需要进行标准曲线法的建立和验证。
此外，由于PCR扩增过程中产生的非特异性产物，可能会导致假阳性结果。
4. 比较数字PCR和qPCR在原理、应用以及优缺点上存在一些区别。
•原理：数字PCR通过样本分区计数目标序列，而qPCR通过PCR扩增测量目标序列的拷贝数。
•应用：数字PCR常用于低拷贝目标的检测和变异分析，而qPCR适用于目标序列的定量和表达水平分析。
•优点：数字PCR能够精确计数目标序列拷贝数，对低拷贝目标敏感；qPCR快速简便，可同时检测多个样本或基因。
啥是qpcr原理及应用
啥是qpcr原理及应用qPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，定量聚合酶链反应）是一种利用DNA聚合酶酶链反应技术来定量检测DNA浓度的方法。
该技术结合了聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量技术（RTQ-PCR），可以快速、高效地定量研究目标DNA在样本中的存在量。
在qPCR中，DNA模板经过PCR扩增后，在PCR过程中的每个循环都可以测量荧光信号的强度，从而实时监测PCR产物的累积量，进而精确定量DNA。
qPCR原理：1. DNA扩增：qPCR通过酶链反应的多个循环来扩增目标序列的DNA。
每个循环分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA被加热至解链温度使其变为单链DNA。
在退火步骤中，引物与DNA模板结合，并使其扩增产物变为双链DNA。
在延伸步骤中，DNA聚合酶以DNA模板为基础，通过在引物之间合成新的DNA链。
2. 荧光探针：在qPCR中，引物和荧光探针是必不可少的。
引物通过与DNA 模板的两端结合，指导PCR扩增的目标。
荧光探针通常由一个荧光染料和一个荧光信号抑制团（quencher）构成。
当荧光探针与引物结合，并经过PCR扩增过程中的延伸步骤时，荧光信号会产生。
3. 荧光信号检测：qPCR利用荧光信号来定量PCR扩增产物。
荧光信号可以通过实时荧光检测系统来测量，这个系统可以在PCR反应过程中实时记录每个循环的荧光信号强度，并以此来生成一个扩增曲线。
qPCR应用：1. 基因表达研究：qPCR被广泛应用于基因表达研究中，可以定量检测mRNA 水平的变化。
通过对目标基因和参考基因的qPCR检测，可以计算出目标基因相对于参考基因的表达量。
2. 病原体检测：qPCR在临床医学中也有广泛的应用，特别是在病原体检测中。
通过针对病原体的基因进行qPCR检测，可以准确、快速地诊断感染性疾病，并对疾病的治疗方案和预后进行判断。
3. 食品安全检测：qPCR也在食品安全检测中发挥着重要作用。
qpcr三步法
qpcr三步法引言实时荧光定量聚合酶链反应（qpcr）是一种广泛应用于生物学、医学等领域的技术。
它能够快速、准确地测量DNA或RNA样本中的特定序列的数量。
qpcr三步法是进行实时荧光定量PCR的常用步骤。
本文将详细介绍qpcr三步法的原理和操作过程。
原理qpcr三步法基于传统PCR技术，但在反应过程中引入了荧光探针。
这种探针被设计成与待测的特定DNA或RNA序列相互作用，并在PCR反应过程中释放出荧光信号。
通过监测荧光信号的增加，可以确定目标序列的数量。
具体来说，qpcr三步法包括以下步骤：1. 反应混合物的制备首先，需要制备反应混合物，其中包括待测样本的DNA或RNA、引物（用于扩增目标序列的特定DNA序列）和荧光探针（用于检测PCR扩增的目标序列）。
反应混合物还需要包含PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和盐溶液等。
2. PCR扩增反应将反应混合物加入PCR反应管中，并进行PCR扩增反应。
这一步需要将反应管置于热循环设备中，按照特定的温度和时间程序进行PCR扩增。
通常包括初始变性、循环变性、扩增和延伸等步骤。
在每个循环的扩增步骤中，PCR反应管中的目标序列被放大，并产生荧光信号。
3. 荧光信号检测与数据分析在PCR反应过程中，荧光信号会随着PCR扩增产物的积累而增加。
这种荧光信号可以通过qPCR仪器进行实时监测。
qPCR仪器可以定量测量荧光强度，并将其转换为目标序列的初始数量。
通过计算PCR循环阈值（Ct值），可以确定目标序列的初始数量。
Ct值定义为荧光信号达到预设阈值的PCR循环数。
Ct值越低，说明目标序列的初始数量越多。
通过比较待测样本和对照样本的Ct值，可以进一步分析目标序列的表达情况或检测样本中的病原体等。
结论qpcr三步法是一种准确、敏感且快速的DNA或RNA定量技术。
它在生物学、医学等领域具有广泛的应用。
通过实时监测PCR扩增过程中的荧光信号，并进行数据分析，可以定量测量待测样本中的目标序列的数量。
QPCR的概念
1 QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。
即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。
什么是RT-PCR？2 RT-PCR就是逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR 中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
3 其实Rea-time-PCR和qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ）是一码事，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。
虽然Real-time PCR（实时荧光定量PCR）和Reverse transcription PCR（反转录PCR）看起来都可以缩写为RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为qPCR（quantitative real-time PCR）4 real-time RT-PCR中间的“RT”是reverse transcription（逆转录），整个意思就是利用mRNA 或总RNA 为模板的实时逆转录PCR技术（quantitative Real-time RT-PCR）。
real time RT-PCR指的是qPCR+RT-PCR的组合，是说将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR分析，因为RT-PCR是可以定性的，但不能进行定量检测的。
所以不难理解real-time RT-PCR（RT-qPCR）就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从RNA 反转录得到cDNA（RT），然后再用Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
完善中的基因变异分析简介 - 基因变异研究的重要性基因变异分析方法概述检测已知突变1.基本方法：终点法基因分型2.高级方法：基于熔解曲线的基因分型3.基本方法和高级方法的利弊HRM 法检测未知突变1.基于高分辨率熔解曲线基因扫描的原理和定义2.HRM 测定优化3.HRM 高级应用和下游技术参考文献及更多推荐目录1244567781315简介 – 基因变异研究的重要性人类在不同层次的个体基因组上存在差异：DNA序列在较长或较短重复单元的拷贝数中可能带有单核苷酸多态性（SNP）的插入、缺失或变异。
此外还包括DNA的共价键修饰方式的改变，比如通过CpG岛甲基化。
实时PCR提供不同的方法来检测此类不同类型的变异。
造成人类个体差异的基因序列变异90%以上属于单核苷酸多态性（SNP）。
虽然有许多SNP对细胞功能无影响，但科学家们认为其他一些SNP可能增加人类患病的可能性或影响他们对药物的吸收。
近年来，SNP基因分型成为动植物取证、育种等领域基因研究的重要部分，特别是在药物基因组学上。
定义SNP及其分类单核苷酸多态性，即SNP（发音为“snips”），是基因组序列中的单核苷酸（A，T，C或G）发生变化时产生的DNA序列变异（见表1）。
被视为SNP的变异必定发生于至少1%的人群中。
SNP约占所有人基因变异的90%，发生于共300万个碱基人基因组中的每100－300个碱基。
SNP可发生于基因组的编码（基因）和非编码区。
根据广泛使用的定义，SNP可被分为以下4级：1级 SNP包括C/T和G/A转换，由此生成C::G和A::T同质双链以及C::A和T::G异源双链。
2级SNP（C/A和G/T）包括生成C::T和A::G异源双链的颠换。
3级SNP（C/G）生成带有C::C和G::G异源双链的C::G同质双链。
4级SNP（A/T）生成带有A::A和T::T异源双链的A::T同质双链。
在可能存在的单碱基多态性中，A突变成T的 4级SNP是最难解决的，因为纯合基因型在其TM中的差异最小（通常仅约为0.2°C）（有关在LightCycler® 480实时PCR系统上成功检测4级SNP的示例请参见参考文献3,6）。
在对特异性SNP做基因分型之前（如采用测序或探针基因分型法，详见第2节），通常先扫描整个基因或某些亚片段，查看在相关区域是否已产生之前未知的变异。
采用PCR扫描，对于没有出现任何未知变异的区域则不必进行测序，因此可减少测序样本的数量及成本。
表1：单核苷酸多态性另一方面，实时PCR基因分型还常被用来验证之前在测序或微阵列平台上得到的结果，此方法能从少量样本研究全基因组转换成更有针对性的目标区域和更大量样本数量的研究。
1基因变异分析方法概述在许多基因变异研究中，为了获得大量特征的标记物，必须对大量个体进行基因分型。
已知SNP的等位基因必须正确识别和称呼，同时必须检测出新产生的突变。
只有稳健可靠、无需大量优化就能快速制订、操作简便、可自动化和可扩展的方法才称得上是理想的基因分型方法。
除极少数方法外，现有的所有基因分型技术都是从PCR扩增入手的。
在大部分此类技术中，第一步是对预期的含SNP区域进行PCR扩增，以提高测定的特异性和灵敏度。
在接下来的步骤中使用的方法取决于测定的目的是发现扩增区域的未知突变（基因突变扫描），还是检查是否存在之前的实验（基因分型）中相同设置（相关样本的靶区域）下描述的SNP。
基因扫描对基因分型用来检测已知突变最常用的基本方法是利用酶裂解水解探针进行的终点法基因分型。
更高级的方法是利用杂交的HybProbe或SimpleProbe探针进行的熔解曲线法基因分型。
基因扫描用来发现含有靶基因的扩增子中的新突变。
可通过加入饱和的DNA结合染料在高分辨率下分析此类扩增子的熔解行为，方便地进行此类扫描。
小窍门当结合DNA硫酸氢钠改良方案时，此类高分辨熔解法也适用于甲基化模式研究（参见MS-HRM的优缺点）以及单基因甲基化研究的亚硫酸氢钠测序（参考文献1）。
2基于实时PCR的不同基因分型和基因扫描法概述.实时PCR系统的主要特征是能显示覆盖整个PCR过程的扩增曲线。
其曲线结果来自于针对靶序列结合的水解探针裂解，或来自于在序列特异性杂交探针中观察到的熔解现象。
根据所用的检测形式，利用扩增过程的不同部分来显示基因型信息。
当使用的是等位基因特异性水解探针时，其裂解产生的信号将在扩增中积聚，其终点值可用来判定是否存在基因型（见表3左侧部分）。
相比之下，熔解曲线分析是在PCR之后进行的，由此生成的数据可为其产物的熔解行为提供更详细的信息，帮助识别特异性SNP 等位基因或等位基因的不同组合（见表3右侧部分）。
上述两种方法的详情请见下一节。
表3：采用不同基因分型方法来分析实时PCR法不同部分生成的荧光信号。
3检测已知突变1. 基本方法：终点法基因分型终点法基因分型采用的是水解探针（有关这一探针形式的解释参见附录1）。
每个探针包含2个荧光标记，一个荧光指示剂和一个荧光淬灭剂，彼此紧靠。
终点法基因分型采用两个序列特异性探针，只在检测等位基因 X和等位基因 Y并为其标记两种不同的指示剂染料。
标准设置FAM染料检测出等位基因 X同型的样本。
VIC/HEX染料检测出等位基因 Y同型的样本。
终点法基因分型基于双色测定法。
通过PCR扩增收集数据。
但是，仅利用这两种指示剂染料的终点信号强度来识别不同的基因型。
染料相对强度可通过散点图清楚地显示出来，简化了对纯合X、纯合Y和杂合样本的识别。
Allele x sampleHeterozygous sampleAllele y sample表5：信号强度分布相似的样本被集合成一个组。
可把每个组视为一种基因型。
通过双通道（两种染料）检测每个样本的强度。
（使用LightCycler® 480 软件终点法基因分型模块。
）45480小窍门采用HybProbe 或SimpleProbe 探针的熔解曲线分析是用于研究已知变异的可靠方法（有关此类探针的详情解释参见附录1）。
无需使用等位基因特异性引物或探针；同一个探针序列可用于已检测SNP 的所有等位基因（通常为两个，但有时更多）。
随着序列特异性供体探针和受体探针在目标DNA 上紧挨着结合，在FRET 过程中生成相应的荧光信号。
由于在熔解曲线分析过程中温度上升，探针从模板DNA 上脱落，使荧光信号减弱。
在探针识别区域中发生的单碱基变化将使探针和目标DNA 单链结合的复合物发生热不稳定。
因此，有序列差异（SNP 等位基因）的扩增子的熔解温度（Tm ）也不同。
由此可从熔解曲线形状中获得基因分型的信息。
2. 高级方法：基于熔解曲线法的基因分型7: LightCycler ® 480软件中的熔解曲线基因分型模块把熔解过程相似的样本集合成一组，并把每个组识别为一个基因型。
TemperatureMismatchPerfect Matchallele xheterozygousallele y6480终点法基因分型是一种可快速设置且无需优化的基本方法。
此类测定可由不同的供应商提供，也就是说一般情况下用户不必费心进行测定设计。
对许多目标DNA 来说，其即用型引物和探针在市面上都有售，且可在标准PCR 条件下使用。
因此使用水解探针的终点法基因分型作为基本方法得到了广泛使用；一体化的反应混合液使用方便，结果解释简洁明了。
但是，通常在每次测定中只能检测出一个突变，也就是说该技术不适用于单倍体分型（对被同一探针覆盖的相邻SNP 的结合展开研究）或含有2个以上不同等位基因的SNP 。
而且，该方法通常在出现非预期的新突变时也可能会失效。
最后也很重要的是，这种方法要求发生生物化学反应，而不是类似熔解曲线分析的生物物理学反应，因此可能容易被水解反应不理想的实验条件（如样本制备不纯）所干扰。
相比基本的水解探针分型，更高级、更灵活的熔解曲线基因分型分析能进一步详细了解复杂的基因群体。
这种方法可组合分析多个变异位点（如单倍体分型）。
当用在多重测定中时，该方法可检测出多个SNP 。
熔解曲线基因分型可检测新突变这一优点也有据可循（参考文献8,14）另一方面，熔解曲线分析需要仔细进行探针设计，确保探针序列至少覆盖一个SNP ，且每次测定都要优化。
此外还提供配套的软件解决方案（如LightCycler®探针设计软件）及技术支持（参见 ），帮助新手研究者更快掌握这种方法。
3. 基本方法和高级方法的利弊小窍门检测未知突变1. 原理和定义：基于高分辨率熔解曲线的基因扫描通过在PCR之后的高分辨率条件下收集到的熔解曲线数据，在不同用特异性探针的情况下，便可获取未知突变有关的信息。
高分辨率熔解法（HRM）只需用到PCR试剂，用于相关基因扩增的简单引物对，饱和DNA结合染料，以及一台精准的实时PCR仪。
LightCycler® 480 实时PCR系统的软硬件和试剂都已针对此类要求进行优化。
当存在SNP（通常为杂合）时，将在PCR、熔解和重退火后出现同源和异源双链DNA。
由于杂交链之间的序列不匹配，异源双链DNA的熔解温度不同于同源双链DNA。
当使用饱和DNA结合染料，如LightCycler® 480 ResoLight时可检测出熔解温度上的差异（表8和9），可检测出在PCR过程中形成的异源双链（如当待测样本与特定的突变杂合时）。
所以其应用范围比其他较传统的DNA染色染料－如SYBR Green I更为广泛。
因其对PCR扩增酶不具有毒性，因此染料的高浓度对PCR无影响。
高浓度染料完全掺入样本中的dsDNA。
因此，当在熔解过程中染料分子脱离dsDNA时，它们再度与其他空置位点结合的机会微乎其微。
这使得熔解过程高度相似，产生的信号也很强。
在此种条件下，熔解曲线即使出现很小的变化也会使荧光信号产生轻微但可重现的变化。
当在差异图中显示时，熔解曲线数据将识别出样本不同集群（如纯合野生型、纯合突变型和杂合型）（表10）。
homozygousmutant(homoduplexes)homozygouswildtype(homoduplexes)heterozygous(homo- andheteroduplexes)A B C D表 10：PCR后高分辨率熔解生成的荧光信号分析差异图。
对原始熔解曲线数据进行归一化处理，形成差异图。
由此产生的差异图根据其熔解曲线的形状，把样本归入不同的组。
（具体示例参见LightCycler® 480基因扫描软件模块）78为确保基因扫描测定的有效性，必须仔细设计该实验。
我们建议按以下步骤计划和执行高分辨率熔解实验：2. HRM 测定优化表 8：与双链DNA 结合的饱和染料。