宏基因组实验计划
宏基因组项目报告
宏基因组项目报告一、引言宏基因组研究是一种利用高通量测序技术对不同环境中微生物的DNA进行直接测序，从而获得未经培养的微生物群落的全基因组信息的研究方法。
宏基因组项目旨在揭示细菌、真菌等微生物群落的复杂性和多样性，以及它们在各种环境中的功能特征，为人类提供更多关于微生物界的了解和应用。
二、项目设计本次宏基因组项目选择了一个自然河流水样品和一个土壤样品作为研究对象，采用Illumina HiSeq平台进行测序。
首先，对样品进行DNA提取，并进行多次PCR扩增，得到足够的片段数目进行测序。
然后，对测序得到的片段进行质量控制和去除低质量序列、接头序列和宿主DNA。
之后，使用比对软件将高质量测序读序比对到相关数据库，如NR、Kegg等，分析序列的生物学功能、多样性等。
三、结果分析1.宏基因组的物种多样性分析通过序列比对和分类，我们发现水样品中含有大量的细菌，真菌和病毒等微生物，其中以细菌为主要成分。
而土壤样品中细菌的数量明显高于真菌和病毒。
此外，从解析结果中，我们还发现了一些未知物种，这些物种可能是新的微生物，为我们探索未知微生物的多样性提供了线索。
2.宏基因组的功能分析通过对序列的注释和比对，我们可以了解微生物群落的功能特征。
我们利用Kegg数据库进行宏基因组的功能注释和代谢通路分析，发现了许多参与碳、氮、磷循环等重要代谢通路的微生物，并对其基因编码产物进行分析和功能预测。
此外，我们还发现了一些与环境适应性和生存竞争力相关的基因。
3.宏基因组的群落结构分析通过对序列的分析，我们还可以了解微生物群落的结构特征。
我们使用OTU(Operational Taxonomic Unit)对宏基因组的群落结构进行了描述和分析，发现了丰度较高的菌群，并推断其在不同环境中的生态角色和相互之间的相互作用。
此外，通过构建菌群之间的共生和拮抗网络，我们可以了解不同微生物之间的互动关系，从而进一步探究宏基因组在生态系统中的功能和影响。
宏基因组学技术实验流程
宏基因组学技术实验流程
宏基因组学技术是将一个物种的细胞基因组测序后，利用生物信息学方法从测序结果中揭示细胞基因组结构、功能结构及动态变异的重要技术。
宏基因组学技术为广大生物学家开辟了一条全新的活跃的研究道路，丰富了多学科间的联系，有助于深入了解我们不同物种及地理环境间的关系。
宏基因组学技术实验流程主要包括以下几步：第一步，准备实验样本，利用细胞培养或蛋白质学实验制备实验样本；第二步，实行基因组测序，采用高通量测序技术进行基因组测序；第三步，数据分析，对测序结果进行深度分析，使用生物信息学工具分析表达水平、进化变异等；第四步，科学解释，将所得结果进行深入的科学解释，结合生物学原理和其它实验结果，揭示整个分析问题的本质和规律。
宏基因组学技术可广泛应用于多学科之间，特别是对大规模基因组技术的累积分析，能够更准确而精确地确定不同物种或地理环境间的变异和关联，为生物财主类的比较和研究提供了高学术价值的分子标记和高拆分率的研究方法，在现代生命科学研究过程中发挥着重要作用。
中国高校和高等教育机构在推广运用宏基因组学技术研究中可以充分发挥学术积极性和多学科跨界思维的特点，为进一步开拓和拓展现代生命科学研究打下坚实的基础。
宏基因组文库构建
宏基因组文库构建宏基因组文库构建分子微生物生态学的研究业已证明环境中大量存在未能培养的微生物，某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1%，超过99%的微生物尚未能培养(1)，可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。
为了突破上述限制，充分挖掘和利用微生物的多样性基因资源，人们在寻找新技术方法上倾注了极大的热情。
“宏基因组（Metagenome）”是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和（2 ）。
宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。
目前已采用土壤、海水、海洋浮游生物、海棉、甲虫、人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，已筛选到的生物活性物质有各种酶类及一些次生代谢产物，包括脂酶/酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、膜蛋白、4-羟基丁酸代谢酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等（3、4、5）。
一、实验原理1、基本原理从环境样品中直接提取总DNA，经纯化后部分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化替代宿主细胞，形成一个重组DNA文库即宏基因组文库。
获得的克隆子根据宿主细胞获得的新功能进行筛选, 或用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段，加上表达调控元件后使目的基因表达，从而获得产物。
2、载体促使宏基因或基因簇在重组克隆子中表达或提高表达量，载体起着重要作用。
载体的选择主要是针对有利于感兴趣的目标产物基因的表达、目标基因的扩增及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。
1）大片段插入载体由于很多微生物活性物质是其次生代谢产物，代谢途径由多基因簇调控，尽量插入大片段DNA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必要的。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组-PPT
Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Saccharomyces
2.环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复 获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发 现新的生物物种。 发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制， 帮助极端环境的污染修复。 从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他 活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代 原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、 有害有害化合物、重金属。
（1）基于序列的筛选方法
②.焦磷酸测序( Pyrosequencing)
焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础 上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔，将基因组 DNA 进行随机切割，批量地进行整个测序反应， 能够在相同的时间内破译 6×106组以上的基因组 序列，比 Sanger法要快100倍，提高了测序的效 率。
底物诱导基因 表达法SIGEX screening
1.样品中DNA的提取和富集
采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中 常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物 1213
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案是一种用于研究病原微生物群落内基因组的技术方法。
它通过测序病原体样本中的DNA或RNA，生成大量的测序数据，并利用生物信息学分析方法来解析样本中存在的病原体群落。
该实验方案的实施步骤如下：
1. 样品采集与制备：首先，需要从疾病患者或环境中收集病原体样品。
样品可
以是血液、组织、粪便等。
接下来，需要对样品进行处理，包括提取DNA或RNA，并进行质量检测。
2. 文库构建：经过样品制备后，将提取得到的DNA或RNA进行文库构建。
这一步骤包括DNA片段化、连接测序引物、PCR扩增等。
构建好的文库将被用于下
一步的测序。
3. 测序：使用高通量测序技术，如Illumina测序平台，对构建好的文库进行测序。
该步骤将产生数百万条短读长序列，形成所谓的测序数据。
4. 数据分析：测序完成后，需要对产生的测序数据进行生物信息学分析。
这一
步骤包括序列拼接、质控、去除人类宿主序列、物种注释等。
通过这些分析方法，可以得到病原体群落的基因组组成和功能特征。
5. 结果解释和研究：最后，根据数据分析结果，可以解释病原体群落的组成和
特征。
这对于研究病原体的致病机制、药物抗性等具有重要意义。
病原宏基因组测序实验方案为研究者提供了一种全面了解病原体群落结构和功
能的方法。
它可以用于研究不同疾病的病原微生物组成，探究其与疾病发生发展的关系，并为疾病的预防、诊断和治疗提供重要依据。
同时，这一技术方法也有助于了解病原体的毒力机制、耐药性乃至新病原体的发现。
宏基因组
Transform methods transduction transduction transduction
transformation transformation
宏基因组（广义）
广义宏基因组是指特定环境下所有生物 所有生物 遗传物质的总和，它决定了生物群体的 生命现象。它是以生态环境中全部DNA 作为研究对象，通过克隆、异源表达来 筛选有用基因及其产物，研究其功能和 彼此之间的关系和相互作用，并揭示其 规律的一门科学
宏基因组（狭义）
狭义宏基因组学则以生态环境中全部细 全部细 菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它 菌和真菌 不是采用传统的培养微生物的基因组， 包含了可培养和还不能培养的微生物的 基因，通过克隆、异源表达来筛选有用 基因及其产物，研究其功能和彼此之间 的关系和相互作用，并揭示其规律
底物诱导基因表达筛选 (substrate-induced gene-expression screening，SIGEX) 缺点： 缺点：
目标基因的结构性和适应性很敏感， 无法用于分析不能进入细胞质的底物， FACS对进样设备的要求也比较高； 代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都 相邻； 有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他 因子的诱导， 有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的， 有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表 达
λphage
Cosmid,fosmid
24 35~45 70~100 120~300 100~300
linear circular circular circular circular linear
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宏基因组实验计划
————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期：
宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划
起草人：李浩宇
宏基因组学研究方向及意义
研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。
发掘:环境应激和应答基因的多态性。
探究：多态性基因的功能。
实验大体步骤:
I.环境样品的采集:
1）避免人源污染,采样的器具都要高温灭菌,采样过程中要戴手套。
2) 样品的迅速处理保存。
有条件最好用液氮冷冻运输,没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。
带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品,迅速用预冷缓冲液（多为PBＳ)重悬，离心收集沉淀。
分装成小份,冻存于液氮或者‐80 ℃冰箱中，避免反复冻融。
3）如果后续用间接法提取总ＤＮA 的话,此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。
IＩ.DNA提取方法的选择：
总ＤNＡ的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。
直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。
间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。
两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。
直接提取法的优缺点:直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等）总DNA 的试验中。
其最大的优点在于得率高,在某些环境样品总DNA 提取实例中,比间接提取法高数倍至数百倍。
造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DＮA;二是许多微生物与基质形成复杂的结构,间接提取法不易对其进行分离。
在样品较珍贵时多采用此法。
其缺点同样明显,所得DＮA的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得ＤNＡ呈现黄褐色甚至黑色。
可以考虑MoBiｏ和Ｅpicenｔre的DＮＡ提取的商业试剂盒（主要用于提取土壤样品）。
间接提取法的优缺点:间接提取法则既可以用来提取固相样品总ＤNA也可以用来提取液体样品总DNＡ。
在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。
与直接提取法刚好相反,其最大的优点在于提取ＤNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DＮA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。
其缺点是DＮA 得率低。
ﻫ
土壤ＤNA 直接提取法：
(1)从超低温冰箱中取出保存样品(5 ｇ）;
(２) 于室温融化；
（３)加入1３.５ml CTAＢ抽提缓冲液和5０μl 蛋白酶Ｋ贮存液;
(4) 离心管于37oC ２25 ｒpm 水平振荡30 mｉn;
(５) 加入1．5 mL20%ＳDS;
(6) ６5oC 水浴2 h,每隔15 mｉn 轻轻颠倒数次;
(7) 室温6,0０0g 离心1０min,收集上清液,转移至一个新的50ml 离心管中;
(8) 沉淀中再加入4．5 ｍｌ提取液和０.5 ｍl 2０%SＤS，轻轻涡旋至混匀;
(9)浸入液氮中冷冻3 mｉｎ后，于沸水中煮沸3 min;
(１0)室温6,000g离心10 miｎ，收集上清液，与上次上清液合并；
(1１）重复(8)、(９)、(1０)一次;
(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚:氯仿(1:１v/v) 混合,摇匀后于4 ℃
12，０0０g 离心10 min；
(１3) 将上层水相转移至一新的50 ｍｌ离心管中,加入等体积的氯仿：异戊醇（24:１)，混匀后于4℃１２,000g 离心10 miｎ；
（14）再次转移上清至一新的离心管中，加入0.６倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h; (１5）室温12,00０g 离心２０min；
(16) 收集沉淀,用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入１ml TＥ，于4 ℃放置过夜,分装保存于‐20℃。
实验过程中的注意事项及一些技巧:ﻫﻫ(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔,避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。
ﻫ(2）用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉,避免机械剪切。
ﻫ(３)酚氯仿抽提时,中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。
(4）异丙醇沉淀时不要放在低温,０.7 倍体积室温沉淀足够了。
(5) ＤNA溶解时可以放在4℃静置过夜,次日离心取上清去除多余杂质。
ﻫ(6)水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。
水样DＮA 间接提取法:
(1)抽滤的方式浓缩采集到的水样。
（2)采取差速离心取得水样中的菌体。
（3)取得微生物后进行裂解提取。
此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。
例如:用多少的水样进行浓缩，差速离心的转速选择。
会不会有ＤNＡ的丢失等等。
Ｅｐｉcｅｎtre推出了宏基因组DNA分离试剂盒（MｅｔａgｅnｏｍiｃDNＡＩｓoｌa
ｔion Kit for Watｅr),能从水样中分离已随机剪切的,可直接用于fosmiｄ克隆的DＮA片段。
此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物(包括革兰氏阳性菌)中提取4０ｋb大小的DNA。
提取的DNＡ可立即进行末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Ｅpiceｎtre的ＰCC １ＦＯS载体上。
优势:
１．无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。
2.无需纯化柱或酚/氯仿提取。
３.产量更高，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。
4．Fosｍｉｄ载体与DＮA的克隆只需要90分钟。
下图为方法与流程：
粗提DＮA 的纯化
采用直接提取法提取的总DNA或多或少都含有腐殖质的存在。
它的存在对后续的分子生物学操作会有影响,时常会导致ＰＣR 扩增不出来,酶切困难,连接转化率低。
需要进行纯化。
纯化的方法包括:胶回收，柱纯化,电泳/电洗脱，梯度离心。
a 胶回收
胶回收最大的优点在于快捷,可以在很短的时间内完成。
纯化后的DＮA往往能够满足ＰCR要求。
但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DＮA分子造成机械损伤,使得DNＡ弥散，完整度下降。
如果后续的实验室分析16S r DNA,则这种纯化方式不失为一种好方法。
ﻫ
b柱纯化
柱纯化相对于胶回收来说更为快速,十几分钟内可完成。
与胶回收相比，其纯化效果要差一些。
但通常情况下，纯化之后的ＤNA也能够满足ＰCＲ需求。
这种方法也会造成ＤNＡ分子的机械损伤，使得DNA 弥散,完整度下降。
ﻫ
c 电泳／电洗脱
电泳／电洗脱法相对于前两种有很多优点：其一,其价格低；其二,整个过程都很温和,能够保证DNA 的完整性;其三,纯化后的DNA 纯度较之前两种要好一些。
但是其亦有些许不便:其一,过程耗时长，包括透析袋的准备,电洗脱,洗脱液的浓缩等;其二,DNＡ损失量较前两种大，透析袋上会残留DNA。
如果样品不是很珍贵，并且后续要进行Metａgenoｍic 研究，这种方法不失为一种好方法。
如果有脉冲场凝胶电泳系统,用此方法可以得到高纯大片段DNＡ,可以满足后续的metagenomiｃC／Fosｍｉｄ文库构建。
d 蔗糖/氯化铯密度梯度离心
如果实验室有超速离心机(1０0,０0０ｇ以上),那么这种方法无疑也是一种好方法。
与电泳电洗脱法相同，这种方法在连续介质中对DNA 及杂质进行分离，可以很好的纯化DＮA。
纯化得到的DNＡ经过低熔点凝胶电泳切胶回收,可以得到高纯度大片段的DNA，可以满足后续的ｍｅtagｅnｏmｉc C／Fｏｓmｉｄ文库构建。
纯化质量的检测
ＤNＡ纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：其一,完整度判断；其二,纯度判断。
a完整度判断
完整度判断同前所述,千万要记得的是加纯化之前的DＮA样品做对照。
结果可以告诉我们纯化得率及完整度。
同样，最好能跑脉冲场凝胶电泳。
b 纯度判断
纯度判断通常可以采用两种方法:分光光度计法和PCR 扩增法。
分光光度计可以测定双链D ＮＡ在2６0nｍ处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。
通过不同波长吸收值的比,可以对DNＡ纯度做出判定。
通常这种方法由于灵敏性较高,所以在存在杂质时误差较大。
IIＩ．所提ＤNＡ完整性检测
ＤNA 的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。
最好采用0．8％琼脂糖凝胶电泳,低电压长时间跑。
至少要用laｍbｄa DＮA／Ｈｉnd III 做marker,如果在23 kb 处有一条完整或略拖尾的带，则证明DNA 完整性尚好。
如有条件,可以采用脉冲场凝胶电泳对提取ＤNA的完整度进行分析。
用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个ｍaｋeｒ，至少还应该有完整lambｄａDNA (约４8 kb)充当另一个makeｒ。
以上为送测序前样品的采集，DNA的提取,验证等前期处理与方法的大致步骤与方法。
Ｉllumina所进行的测序是由Gｅnome Ａnaｌyzer测序仪所完成的：
以上为GenoｍeＡnalyzer技术的基本原理IV.在DNA提取,检验完成后送BGI进行后续测序。