菊花组织培养

摘要：菊花在花卉生产中占有重要地位，而花瓣组织培养，可以缩短植物生长周期，还可使再生植株特性的变异更加丰富多彩，在菊花育种研究中涉及的细胞杂交和基因转移等生物技术的应用中具有重要意义[1]。

本实验是利用黄色菊花花瓣为外植体。

在诱导培养中，控制6-BA的浓度1.0 mg/l ，NAA的浓度0.3mg/l，将已分化的细胞脱去分化状态，使其恢复到未分化的分生状态，然后进行再分化，最终形成完整的植株。

关键词：菊花激素诱导愈伤组织分化
1．前言
1．1实验背景
植物组织培养（tissue culture）是二十世纪初兴起的一项高新生物技术，至今已经有一百多年的历史。

和植物组织培养的历史相比，中国的在这方面的研究起步算是比较早的，在二十世纪四十年代在这方面就有所研究，但是大范围的发展起来还是始于二十世纪七十年代的花药培养。

利用组织培养可以快速繁殖保存某些稀有植物或有较大经济价值的植物，挽救濒于灭绝的动植物，还可以为细胞杂交和基因转移等生物技术在育种研究中的应用提供帮助[1]。

随着人们生活质量的提高，人们甚至利用组织培养的花卉等发展装饰产业，作为一项实验技术，植物组织培养有着十分广阔的前景，如今已成为了生物领域里面十分活跃的技术[2~3]。

1．2实验目的
学习利用外植体诱导形成愈伤组织和愈伤组织分化培养的方法；了解植物组织培养的操作程序；初步掌握植物组织培养的关键技术（培养基配置、灭菌、无菌操作、培养等）。

1．3实验原理
植物组织培养是指植物的器官、组织或细胞，在人工控制的条件下，接种在人工合成的培养基上，能发育成完整的植株。

实现实验成功的基础理论是植物细胞的全能性，即植物的任何一个体细胞，具有完整的细胞核，具有整套的遗传信息，在一定的条件下可以发育成完整植株。

全能性的实现是通过脱分化和再分化过程来实现的：
用于培养的器官、组织、细胞通称外植体，它们的细胞是高度分化的，培养的第一步
就是诱导这些已经分化的细胞脱去分化状态，使其恢复到未分化的分生状态；第二步是要使这些恢复到分生状态的细胞重新分化形成植株。

一般而言，高比例的6-BA/NAA有利于芽的形成，低比例时有利于根的形成。

光照时离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响[3]。

2．材料及方法
2．1材料
2．1．1外植体
黄色菊花，是菊科菊属的多年生宿根草本植物。

菊花的品种非常繁多，叶、花型、瓣型变化很大，是植物组织培养的理想材料。

2．1．2试剂
蒸馏水，95%的乙醇，次氯酸钠，储备液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，
激素：细胞分裂素6-BA（6-苄基腺嘌呤），生长素NAA（α-萘乙酸），
其他: 蔗糖、琼脂粉等
2．1．3器材
手提式灭菌锅，无菌操作台，培养箱，冰箱，天平，平底试管，培养皿，锥形瓶，量筒，烧杯、ph试纸，酒精灯，滤纸，玻璃棒，橡胶塞，小烧杯，玻璃棒，剪刀，镊子，解剖刀，记号笔，标签纸，滤纸，报纸，棉塞，棉线等
2．1．4配制溶液的配制
2.2方法
2．2.1 外植体的制备及灭菌
2．2.1.1 MS培养基的配制
称取称取琼脂0.7g，蔗糖3.0g于250ml的烧杯中，向其中加入75ml的水溶解，再向其中加入贮备液Ⅰ5 ml，Ⅱ0.5 ml，Ⅲ 0.5 ml，Ⅳ 0.5 ml,加水混匀定容到100ml。

分装平底试管，每管20ml,调PH6.5，最后趁热分装于8支平底试管，棉塞封口。

2.2．1.2 灭菌
将培养皿、解剖刀、镊子、滤纸、锥形瓶以及分装好的MS培养基分别用报纸包好放入灭菌锅，121℃下灭菌20min。

将无菌操作台中紫外灯提前20min打开灭菌。

2.2.1．3 外植体的制备
取黄色菊花中间层的花瓣，用自来水洗3~5次，置于小烧杯中浸泡半小时，用70%乙醇浸泡15 s，无菌水清洗3次。

用含有2滴吐温80的2%次氯酸钠溶液浸泡6min，再用无菌水清洗4次。

在灭过菌的培养皿中放灭过菌的滤纸，先将花瓣上的无菌水吸干，再将其放在滤纸上切割成切割成0.5 cm×0.5 cm大小。

2．2.2诱导至愈伤组织
从灭菌锅中取出装有培养基的试管，在培养基凝固之前分别向其中加入0.1mg/ml NAA 60μl，1.0mg/ml 6-BA 20μl。

用无菌镊子将处理好的菊花花瓣分别接种于培养基中，每管3片，尽量均匀分布。

将锥形瓶的瓶口在酒精灯火焰处转动灼烧一遍，重新包扎封口，置于25℃，光照1500～2000lx的培养箱中培养20天。

2.2．3分化至未生根幼苗
2.2.
3.1配置MS培养基
在100ml小锥形瓶30ml处做上标记；按照2.2.1.1中MS培养基的配置法，配置MS培养基100ml；趁热分装到已标记好的平底试管中，封口。

2.2.
3.2灭菌
将培养皿2个、解剖刀2把、镊子2把、滤纸6片、分装好的MS培养基分别用报纸包好放入灭菌锅，121℃下灭菌20min。

将无菌操作台中紫外灯提前20min打开灭菌。

2.2.
3.3处理愈伤组织
在无菌操作台中进行，在滤纸上将愈伤组织中的发黑褐化部分切除。

2.2.
3.4分化培养
在培养基凝固之前培养基中分别加2.0mg/l 6-BA和0.2mg/l NAA，用无菌镊子将处理好的愈伤组织分别接种于培养基中，每管3个，尽量均匀分布。

置于25℃，光照1500～2000lx 的培养箱中培养。

2.2.4生根至完整植株
将长势良好的小苗转入添加0.3 mg/LNAA的MS培养基中，进行根的诱导，进而形成完整植株。

3.结果与讨论
3．1诱导培养
诱导培养基本上都分化出愈伤组织，如图3-1脱分化出大量的愈伤组织，呈一团浓绿组织，所获得的愈伤组织没有染菌情况，如图3-2少部分呈现出褐化现象。

图3-1 愈伤组织（1）图3-2 愈伤组织（2）
3.2分化培养
如图3-3菊花分化组织生长良好，有少许的嫩绿色小叶片，如图3-4部分小叶片呈褐色。

图3-3未生根幼苗（1）图3-4 未生根幼苗（2）
3.3生根培养
如图3-5、3-6幼苗底部长出少许根毛，叶片数目增多，颜色逐渐浓郁，已发育成完整植株，数天后待长势良好可移栽至适宜土壤中。

图3-5 完整植株（1）图3-6 完整植株（2）
3.1.1 讨论
实验过程中部分愈伤组织、幼苗出现不同程度的褐化现象（如图3-2、图3－4），即由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞中的代谢发生变化，酚类化合物被氧化后产生醌类化合物，这类物质是终身的，会逐步扩散到培养基中，抑制其他酶的活性，毒害整个外植体组织，导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡[4]。

结合实验实际情况，分析褐化现象可能是以下的几个方面造成的：
i.实验中制备外植体，采用多枚菊花花瓣，这些花瓣由里至外生长状态不同。

一
般菊花的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变，成龄材料一般均比幼龄材料褐变严重[4~5]，因此接种后部分试管中出现程度不同的褐变。

ii.在实验途中有几支试管倾倒在日光灯管上，可能造成温度升高。

高温促进酚氧化，培养温度越高，褐变越严重。

iii.从实验时间及其他小组情况来看，可能是菊花的培养时间过长造成。

材料培养时间过长，会引起褐变物的积累，加重对培养材料的伤害。

菊花随着培养时间的延长，褐变程度会加剧，甚至在超过一定时间不进行转接，褐变物的积累还会引起培养材料的死亡[4]。

改善褐化的方法：根据光照对褐化的影响原理，可以在采取菊花前，将接种后的初代培养的菊花在黑暗条件下培养，对抑制褐变发生也有一定的效果。

遮光抑制褐变的原因主要是由于氧化过程中，许多反应受酶系统控制，而酶系统活性受光照影响[4~5]。

但是，暗培养时间过长会降低外植体的生活能力，甚至引起死亡。

因此要注意控制暗培养时间。

4．参考文献：
[1] 李名扬等. 菊花花瓣愈伤组织原生质体培养再生植株 .农业生物技术学报（第4卷
第3期）1996.9
[2] 刘晓晴﹒生物技术综合实验﹒北京科学出版社，2009 43~44
[3] 梁红﹒生物技术综合实验教程﹒北京：化学工业出版社，2010 24~31
[4] 陈菲，李黎，宫伟﹒植物组织培养的防褐化探讨﹒北方园艺，2005
[5] 王康才.张雪琼.茅毓英杭菊花花瓣组织培养.中草药2000.9 8~10。