中山大学硕士研究生生物医学课程 转录调控基本方法共61页
转录及转录调控
（二）转录延长 1. 与原核生物大致相似，
没有转录与翻译同步的现象。 2. RNA-pol前移,核小体移位和解聚现象。
8/3/2020
核小体
RNA-Pol
转
转录方向
录
延
长
中
的
核
RNA-Pol
小
体
移
位
RNA-Pol
8/3/2020
（三）转录终止 —— 和转录后修饰密切相关。
转录终止修饰点: DNA读码框架下游的一组AATAAA和GT共同
原核生物启动子保守序列
8/3/2020
转录起始点
1、 转录开始的位置
超过90%的转录起始点为嘌呤核苷酸，在转录 起始点有一保守序列：MCATMM，A是转录 始点。 M：A或C或G
8/3/2020
—10序列
2、 —10序列，位于转录起始位点上游— 10bp左右，有一个6个碱基组成的保守 序列TATAAT，是RNA聚合酶结合的部 位，又称为TATA盒或Pribnow盒。
8/3/2020
转录起始过程：
2. DNA局部解链 RNA聚合酶挤入DNA双链中，解链长度约
12~17个核苷酸， 拓扑异构酶参与。 形成开放转录复合物(二元复合物)
8/3/2020
转录起始过程：
3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应， 形成转录起始复合物。
5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi
8/33/42020
发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元 复合物中解离出来。
8/33/52020
终止效率与 二重对称序列 （至少6bp）和 寡聚U（至少4个 U）的长短有关， 长度↑，终止效 率↑。
细胞的转录与转录调控
细胞的转录与转录调控转录是生物体中基因表达的重要过程之一。
通过转录过程，DNA 序列将被转录成RNA分子，从而实现基因信息的转换和传递。
转录调控作为机体对基因表达的精细调节机制，不仅控制着细胞内各种生物过程的进行，还决定了细胞发育、分化以及应对环境变化的能力。
本文将从细胞的转录机制以及转录调控的重要性两个方面进行探讨。
一、细胞的转录机制细胞的转录是指在DNA模板的指导下，通过RNA聚合酶酶的催化作用，将DNA主链上的一段编码或非编码的基因序列转录成RNA分子的过程。
具体而言，转录的主要过程可分为如下几个步骤：1. 酶的结合：RNA聚合酶通过特异性与DNA结合，形成RNA聚合酶-DNA复合物。
这种结合形式通常是依赖于酶与DNA特定的序列结合而发生的。
2. 脱氧核苷酸的加入：RNA聚合酶将脱氧核苷酸（dNTP）与DNA 携带的模板链上的核苷酸进行互补配对，并将其加入到新合成的RNA 链中。
3. 转录起始：在DNA的启动子区域，RNA聚合酶会寻找具有特殊序列的基因，以确定转录起始点。
4. 转录终止：当RNA聚合酶通过识别特定的转录终止信号而停止在DNA上的移动时，转录过程达到终止点，生成的RNA链被释放。
通过上述步骤，细胞内的DNA信息得以转录成为RNA分子。
这些RNA分子代表着细胞中特定基因的表达水平，可进一步在蛋白质合成过程中发挥重要的作用。
二、转录调控的重要性转录调控是细胞内对基因转录过程进行精细调控的重要机制。
转录调控的主要目的是在不同发育阶段、组织和环境条件下，使细胞能够选择性地激活或抑制特定基因的转录，从而实现细胞功能和特性的调节。
以下是转录调控的几个重要类型：1. 转录因子：转录因子是一类能够结合到DNA上的蛋白质，可以促进或阻止RNA聚合酶与转录起始复合物的形成，从而调控基因的转录。
转录因子在转录调控中起到关键作用，可以通过结合启动子区域和共激活蛋白相互作用，激活或阻止转录的进行。
2. 表观遗传调控：表观遗传调控是指通过对DNA和组蛋白修饰状态的改变，来调节基因的转录过程。
简述真核生物基因的转录过程和调控方式
简述真核生物基因的转录过程和调控方式生物基因是组成生物体的基本结构，可以被视为生物的基本构成单位。
它们的转录和调控是生物体的发育、进化和功能的主要驱动力。
真核生物基因的转录过程是指，含有信息的DNA分子由转录因子催化其转录成另一种碱基序列的核酸分子，如mRNA，而调控方式是指DNA 转录产生的mRNA是否以及如何有效地被表达，从而影响有效基因表达。
因此，真核生物基因的转录过程和调控方式对研究生物体的发育、进化和功能具有重要意义。
首先，真核生物基因的转录是由转录因子酶催化完成的。
发现DNA序列中的转录因子酶结合位点后，可以触发转录过程。
一般情况下，转录因子可以分为强相关转录因子和弱相关转录因子。
强相关转录因子可以直接结合基因起始子，而弱相关转录因子是可以互相协同作用的，只有多个弱相关转录因子聚集起来，才能结合基因起始子，激活转录过程。
其后，RNA聚合酶结合到基因起始子，并开始从DNA 模板复制RNA产物，并在新复制体上完成除去框架。
一旦翻译完成，mRNA可以被分泌到细胞外或运输到另一个细胞，在那里充当蛋白质模板结构。
其次，真核生物基因的调控方式是指DNA转录产生的mRNA是否以及如何有效地被表达。
重要的是要将mRNA表达调节到正确的水平，以确保细胞以有效的方式表达指定的基因。
真核生物基因的调控方式包括转录和转录后调控，分别由转录因子和调控因子来实现。
转录有两种形式，一种是基因质量调控，它控制基因的转录速率；另一种是基因转录路径调控，它控制基因表达特定蛋白质的转录路径，并可能与遗传学相关。
此外，转录后调控可以分为翻译调控和信使RNA修饰调控，它们可以识别和处理mRNA的表达，改变mRNA的稳定性以及调节蛋白质表达水平。
最后，真核生物基因的转录过程和调控方式是研究生物体发育、进化和功能中重要的因素之一。
转录过程和调控方式可以控制基因的表达水平，从而影响有效基因的表达，对细胞的发育和功能有重要的作用。
例如，基因的转录和调控可以影响基因组的结构变化，这可以帮助研究生物体的发育和进化过程。
转录调控的基本机制与研究方法
转录调控的基本机制与研究方法转录调控是生物学中一个重要的研究领域，它涉及基因表达的调控机制，尤其是转录过程中的调控。
本文将介绍转录调控的基本机制和研究方法。
一、转录调控的基本机制转录调控的基本机制是在基因表达过程中调节RNA聚合酶的选择和结合，从而控制基因转录的速度和效率。
RNA聚合酶是开链酶，它可以将DNA分子的两条链分离，然后加入新的核苷酸，从而合成RNA。
RNA聚合酶在转录时，需要与调控因子一起联合作用，才能在某些区域上停留和转录，而在其他区域上则避免转录。
转录调控的机制有几种：1. 转录因子转录因子是蛋白质，它可以控制RNA聚合酶在DNA上的结合位置和转录速度。
转录因子有许多类别，包括激活子、抑制子、组蛋白修饰因子等。
激活子可以促进转录过程的进行，而抑制子则可以扼杀转录活动。
组蛋白修饰因子则可以改变DNA的化学信息，从而影响RNA聚合酶的选择和结合。
2. RNA剪接RNA剪接是指，在RNA分子合成的过程中，剪去不必要的结构，并将不同的RNA片段组合成一个已知的顺序。
剪接的目的是产生不同类型的mRNA分子，这些分子可以编码不同类型的蛋白质。
RNA剪接的过程对调控基因表达和转录发挥了重要作用。
3. RNA降解RNA降解是指，由于某些成因或外部原因，RNA分子发生了错误或变异，从而被分解成较小的片段。
降解的RNA片段可以对基因表达和转录产生不同程度的影响。
二、转录调控的研究方法转录调控的研究方法多样，具体包括以下几种：1. ChIP-Seq技术ChIP-Seq是测定蛋白质结合到某一具体DNA区域的技术。
该技术利用大量的DNA片段测定特定蛋白质结合的位置和频率，从而确定蛋白质在基因表达中的作用。
2. RNA-Seq技术RNA-Seq是测定RNA中所有的转录产物和表达谱的技术。
利用RNA-Seq技术，可以测定某个组织中基因的表达量和转录利用率。
该技术可广泛应用于基因功能研究、癌症早期诊断和开发新药等领域。
转录调控讲义-Transcriptional Regulation
Most master regulators in cell fate determination are transcription factors
iPS cells
Oct4 Sox2 Myc Klf4
Fibroblasts Differentiated cells
GENES MUST BE EXPRESSED TO REVEAL THEIR BIOLOGICAL ACTIVITIES
Sex determination
Growth defects
Cell memory
Ageing
Speciation
What control these gene expression?
Cis-acting control elements of a gene
(a) Genes of multicellular organisms contain both promoter-proximal elements and enhancers (collectively referred to as cic-acting control elements) as well as a TATA box or other core promoter element(s).
RNA viruses: Influenza [high mutation rates] HIV [reverse transcription]
Protein as genetic information (Protein conformation: prions--mad cow disease)
Advantage: sensitive
Disadvantage: requires stable complex; little information about where protein is binding on DNA
中山大学硕士研究生生物医学课程 转录调控基本方法
感染细胞类型
表达丰度 表达时间
滴度 克隆容量
高水平表达 快（1-2 天）
滴度高达1012pfu/ml
中水平表达 慢 ( 2-4天 )
滴度最高可达109 TU/ml
高水平表达 慢
滴度最高可达105 TU/ml 可插入不超过5kb的 外源片段，滴度随 插入片段长度增加 而降低 低免疫原性
可插入高达8kb的外源 可插入不超过10kb的 片段，滴度随插入片 外源片段，滴度 段长度增加而降低 随插入片段长度 增加而降低 高免疫原性 低免疫原性
Chang-Deng Hu et al. 2002, Mol Cell
凋亡时BiFC增多
Fos↑→BiFC↓, Fos↓→BiFC↑
53
Fos抑制c-Jun/ATF2二聚体形成
54
Fos保护神经元
55
56
转录调控研究常用方法
1. 检测基因的表达水平： mRNA：RT-PCR
Protein：WB，ICC，IHC，IF
黑质多巴胺神经元凋亡 ……
6
7
c-Jun的靶基因是什么？
Fas L
Mol Cell Biol 1999
Mol Cell Neurosci 2001
J Cell Biol 2003
Bim
Neuron 2001
Neuron 2001
Neurosci Lett 2005
8
9
寻找c-Jun促凋亡靶基因 －基因芯片方法
Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点
dp5启动子上的ATF位点对其转 录活性是否重要？
报道基因
ATF位点是dp5上调的关键位点
23
c-Jun是否直接结合在dp5启动 子的ATF位点上？
生命科学中的转录调控研究
生命科学中的转录调控研究随着科技的不断进步，生命科学领域的研究也在不断深入。
其中，转录调控研究是生命科学中非常重要的一个领域。
转录调控研究的目标是探究基因表达的调控机制，揭示基因调控网络的组成和工作原理，为基因治疗、肿瘤治疗等提供重要的理论依据和实践指导。
一、转录调控的基本概念所谓转录调控，就是指在转录过程中，通过内部或外部信号的调控，控制基因启动子的结构和功能，诱导或抑制转录因子的结合，从而调节基因表达的发生。
在人类体内，几乎所有的细胞都具有相同的基因组，但每种细胞的表观基因组特征却因此而不同，这主要得益于转录调控的作用。
转录调控的具体机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等。
二、转录调控的研究方法目前，转录调控的研究方法主要包括基因组学、转录组学、蛋白质组学等。
其中，基因组学是一门研究基因组特征、基因组组装和基因组进化规律的学科，同时也是转录调控研究的重要方法之一。
在基因组学的研究中，我们可以采用ChIP-Seq、ATAC-Seq 等技术，快速地鉴定出基因调控元件的位置、计算基因组修饰水平等。
这样，我们就可以更好地了解基因组的结构和功能，从而为基因调控的研究提供良好的基础条件。
三、转录调控的应用前景基因表达的变化与很多疾病的发生发展密切相关，如某些肿瘤的发生就与基因的异常表达有关。
可以说，探究基因表达的调控机制是肿瘤发生机制研究的重点和热点之一。
在以往的肿瘤基因组学领域，我们主要关注的是散在的突变点，但只靠基因突变，并不能真正探究疾病的本质。
而随着近年来科技的不断更新以及方法的拓展，我们逐渐认识到了更深层次的问题。
如果我们能够理解转录因子网络的调控机制，再结合基因突变信息，就有可能对肿瘤发生机制的研究作出更深入的贡献。
总之，转录调控研究是生命科学领域中的一个重要领域。
通过对转录调控的深入研究，我们不仅能够了解基因的组成和功能，还可以深入探究基因的表达调控机制，为基因治疗等领域的实践提供重要的理论指导。
miRNA调控和转录调控的生物学机制
miRNA调控和转录调控的生物学机制在细胞的生物学过程中，miRNA调控和转录调控起着至关重要的作用。
两种调控机制在细胞的基因表达中都起到了至关重要的作用，而且是相互作用的。
这两种调控机制都可通过生物技术手段进行驯化，已经成为生命科学研究中的一个重要领域。
miRNA调控的生物学机制是：miRNA是一种长度为20-25小的RNA分子，它可以与mRNA相结合，抑制靶基因翻译，从而影响其表达。
miRNA调节基因表达是通过RNA干扰途径来实现的: miRNA结合到靶基因RNA上，与靶基因RNA蛋白合成的核心体相结合，使该基因RNA失去翻译能力并催化裁剪过程。
这样，基因的表达量在RNA的水平上被调控。
miRNA在细胞分化、增殖和凋亡中起着重要的调节作用，因此它们的失调与一系列疾病的发生有关。
与miRNA调控相对应的是转录调控，它可以透过质控效应与miRNA调节互动，影响基因的表达。
转录调控基本上可以分为两种方式：转录因子对启动子的结合，以及与辅助因子的相互作用。
转录因子是一种结构多样、大小不等的蛋白质，它可以依靠特定的区域与特定的DNA序列结合，形成蛋白质-DNA复合物，同时还包括泛素化修饰、乙酰化修饰等。
辅助因子的任务是与转录因子配合，帮助转录因子在基因的启动子区域依附形成更稳定的复合物。
转录调控的研究领域本质上就是分析细胞的基因识别和维持生物平衡的系统。
值得一提的是，miRNA调控和转录调控都在对各种疾病的发生、发展和治疗佐证。
举个例子，一些miRNA的表达水平异常会导致人类癌症的发生和发展，甚至会影响患者的预后。
此外，转录因子的因子突变和缺失可能导致遗传性和染色体异常性疾病的发生。
基于以上分析，可得出结论：在整个生物过程中，miRNA调控和转录调控是相互作用的，在维持细胞内生物平衡方面起到了至关重要的作用。
虽然这些调控机制存在着很多未知的方面，但研究这些未知领域可以为疾病治疗和生物技术驯化提供指导。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
7
8
寻找c-Jun促凋亡靶基因 －基因芯片方法
促凋亡靶基因： 1 凋亡时上调 2 Ad-169抑制 3 促凋亡作用
25K,5K,5K+ Ad-169 提RNA cDNA
Affymetrix gene chip
Δ169结构示意图
腺病毒技术
基因组外，瞬时表达
分裂和不分裂细胞
自主复制
病毒基因组整合于宿 主基因组，长时 间、稳定表达
分裂和不分裂细胞
复制缺陷
病毒基因组整合于宿 主基因组，长时间、 稳定表达
分裂和不分裂细胞
高水平表达
中水平表达
高水平表达
快（1-2 天）
慢 ( 2-4天 )
慢
滴度高达1012pfu/ml
可插入高达8kb的外源 片段，滴度随插入片 段长度增加而降低
• 撤NGF处理交感神经元 • 撤钾处理小脑颗粒神经元 • β淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元 • 黑质多巴胺神经元凋亡
……
5
6
c-Jun的靶基因是什么？
Fas L Mol Cell Biol 2019
Mol Cell Neurosci 2019 J Cell Biol 2019
Bim Neuron 2019
转录调控研究常用方法
1. 检测基因的表达水平： mRNA：RT-PCR Protein：WB，ICC，IHC，IF Transcription：报道基因
2. 证明转录因子的功能： 增强: overexpression, constitutively activate 抑制: inhibitor，dominant negative, siRNA，KO mice
34
c-Jun异二聚体的靶序列
35
36
37
38
39
c-Jun/ATF2形成二聚体
40
Immunoprecipitation (IP)
c-Jun/ATF2介导ATF活性
抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡
43
干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡
44
atf-decoy抑制神经元凋亡
alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.html alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3
2. 证明转录因子的功能： 增强: overexpression, constitutively activate 抑制: inhibitor，dominant negative, siRNA，KO mice
3. 导入外源基因方法： 质粒转染，病毒感染，稳定细胞株
转录调控研究常用方法
4. 从源头寻找差异基因方法： gene chip, ChIP on chip, ChIP sequence
5. 启动子分析： 确立启动子核心区 预测启动子上的转录因子结合位点
6. 证明转录因子结合在启动子上： EMSA，ChIP
感染率80％
病毒 表达系统 病毒基因组
复制 是否整合
感染细胞类型 表达丰度 表达时间 滴度 克隆容量
免疫原性
各类病毒比较见下表
腺病毒 Adenovirus
慢病毒 Lentivirus
双链DNA病毒
RNA病毒
腺相关病毒 Ad-associated virus
单链DNA 病毒
自主复制 病毒基因组游离于宿主 Nhomakorabea滴度最高可达109 TU/ml
可插入不超过10kb的 外源片段，滴度 随插入片段长度 增加而降低
高免疫原性
低免疫原性
滴度最高可达105 TU/ml
可插入不超过5kb的 外源片段，滴度随 插入片段长度增加 而降低
低免疫原性
c-Jun靶基因：dp5, puma, caspase-3, atf3, drak2
13
JNK/c-Jun介导dp5 表达上调
14
c-Jun直接调控dp5
直接调控: c-Jun结合dp5启动子 触发dp5表达
确立dp5启动子核心区
分析dp5启动子上的TF位点
❖ TRANSFAC：
gene-regulation/pub/databases.html
❖ GenomatixSuite：需注册 ❖ ALGGEN：
7. 蛋白质与蛋白质相互作用 Co-IP, GST-pull down, BiFC, FRET，PLA…
c-Jun靶基因及其对神经元凋亡的调控
3
意义
❖ 神经元凋亡 → AD、PD等神经退行性疾病 ❖ 信号转导与基因调控研究－寻找调控凋亡的关键分子 ❖ 揭示神经退行性疾病机制并确立新的防治靶点
4
JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路
Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点
dp5启动子上的ATF位点对其转 录活性是否重要？
报道基因
ATF位点是dp5上调的关键位点
22
c-Jun是否直接结合在dp5启动 子的ATF位点上？
23
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
24
c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合
p12ATF -( TTACATCA )- c-Jun/ATF2 p12ATF -(GGACATCG)-mut
45
c-Jun 、ATF2协同促凋亡
constitutively activate
c-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡
49
BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation Assay)
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合
27
dp5上调是神经元凋亡所必需
28
siRNA
30
Jonathan Ham Lab
32
ATF位点介导c-Jun靶基因上调
ATF site TTACCTCA
反式作用因子 c-Jun/ATF2
Chang-Deng Hu et al. 2019, Mol Cell
凋亡时BiFC增多
Fos↑→BiFC↓, Fos↓→BiFC↑
52
Fos抑制c-Jun/ATF2二聚体形成
53
Fos保护神经元
54
55
转录调控研究常用方法
1. 检测基因的表达水平： mRNA：RT-PCR Protein：WB，ICC，IHC，IF Transcription：报道基因