生物制药工艺学习题第七章凝胶层析
07章 生物制药工艺学 凝胶层析
凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系
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（二）凝胶柱的装填
凝胶柱底部支持物，有棉花、玻璃纤 维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂. 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发 生凝胶分层和胶面倾斜。
57
（三）凝胶床的检查和维护
观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。
有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流， 色带是否平整。 检查物质为蓝色葡聚糖。
42
五、多孔玻璃微球(Bio-glas)
特点：1、化学稳定性高、强度大。 2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 3、编号表示其孔径 , 越大，分离分子量也越大。
43
六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 Styragel商品, 分离范围为1 600～40 000 000。 生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的 物质。 分离不溶水的有机物质。
（ 一 ） 亲 脂 性 葡 聚 糖 凝 胶 （ Lipophilic Sephadex） 骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟 丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。
（二）交联葡聚糖离子交换剂（ Sephadex –ion-exchanger） 将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的 各种交换剂。
（1）使大分子的分配系数Kd=0； （2）小分子的Kd=1。
50
2．分级分离
（1）使各种物质的Kd值尽可能 相差大。 （2）不使它们分子量分布在凝胶 分离范围的一侧。 （3）分子量大于渗入限的3倍， 并小于排阻限的1/3。
如用Sephadex G-200分离血清 蛋白质的效果要比Sephadex G150为好。
生物制药工艺学习题集及答案
发酵工艺学（2）习题集第一章生物药物概述1、生物药物、抗生素、生化药品、生物制品、基因工程药物的概念(1)、生物药物：指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，利用生物体、生物组织、体液或其代谢产物，综合应用化学、生物技术、分离纯化工程和药学等学科的原理与方法加工、制成的一类用于预防、治疗和诊断疾病的物质。
(2)、抗生素：抗生素是生物，包括微生物，植物和动物在内，在其生命活动过程中所产生的(或由其它方法获得的)，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的有机物质。
(3)、生化药品：利用生理学和生物化学的理论、方法及研究成果直接从生物体分离或利用微生物合成，或用现代生物技术制备的一类用于预防、治疗、诊断疾病，有目的的调节人体生理机能的生化物质。
(4)、生物制品：是指用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等经加工制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。
各种疫苗、抗血清、抗毒素、类毒素、免疫调节剂、诊断试剂。
(5)、基因工程药物：采用新的生物技术方法，利用细菌、酵母或哺乳动物细胞作为活性宿主，进行生产的作为治疗、诊断等用途的多糖和蛋白质类药物。
2、生物药物的分类。
（1）、按照药物的化学本质和化学特性可分为：氨基酸类药物及其衍生物、多肽和蛋白质类药物、酶类药物、核酸及其降解物和衍生物、多糖类药物、脂类药物、维生素。
（2）、按原料来源可分为：人体组织来源的生物药物、动物组织来源的生物药物、微生物来源的生物药物、植物来源的生物药物、海洋生物来源的生物药物。
（3）、按功能和用途可分为：治疗药物、预防药物、诊断药物。
3、生物药物的特性。
药理学特性：（1）治疗的针对性强治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠。
如细胞色素c为呼吸链的一个重要成员，用它治疗因组织缺氧所引起的一系列疾病，效果显著。
（2）药理活性高生物药物是精制出来的高活性物质，因此具有高效的药理活性（3）毒副作用小，营养价值高（4）生物副作用常有发生在生产、制备中的特殊性：（1）原料中的有效物质含量低：杂质种类、含量高，提取、纯化工艺复杂。
生物制药工艺学 7凝胶层析
六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。
Styragel商品, 分离范围为1 600～40 000 000。
生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的 物质。
分离不溶水的有机物质。
常用的商品化凝胶介质
一
第三节 凝胶层析的实验条件 和操作
如：Sephadex G－25加入羟丙基
Sephadex LH－20
2.交联葡聚糖凝胶
将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂
交联葡聚糖离子交换剂
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3.Sephacryl 系凝胶
葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成。
优点：
1.分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大 于Sephadex 的范围。所以它不仅可以用于分离一 般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较 大的病毒颗粒。
②Kd=l时，Ve=V0பைடு நூலகம் Vi 对于完全可以进入凝胶内部的 小分子(全渗透)，其洗脱体积就等于外水体积和内水体积之 和。
③0<Kd<l时，Ve=V0+ KdVi.表示凝胶颗粒内部 一部分空隙可以被不同大小的分子利用，可以有不 同程度的渗入，Ve在V0与V0+Vi之间变化.
④Kd>l时,表示凝胶有一定的吸附作用,此时 Ve>V0+ Vi
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡
聚糖。 3-氯-1，2-环氧丙烷为交联
剂，形成三维网状结构的高 分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
Sephadex G
编号意义： 1、吸液量：吸液量（ml/g）的10倍 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围： 蛋白质、多糖
生物制药工艺学习题凝胶层析
第七章凝胶层析一、填空题1、凝胶层析的分离原理有、、。
这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下起主导作用；的作用随流速增加而加强；只有在流速很高时才起作用。
2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而，颗粒强度随浓度上升而。
3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。
一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率，多用于等。
粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率，多用于等。
4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大倍以上的柱体积，以上的柱比，较吸液量、较粒的凝胶固定相。
5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括、、、。
6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于，其越小，凝胶孔径越；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于。
二、选择题1、凝胶层析中，有时溶质的Kd>1，其原因是（）A.凝胶排斥B.凝胶吸附C.柱床过长D.流速过低2、凝胶层析中，有时小分子溶质的Kd<1，其原因是（）A.水合作用B.凝胶吸附C.柱床过长D.流速过低3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是（）A.分子量最大的B.体积最大的C.分子量最小的D.体积最小的4、为了进一步检查凝胶柱的质量，通常用一种大分子的有色物质溶液过柱，常见的检查物质为蓝色葡聚糖，下面不属于它的作用的是（）A.观察柱床有无沟流B.观察色带是否平整C.测量流速D.测量层析柱的外水体积5、在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是（）A.粗且长的B.粗且短的C.细且长的D.细且短的三、名词解释1、全排阻：2、类分离：3、分级分离：4、柱比：5、操作压：6、全渗入：7、分离度R s：四、问答题1、试述公式V e=V0+K d V i 各字母的物理意义。
2、利用凝胶层析如何测定蛋白质的分子量？3、凝胶层析的应用主要有哪些？并说明其原理。
第七章凝胶层析（答案）一、填空题1、凝胶层析的分离原理有平衡排除理论、扩散分离理论、流动分离理论。
07章 生物制药工艺学 凝胶层析.
用Sephadex G-25凝胶过滤层析脱盐和缓冲液置换凝胶过滤 (或称分子筛) 层析是一种由限制分子通过多孔基质，按分子大小分离混合分子的技术 (1,2)。
一般生物大分子的分子量比盐等小分子大许多倍，用凝胶过滤方法为生物产品脱盐十分简单、可靠 (3)。
由于层析方法可透过紫外和电导检测器监控整个层析脱盐的过程、产品的纯度和回收率，又可以连续自动进样和收集，自动化程度高，容易放大 (4)。
所以，从60年代初开始，随着层析介质技术的不断发展，Sephadex G-25系列凝胶过滤介质被越来越多地用于从实验室到工业规模的脱盐、小分子去除及缓冲液置换 (8-10)。
选择脱盐介质要考虑的因素Sephadex G-25介质用带3-氯-1，2-环氧丙烷(epichlorohydrin) 交联葡聚糖加工成珠状的介质。
适合分子量在5000以下的生物分子的脱盐及缓冲液置换工作。
Sephadex G-25有粗、中、细、超细四种不同颗粒大小可选择。
颗粒越小分辨率越高，但流速也越慢。
图1说明不同Sephadex G-25介质一般上样体积平均在30%柱体积左右。
样品在粒径粗的介质中更容易扩散，所以 SephadexG-25 Coarse (粗) 的上样量在四种介质中最少。
但是由于粗颗粒介质流速快，图2显示Sephadex G-25 Coarse (粗)在每个单位时间、单位柱床体积所纯化的产品，即生产率最高。
在优化条件下，每升Sephadex介质、每小时可达150克蛋白。
也就是说，选择最合适的脱盐介质，主要是要达到分辨率与生产率的最佳结合 (5, 6)。
图1. 最大样品体积 (柱体积的百分数)。
Vc。
关于凝胶部分练习题及答案
第一章凝胶思考题1.什么是凝胶？有何特征（两个不同）？外界条件(如温度、外力、电解质或化学反应)的变化使体系由溶液或溶胶转变为一种特殊的半固体状态，即凝胶。
（又称冻胶）其一，凝胶与溶胶(或溶液)有很大的不同。
溶胶或溶液中的胶体质点或大分子是独立的运动单位，可以自由行动，因而溶胶具有良好的流动性。
凝胶则不然，分散相质点互相连接，在整个体系内形成结构，液体包在其中，随着凝胶的形成，体系不仅失去流动性，而且显示出固体的力学性质，如具有一定的弹性、强度、屈服值等。
其二，凝胶和真正的固体又不完全一样，它由固液两相组成，属于胶体分散体系，共结构强度往往有限，易于遭受变化。
改变条件，如改变温度、介质成分或外加作用力等，往往能使结构破坏，发生不可逆变形，结果产生流动。
由此可见，凝胶是分散体系的一种特殊形式，共性质介于固体和液体之间。
2.举例说明什么是弹性和非弹性凝胶？由柔性的线性大分子物质，如洋菜吸附水蒸气先为单分子层吸附，然后转变为多分子层吸附，硫化橡胶在苯蒸气中的吸附则是从一开始即为多分子层吸附。
这类凝胶的干胶在水中加热溶解后，在冷却过程中便胶凝成凝胶。
如明胶、纤维素等，在水或水蒸气中都发生吸附。
不同的吸附体系，其吸附等温线的形状不同，弹性凝胶的吸附与解析通常会形成较窄的滞后圈。
由刚性质点（如SiO2、TiO2，V2O5、Fe2O3等）溶胶所形成的凝胶属于非弹性凝胶，亦称刚性凝胶。
大多数的无机凝胶，因质点本身和骨架具有刚性，活动性很小，故凝胶吸收或释出液体时自身体积变化很小，属于非膨胀型。
通常此类凝胶具有多孔性结构，液体只要能润湿，均能被其吸收，即吸收作用无选择。
这类凝胶脱水干燥后再置水中加热一般不形成原来的凝胶，更不能形成产生此凝胶的溶胶，因此这类凝胶也称为不可逆凝胶。
3.试述凝胶形成的基本推荐？①降低溶解度，使被分散的物质从溶液中以“胶体分散状态”析出。
②析出的质点即不沉降，也不能自由行动，而是构成骨架，在整个溶液中形成连续的网状结构。
凝胶层析习题.
凝胶层析习题1.凝胶层析法的基本原理？答：凝胶层析法的基本原理是不同相对分子质量的物质通过凝胶床(柱)时，相对分子质量低的物质由于可以在凝胶内扩散，因此移动速度较慢，而相对分子质量高的物质则容易通过，从而达到分离的目的。
2.凝胶层析法常用凝胶的种类和特点答：凝胶层析法常用的凝胶有天然凝胶（如琼脂凝胶）和人工合成凝胶（如交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）。
特点：①琼脂凝胶有较大的孔隙，允许较大的分子渗入，因而其工作范围远大于交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，琼脂凝胶的最大弱点是它带有大量电荷（主要是磺酸基，也带有一定量的羧基），层析时常需使用较高离子强度的洗脱液，这使得洗脱物中含有一定量的盐分而影响产品纯度。
②聚丙烯酰胺凝胶由于全有碳——碳骨架构成，因而它是完全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体，缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羟基，使凝胶带有一定的离子交换基团，一般只在PH2～11的范围内使用。
③交联葡聚糖凝胶化学性质比较稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液。
3.不同性质的物料（热敏性、高粘度、易结垢或易析出晶体、发泡性、腐蚀性）如何蒸发浓缩设备？答：1.对于热敏性的发酵产品；蒸发温度要低、滞留时间要短；选用薄膜式蒸发器。
2.对于高粘度的溶液；溶液流速要高，不停搅动；选用强制循环型、刮板式、降膜式薄膜蒸发器。
3.对于易结垢或易结晶的溶液；垢层和结晶不易粘附在管壁；强制循环蒸发器。
4.对于发泡性的溶液；使泡沫破裂，添加消泡剂。
选用强制循环型、长管膜式蒸发器；5.对于腐蚀性的物料；设备材料抗腐蚀，使用不锈钢、石墨、玻璃、搪瓷、防腐涂层等。
4.简述强制循环蒸发浓缩和薄膜式蒸发浓缩过程的特点及适用范围？答：强制循环蒸发浓缩的优点为料液流速大，达3.5m/s，传热系数较高，可防止料液结垢；缺点：动力消耗大。
适宜于浓缩粘度大、易结晶析出与易结垢的发酵和发酵产品的物料。
薄膜式蒸发浓缩的优点：占地少，传热效率较高，料液受热时间短，在加热管内停留几秒到几十秒。
生物制药复习题
第一章绪论1、生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是（）、（）、（)2、生物技术制药发展历程经历了飞速发展的四个十年，分别是（）、（）、（）、（）。
3、生物技术所含的主要技术范畴有（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）和（）。
4、下列哪个产品不是用生物技术生产的（）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠5、我国科学家承担了人类基因组计划（）的测序工作A 10%B 5%C 1%D 7%6、生物技术7、生物技术药物8、生物技术制药第二章基因工程制药1、基因工程药物制造的主要步骤是：（）、（）、（）、（）、（）、（）。
2、目的基因获得的主要方法是（）、（）、（）、（）。
3、基因表达的微生物宿主细胞分为2大类。
第一类为（），目前常用的主要有（）；第二类为（），常用的主要有（）。
4、基因工程药物的分离纯化一般不应超过5个步骤，包括（）、（）、（）、（）和（）。
5、在基因工程药物分离纯化过程中，基因重组蛋白的分离比较困难，可用（）、（）、（）、（）的方法，达到初步分离的目的。
6、人工化学合成DNA新形成的核苷酸链的合成方向是（），合成的DNA 5’末端是（），3’末端是（）。
7、凝胶过滤法是依赖（）来分离蛋白组分A、分子大小B、带电状态C、分子质量D、解离状态8、可用于医药目的的蛋白质和多肽药物都是由相应的（）合成的A RNAB 基因C 氨基酸D 激素9、用反转录法获得目的基因，首先必须获得（） P13cDNA文库法A tRNAB cDNAC rRNAD mRNA10、那一类细菌不属于原核细胞（）A 大肠杆菌B 枯草芽孢杆菌C 酵母D 链霉菌11、基因工程菌的生长代谢与（）无关A 碳源B RNA聚合酶C 核糖体 D产物的分子量12、基因工程菌的高密度发酵过程中，目前普遍采用（）作为发酵培养基的碳源A 葡萄糖B 蔗糖C 甘油 D甘露醇13、下列那种色谱方法是依据分子筛作用来纯化基因工程药物（）A 离子交换色谱B 亲和色谱C 凝胶色谱 D气相色谱简答:1、基因工程制药的概念？2、什么是载体？载体主要有哪几种？3、质粒载体的三种构型是什么？质粒载体的性质？用于克隆表达质粒载体的三个要素是什么？4、目的基因常用的制备方法有哪四种？这四种方法的基本步骤是什么？5、影响目的基因与载体之间的连接效率的主要因素是什么？6、重组DNA导入宿主细胞常用的四种方法是什么？7、什么是重组子？重组子删选与鉴定的5种方法是什么？8、重组蛋白的四种主要的分离技术？重组蛋白四种主要的纯化技术？9、分离纯化工艺应遵循的原则？10、基因工程药物的改造目的及改造思路是什么？11、定点突变的三种类型？12、基因工程的质量控制要点？13、蛋白质含量测定的5种方法？14、什么是蛋白质的等电点？等电聚焦法的原理？15、大肠杆菌表达系统的优缺点。
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第七章凝胶层析
一、填空题
1、凝胶层析的分离原理有、、。
这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下起主导作用；的作用随流速增加而加强；只有在流速很高时才起作用。
2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而，颗粒强度随浓度上升而。
3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。
一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率，多用于等。
粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率，多用于等。
4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大倍以上的柱体积，
以上的柱比，较吸液量、较粒的凝胶固定相。
5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括、、
、。
6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于，其越小，凝胶孔径越；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖
于。
二、选择题
1、凝胶层析中，有时溶质的>1，其原因是（）
A.凝胶排斥
B.凝胶吸附
C.柱床过长
D.流速过低
2、凝胶层析中，有时小分子溶质的<1，其原因是（）
A.水合作用
B.凝胶吸附
C.柱床过长
D.流速过低
3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是（）
A.分子量最大的
B.体积最大的
C.分子量最小的
D.体积最小的
4、为了进一步检查凝胶柱的质量，通常用一种大分子的有色物质溶液过柱，常见的检查物质为蓝色葡聚糖，下面不属于它的作用的是（）
A.观察柱床有无沟流
B.观察色带是否平整
C.测量流速
D.测量层析柱的外水体积
5、在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是（）
A.粗且长的
B.粗且短的
C.细且长的
D.细且
短的
三、名词解释
1、全排阻：
2、类分离：
3、分级分离：
4、柱比：
5、操作压：
6、全渗入：
7、分离度：
四、问答题
1、试述公式0 各字母的物理意义。
2、利用凝胶层析如何测定蛋白质的分子量？
3、凝胶层析的应用主要有哪些？并说明其原理。
第七章凝胶层析（答案）
一、填空题
1、凝胶层析的分离原理有平衡排除理论、扩散分离理论、流动
分离理论。
这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下平衡排除理论起主导作用；扩散分离理论的作用随流速增加而加强；只有在流速很高时流动分离理论才起作用。
2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随浓度上升而提高。
3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。
一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离等。
粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，多用于脱盐等。
4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大25 倍以上的柱体积， 25 以上的柱比，较大吸液量、较细粒的凝胶固定相。
5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括分子扩散、涡流扩散、流动相中传质阻力、固定相中传质阻力。
6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于交联度，其越小，凝胶孔径越大；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于琼脂糖浓度。
二、选择题
1、凝胶层析中，有时溶质的>1，其原因是（ B ）
A.凝胶排斥
B.凝胶吸附
C.柱床过长
D.流
速过低
2、凝胶层析中，有时小分子溶质的<1，其原因是（ A）
A.水合作用
B.凝胶吸附
C.柱床过长
D.流速过低
3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是（ B）
A.分子量最大的
B.体积最大的
C.分子量最小的
D.体积最小的
4、为了进一步检查凝胶柱的质量，通常用一种大分子的有色物质溶液过柱，常见的检查物质为蓝色葡聚糖，下面不属于它的作用的是（C）
A.观察柱床有无沟流
B.观察色带是否平整
C.测量流速
D.测量层析柱的外水体积
5、在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是（A）
A.粗且长的
B.粗且短的
C.细且长的
D.细且短的
三、名词解释
1、全排阻：
当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较大的分子完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。
其流经体积最小，等于外水体积V0。
2、类分离：
将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离.选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。
大分子的分配系数0，小分子的1。
3、分级分离：将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，分级分离应尽量使待分离各物质的值相差大些，并使分子量分布不在凝胶分离范围的一侧。
4、柱比：层析柱的长度与直径的比值一般称作“柱比”。
5、操作压：凝胶层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压”。
6、全渗入：被分离组分的分子量小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫做“全渗入”。
其流经体积最大，等于外水体积与内水体积之和，V0 ＋。
7、分离度：
式中 1、2——对应于两个峰的淋出体积；W1、W2和σ1、σ2——两个峰宽度和标准偏差。
四、问答题
1、试述公式0 各字母的物理意义。
答：公式0中代表被分离组分的流经体积，V0代表外水体积，代表内水体积。
称作“排阻系数”或“分配系数”，它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。
对一定种类规格的凝胶，物质的
值为该物质的特征常数。
排阻系数：
当1时，洗脱体积0，为全渗入。
当0时，洗脱体积0，为全排阻。
0＜＜1时，洗脱体积，为部分渗入。
2、利用凝胶层析如何测定蛋白质的分子量？
答：当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子（2分）。
对于一个特定体系（凝胶柱），待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式
先以3个以上（最好更多些）的已知分子量的标准蛋白过柱，测取各自的值。
以作纵坐标，作横坐标制作标准曲线（2分）。
在同一测定系统中测取未知物质的值便可由标准曲线求得分子量（2分）。
3、凝胶层析的应用主要有哪些？并说明其原理。
当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子（2分）。
应用：
一、脱盐：脱盐用的凝胶多为大粒度的，高交联度的凝胶。
此时溶液中蛋白质等大分子的0，盐类的1。
由于交联度大，凝胶颗粒的强度较好，加之凝胶粒度大，柱层操作比较便利，流速也高。
二、分子量测定：对于一个特定体系（凝胶柱），待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式
先以3个以上（最好更多些）的已知分子量的标准蛋白过柱，测取各自的值。
以作纵坐标，作横坐标制作标准曲线。
在同一测定系统中测取未知物质的值便可由标准曲线求得分子量。
三、分离纯化：根据分子量不同流出先后顺序不同，收集单一洗脱峰的物质，得以纯化。