生物制药工艺学

生物制药工艺学：对生物药物进行研究、生产和制剂的一门综合学科。

生物制药是把生物体内的具有生物活性的基本物质，保持原来的结构和功能，又能在含多种物质的液相或固相中较高纯度的分离出来，它是一项严格，细致，复杂的工艺过程，涉及物化生工程等方面的知识和操作技术。

遗传与变异：是生命的基本特征，也是菌种选育的理论基础。

杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新结合，从只能分离和筛选出具有新性状菌株的过程。

原生质体融合：是指把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂ＰＥＧ和Ｇａ离子的作用下，发生原生质体的融合，促使两亲本的遗传物质进行交换，从而实现遗传重组。

分批灭菌：将配置好的培养基输入发酵罐内，经过间接蒸汽预热，然后直接通入饱和蒸汽加热，使培养基和设备仪器灭菌，达到要求的温度和压力后维持一定时间，在冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为。

连续灭菌：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内，这种工艺称为。

萃取：液料与萃取剂接触后，液料中的溶质向萃取剂转移的过程。

超临界流体萃取技术是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特意增加物质溶解能力来进行分离纯化技术（温度３１.０６Ｃ，压力７３.９，密度０.４４８）

双水相萃取法又称水溶液两相分配技术，它是不同的高分子溶液相互混合产生两相或多项系统，利用物质在互不相容的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。

吸附法：是利用适当的吸附剂，在一定Ｐｈ条件下，吸附生物样品中的生物药物，然后再以适当的洗脱剂将吸附的药物从吸附剂上解吸下来，达到浓缩和提纯的目的。

高分子聚合物沉淀法：某些水溶性非离子型高分子聚合物，如聚乙二醇等能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。

过饱和溶液：溶液浓度等于溶解度时，该溶液称为饱和溶液。溶质只有在过饱和溶液中才有可能析出。

生物药物：是以生物体、生物组织、或其成分为原料（包括组织、器官、细胞器、细胞成分、代谢排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学原理与方法加工制成的药物

现代生物技术药物：将生物体内生理活性物质的基因分离或人工合成，利用重组DNA技术加以改造，使其在细菌、酵母、动物细胞、转基因动物中间大量表达，通过这种方式获得的药物。

固体培养基：是加入一定量的凝固剂的培养基，适用于菌种的培养、分离、无菌试验、和菌种保藏工作。液体培养基是未加任何凝固剂的培养基

现代生物技术体系：主要的生物技术包括重组DNA技术、原生质体制备与原生质体融合技术、突变生物合成、组合生物合成、选择性生物催化合成、代谢途径工程、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体、组织培养技术、基因治疗等。

微生物的初级代谢产物：包括氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸、酶类、糖类、脂类等

微生物的次级代谢产物：包括抗生素，色素，生物碱、酶的抑制剂、植物生长素等初级代谢：指的是与微生物的生长繁殖有密切关系的代谢活动，初级代谢产物指的是与微生物的生长繁殖有密切关系的代谢产物。

次级代谢：指的是与微生物的生长繁殖无关的代谢活动，次级代谢产物指的是与微生物的生长繁殖无关的代谢产物。

培养基：是人工配制的、供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的多种营养物质的混合物。

前体：在微生物药物的生物合成过程中，有些化合物能直接被微生物利用构成产物分子结构的一部分，而化合物本身的结构没有大的变化，这些物质称为前体。

生长因子：是微生物生长代谢必不可少，但不能用简单的碳源或氮源生物合成的一类特殊的营养物质。

促进剂：在发酵培养基中加入某些微量的化学物质，可促进目的代谢产物的合成，这些物质被称为促进剂。

抑制剂：在发酵过程中加入某些化学物质会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种代谢产物，或使正常代谢的中间产物积累起来，这种物质被称为抑制剂。

诱导物：一般是指一些特殊的小分子物质，在微生物发酵过程中添加这些小分子物质后，能够诱导代谢产物的生物合成，从而显著提高发酵产物的产量。

生理酸性物质：经微生物代谢作用后，能产生酸性物质的营养成分称为生理酸性物质。

生理碱性物质：经微生物代谢作用后，能产生碱性物质的营养成分称为生理碱性

物质。

速效碳源、迟效碳源：根据微生物利用碳

源速度的快慢可将碳源分为速效碳源和

迟效碳源。葡萄糖和蔗糖等被微生物利用

的速度较快，它们是速效碳源，而乳糖、

淀粉等被利用的速度相对较为缓慢，它们

是迟效碳源。

葡萄糖效应：在发酵过程中，如果葡萄糖

浓度过高会加快菌体的代谢，以致培养基

中的溶解氧不能满足菌体进行有氧呼吸

的需要，葡萄糖分解代谢就会进入不完全

氧化途径，一些酸性中间产物如丙酮酸、

乳酸、乙酸等积累在菌体或培养基中导致

Ｐｈ降低，影响某些酶的活性，从而抑制

微生物的生长和产物的合成，产生葡萄糖

效应。

生产种子的制备：指的是由保藏的菌种开

始，经过不断的扩大培养，使菌体数量达

到能满足发酵罐接种量的需要所涉及的

生产过程。

种子的制备：是将固体培养基上培养好的

孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使

其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。

诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌

株→制备待处理的菌悬液→诱变处理→

筛选→保藏和扩大试验

常用的诱变剂：1紫外线2亚硝基胍3硫

酸二乙酯4亚硝酸

杂交育种是将孢子（或摇瓶菌丝）接入的

体积较小的种子罐中，经培养后形成大量

的菌丝，该种子称为一级种子，把一级种

子转入到发酵罐内发酵称为二级发酵，如

果将一级种子接入到体积较大的种子罐

内，经过培养形成更多的菌丝体，这样制

备的种子称为二级种子，将二级种子转入

到发酵罐内发酵，称为三级发酵，同样道

理，使用三级种子的发酵称为四级发酵。

代谢曲线：根据发酵过程中代谢参数变化

绘制出的曲线，作用：可清楚的说明发酵

过程中的代谢变化，并反映出碳源，氮源

的利用和Ｐｈ、菌体浓度和产物浓度等参

数之间的相互关系。

为什么要绘制代谢曲线？分析研究代谢

曲线，有利于掌握发酵代谢变化的规律和

发现工艺控制中存在的问题，有助于改进

工艺，提高产物的产量。

膜分离法：又称为超滤法，包括微滤，超

滤和反渗透，是利用可截留一定分子量的

超滤膜进行溶质分离或浓缩。

渗透压冲击法：将细胞置于高渗溶液中

（例如一定浓度的蔗糖或甘油溶液中），

由于渗透压的作用，细胞内的水分便向外

渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将

介质快速稀释或将细胞转入缓冲溶液中，

由于渗透压发生变化，胞外的水分迅速渗

入胞内，是细胞快速膨胀而破裂，使产物

释放到溶液中。

离子交换法：是应用合成的离子交换树脂

作为吸着剂，将溶液中的物质，依靠库伦

力吸着在树脂上，然后用合适的洗脱剂将

吸着物从树脂上洗脱下来，达到分离，浓

缩，提纯的目的。

离子交换树脂：是一种具有网状立体结构

的，含有活性基因而能与溶液中其他物质

进行交换或吸着的聚合物。

交换容量：是表征树脂活性基数量——交

换能力的重要参数，其表示方法有重量交

换容量交换容量体积法。

沉淀法：是利用某种沉淀剂或改变条件，

使所需提取的目的物在溶液中的溶解度

降低而形成无定形固体沉淀从而进行分

离的一种技术方法。

等电点沉淀法：利用大分子两性电解质在

等电点时溶解度最低的原理而建立的分

离法称为～

凝胶层析（色谱）：是指以各种多孔凝胶

为固定相，利用流动相中所含各种组分的

相对分子质量不同而达到物质分离的一

种技术。

亲和层析（色谱法）：是利用生物大分子

与某些对应的专一特意识别和可逆结合

的特性而建立起来的一种分离生物大分

子的色谱方法。

重结晶：即将晶体用合适的溶剂溶解再次

结晶，能使纯度提高，因为杂质和结晶物

质不在同溶剂和不同温度下的溶解度不

同。

结晶：是制备纯物质的有效方法，溶液中

的溶质在一定条件下，因分子有规则的排

列而结合成晶体。

晶核：最先析出的微小颗粒是以后结晶的

中心，称为。

自然选育：是利用微生物在一定条件下产

生自发突变的原理，通过分离，筛选排除

衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生

产水平菌株的过程。

诱变育种：是利用物理或化学诱变剂处理

均分散的微生物细胞群体，促使其突变率

大幅提高，然后采用简便，高效的筛选方

法，从中选出少数具有优良性状的突变菌

体。

孢子制备：一般采用琼脂斜面或其他固体

培养基，使菌种经过培养得以活化，并产

生数量足够，质量合格的孢子。

英汉互译：抗生素anti bioti cs 氨基酸

amino acid 维生素vitamin 多肽

polype ptide 蛋白质pr otein 蛋白质

的等电点isoelectric point pi 蛋白质的

变性denaturation 胸腺肽al

thymosin al 人绒毛膜促性腺激素

human chorionic gonadotropin （HCG）生

物转化biotra nsformati on 基因工程

genetic engineering 基因工程药物

genetically engineered drug

简答：

生物制药的工艺过程？菌种→斜面培养

→种子制备→发酵→发酵液预处理→提

取→精制→成品检验→成品→包装

生物制药产品的类别包括哪些？举例说

明：（一）微生物发酵产物1.微生物菌体

药物：如，酵母菌体，单细胞蛋白，灵芝，

冬虫夏草，茯苓菌等2.微生物酶抑制：如

蛋白酶，淀粉酶，糖化酶，青霉素酰化酶

3.酶活性调节剂：包括酶激活剂和酶的抑

制剂，如血管紧张素转化酶抑制剂，胆固

醇合成酶抑制剂4.微生物代谢产物：如初

级代谢产物氨基酸，次级代谢产物抗生素

等（二）生物转化药物，如激素，维生素，

抗生素，生物碱（三）基因工程药物：如

人胰岛素，人生长因子，白介素，干扰素

（四）动植物细胞培养药物。

生物制药与中医药的关系：①中药鉴定、

识别假冒伪劣药材（DNA芯片技术）②发

现新中药品种③发酵液中提取中药（高效、

结构改善）④利用基因工程产生之植物此

生代谢产物（黄酮素，糖苷，生物碱等）

⑤利用转基因动物生产动物类药材（基因

芯片植入动物→表达→从分泌物（麝香）

或组织中（鹿茸）提取活性物质。

培养基的组成、分类方法、设计注意问题：

培养基成分主要包括碳源、氮源、磷源、

硫源、无机离子（包括微量元素）、生长

因子、前体、促进剂、抑制剂和水分。分

类方法：按培养基组成物质的来源，可分

为合成培养基和复合培养基（天然培养基）

按物理状态可分为固体培养基和液体培

养基及半固体培养基；按工业发酵中的用

途可分为孢子培养基、种子培养基、发酵

培养基和补料培养基。注意问题：①确定

培养基的基本组成②确定培养基成分的

基本配比和浓度（a碳源和氮源的配比和

浓度b生理酸性物质和生理碱性物质的

比例c无机盐浓度d其他培养基成分的浓

度）③具有经济性。

培养基筛选方法：①单因子实验法②正交

试验和均匀设计试验等数学方法。

影响培养基的因素：原材料质量、水质、

培养基的灭菌（一般在121度下灭菌20

到30分钟，含糖培养基112度灭菌15到

30分钟）和黏度

菌种保藏的目的、原理及方法：菌种保藏

的目的是尽可能保持菌种的存活率和优

良性能，保证菌种经过较长时间的保藏后

仍保持存活和生产能力。菌种保藏对于基

础研究和实际应用具有重要意义。

菌种保藏的原理：是根据微生物的生理特

性，人为地创造条件，使微生物处于代谢

不活跃，生长繁殖受抑制的休眠状态，以

减少菌种的变异。有利于微生物休眠的条

件是低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等。

菌种保藏的方法：

1）斜面保藏法，广泛应用于细菌、放线

菌、酵母菌等菌种的短期保存。为了长期

保持菌体存活，每间隔一定时间需重新移

植培养一次。

该方法的优点是简便易行，成本低，能随

时观察菌株是否死亡、变异、退化或染菌。

缺点是由于斜面含有营养和水分，菌种生

长和繁殖还没有完全停止，代谢活动尚能

微弱进行，因此存在自发突变的可能；短

期内多次传代易引起菌种发生变异和引

起退变，污染杂菌的机会也会随之增多。

2）液体石蜡保藏法：在无菌条件下，将

液体石蜡倾注或用无菌吸管移入生长成

熟、丰满的斜面菌种上，使液体石蜡高出

斜面顶端1cm左右，加塞并用固体石蜡封

口，将其直立放在试管架上低温保藏。

3）沙土管保藏法：孢子或芽孢，在干燥

环境中抵抗力强，不易死亡。干燥能使这

些微生物的代谢活动水平降低但不会死

亡，而处于休眠状态。保藏时间可达数年。

4）麸皮保藏法：

5）冷冻干燥法：目前较理想的保藏方法，

也是各类菌种保藏机构广泛采用的主要

保藏方法。最常用的保护剂是脱脂牛奶，

脱脂牛奶可由新鲜的牛奶制备。

6）液氮超低温保藏法：该法保藏菌种的

效果好，方法简单，保藏对象也最为广泛，

几乎所有微生物及动植物细胞等均可采

用该方法。该法的另一优点是可利用各种

培养形式的微生物进行保藏，不论使用孢

子或菌体、液体培养物或固体培养物均可

采用该法。因此被认为是当前最有效、最

可靠的一种长期保存菌种的方法之一。

7）甘油保藏法

8）孢子滤纸保藏法

菌种选育目的：①生产方面：a提高发酵

产量b改进菌种的性能c产生新的发酵产

物d去除多余的组分②科研方面：a了解

菌种遗传背景b提供分子遗传学研究材

料c获得带遗传标记的菌株d生物合成途

径的研究e生物合成机制的研究

发酵过程工艺参数有哪些？（1）物理参

数：①温度②压力③搅拌转速④搅拌功率

⑤空气流量⑥表观粘度（2）化学参数：

①Ph②基质浓度a糖浓度的测定b氮浓度

的测定c磷酸盐含量的测定d产物浓度的

测定e溶解氧浓度的测定f废气中氧含量

g废气中二氧化碳含量（3）生物参数：

①菌体浓度②菌丝形态

微生物的发酵类型：（1）按投料方式分类：

①分批发酵②补料分批发酵③连续发酵

（2）按与氧的关系分类：①需氧发酵②

厌氧发酵（3）按发酵动力学参数的关系

分类：①生长偶连型②部分生长偶连型③

非生长偶连型

细胞破碎的方法：一机械法：①液体裁切：

超声波，机械搅拌，压力②固体裁切：研

磨，压力。二非机械法：①干燥：空气干

燥，真空干燥，冷冻干燥，喷雾干燥②溶

胞：物理法，化学法，酶法。

沉淀法有哪些？盐析法；有机溶剂沉淀法；

等电点沉淀法；高分子聚合物沉淀法；聚

电解质沉淀法；不可逆的沉淀去除法

温度对发酵的影响：1温度影响酶的活性

2温度影响发酵液的物理性质3温度影响

代谢产物的合成方向；PH对发酵的影响

1PH影响酶的活性2PH影响基质或中间产

物的解离状态3PH影响发酵产物的稳定

性

育种方法：自然育种，诱变育种，杂交育

种，原生质体融合育种。

主要灭菌和除菌方式：高温灭菌：A1干

热灭菌2湿热灭菌B过滤灭菌C化学物质

消毒和灭菌D其他方式灭菌1辐射灭菌2

臭氧灭菌3静电除菌

生产种子的制备：两个阶段：实验室种子

制备和生产车间种子制备

消除泡沫的方法：机械消除和消沫剂消除

影响孢子质量的因素：培养基、培养温度、

温度、培养时间、冷藏时间、接种量

分离纯化的特点：培养液（或发酵液）中

所含欲分离的生物物质浓度很低；欲分离

的生物或新物质通常很不稳定；发酵或培

养都是分批操作、生物变异性大，各批发

酵液不尽相同，这要求分离有一定弹性，

发酵液的放罐时间、发酵过程中泡沫剂的

加入对分离都有影响；用作医药的生物产

物与人类生命息息相关

影响溶剂萃取的因素：①PH的影响2温

度与萃取时间的影响3盐析作用的影响4

溶剂种类、用量及萃取方式的选择

离子交换速度的影响因素：1颗粒大小2

交联度3温度4离子化合物5离子大小6

搅拌速度7溶液浓度

影响吸附过程的因素：1吸附剂的性质2

被吸附物的性质3溶剂的影响4溶液PH

值的影响5温度的影响6其他组分的影响

常用吸附剂按其化学结构可分为两大类：

一类是有机吸附剂，如活性炭、维生素、

大孔吸附树脂等。另一类是无机吸附，如

白土、氧化铝、硅胶、硅藻土等。

盐析法的影响因素：1盐的性质2PH值3

盐的饱和度4蛋白质浓度5温度

有机溶剂沉淀法的影响因素：1温度2PH

值3蛋白质浓度4无机盐离子的强度5金

属离子

膜分离机制:利用可截留一定分子量的超

滤膜进行溶质的分离或浓缩，小于截留值

的分子能通过膜，而大于截留值的分子不

能通过膜，因而达到分离。

凝胶色谱分离法的原理：凝胶色谱柱中，

当含有各组分的混合溶液流经凝胶层析

住时，各组分在层析柱内同时进行两种不

同的运动，一种是随着溶液流动而进行的

垂直直下的移动，另一种是不定向的分子

扩散运动（布朗运动）。大分子物质由于

分子直径较大，不能进入凝胶的微孔，只

能分布于凝胶颗粒的间隙中，已较快的速

度流过凝胶剂；较小的分子能进入凝胶的

微孔中，不断地进出于一个个颗粒的微孔

内外，这就使小分子物质向下移动的速度

比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各

组分按照Mr由大到小的顺序先后流出层

析柱，大到分离的目的。

凝胶色谱分离法的特点：操作条件温和，

简单易行；分离Mr范围广；离效果一般

不受缓冲液组成的影响；进行一次操作后

无需再生处理就可进行下一次的分离

凝胶色谱分离法的应用：1盐脱2分级分

离3大分子物质的分子量测定

亲和色谱的操作：吸附、冲洗、洗脱、平

衡

饱和溶液形成的条件：蒸发法、冷却法、

化学反应结晶法、盐析结晶法、等电点法、

复合法、共沸蒸馏结晶法

影响晶体大小的因素：过饱和度、温度、

搅拌速度、晶种

改变晶体形状的方法：控制晶体生长速度、

过饱和度、结晶温度、选择不同的溶剂、

调节溶液的PH值和有目的的加入某种能

改变晶形的杂质

工业生产实例：1化学反应结晶2利用温

度差结晶3利用湿度差结晶4盐析结晶5

利用等电点结晶6盐析和冷却结晶7冷却

和化学反应并结晶8共沸蒸馏结晶9重结

晶

氨基酸的制备方法:1水解法a酸水解法b

碱水解法c酶水解法2微生物发酵法3化

学合成法4酶促合成法

氨基酸的分离方法：1基于溶解度或等电

点不同分离2加入特殊沉淀剂沉淀分离3

用离子交换剂分离4用电渗析法分离

维生素的发酵生产工艺路线：1斜面种子

培养2一级种子培养3二级种子培养4发

酵培养