毕赤酵母发酵[行业特制]
毕赤酵母发酵
6/28/2014
1.2过氧物酶体(Peroxisome)：遍布于真核生物的细胞器中, 用来去除有
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1. 3GFP-SKL（过氧化物酶体定位蛋白）,该载体含有融合了过氧化物酶体 定位信号1(PTS1)的绿色荧光蛋白报告分子GFP-SKL编码基因 成功地用于描 述不同 时间进程的AOX1启动子和过氧物酶体生物合成因素的特征
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2.3：补料分批培养条件
研究了三种不同发酵条件下的PpAOX1启动子（ YGLY29325 ）和过氧化物酶体 生物合成（ YGLY31884 ）的调控。 诱导阶段分批补料条件 ML:甲醇的起始供应速率为2.6gl/lh然后在0.0063/h的基础上以幂指的形式增加 SML:甲醇培养20h用50%的葡萄糖15g/h的速度培养8h作为一个周期共培养3个周期 OL:甲醇进料保持反应器中甲醇1％，每当DO迅速增加，这表明甲醇消耗。 DO级联 被打开，关闭和搅拌速度 被减小到实现氧气的限制
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2.4 GFP表达的定量和可视化： 约107固定的酵母细胞经PBS洗后用mounting solution重悬制作切片用 Axioscope 2 Plus 显微镜来观察OpenLAB软件来实现相机控制和图像收 集Volocity软件用来量化GFP在细胞中的强度
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2.5抗体效价的测定 在培养上清液中于280nm处抗体浓度用二极管阵列检测器和蛋白A亲 和柱与HPLC系统
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3.3毕赤酵母AOX1启动子（YGLY29325）根据三种不同的补料分批条件规制 - 甲醇 限制（ML），切换与葡萄糖和甲醇（SML）和氧气限制（OL）补料分批条件。 （a） GFP荧光表达图像（b）不同诱导时间的荧光蛋白相对密度。对于ML和OL，时间表示分 批阶段（T1），甘油补料分批阶段诱导前（T2）和诱导期（T3，10±2小时; T4中， 36±2小时; T5，62±2小时; T6，84±2小时）。对与SML条件下，细胞生长是在T2，T4 和T66/28/2014 葡萄糖阶段，诱导是在T3和T5甲醇阶段
一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法
一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法植物纤维素富含木聚糖，这是一种可溶于水的多糖，可以提供糖分和能量给生物体。
而木聚糖酶则可以将木聚糖分解为各种单糖，因此在生物制造、化学和环境领域有着广泛的应用。
本文讨论了一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法。
首先，我们需要了解什么是毕赤酵母。
毕赤酵母，也称“木质素分解真菌”，是一种在自然环境中广泛存在的真菌。
它主要生长在植物表面、土壤和水中，可以分解植物纤维素和木质素。
毕赤酵母通过培养和生长，可以大量生产木聚糖酶。
毕赤酵母固态发酵的方法是种植毕赤酵母菌株在物理或化学反应器内，以自然或添加的固态基质为生长基质进行发酵。
该方法比传统的液体发酵方法更加高效，环保和经济。
目前，毕赤酵母固态发酵已经被证明是一种可行的生产木聚糖酶的方法。
接下来，我们将详细介绍毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的步骤。
1. 筛选毕赤酵母菌株用一定方法筛选出适合固态酵素生产的毕赤酵母菌株。
在此过程中，考虑到毕赤酵母的生长条件需要有更好的适应性，因此将根据原始环境，筛选生长适应性更强的毕赤酵母菌株。
2. 选取适合的基质调配好相应的培养基，选择适合的固态基质，为毕赤酵母生长和繁殖提供营养，促进木聚糖酶的产生。
同时要确保基质的来源和化学成分、水分、酸碱度都能达到适宜的水平，以保证所生产出的木聚糖酶的纯度和活性。
3. 倒放法在倒放法中，先将经过有效灭菌处理的基质填充到反应器中，然后加入所筛选出的毕赤酵母菌株。
接着，进行表面打平，以保持反应器顶部平整。
4. 发酵条件使反应器维持一定的温度和湿度，具体的温度范围和湿度数值取决于毕赤酵母菌株和所选取的基质类型。
同时，要保证反应器内部通风良好，这可以帮助加速生长和减少气泡的产生以及发酵筛选条件的优化。
5. 收取、组织提取与测定当反应到达一个指定的时间段后，可以进行对所生产出的木聚糖酶的收获。
在此过程中，采取先将基质采获，然后进行适当的干燥以控制其湿度量，并用适量的缓冲液提取酵素，接着才作为酵素来为后续项目的进行提供所需的需要。
毕赤酵母发酵手册
毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。
毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度，我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。
因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。
下面+s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃所给出的指导是基于MutMut和发酵罐中发酵而成。
请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。
下面所给出的表就是整个发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。
下面的表格描述了这些参数和※设备推荐：下面是所推荐设备的清单：·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。
你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。
这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。
·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。
·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。
·添加甘油和甲醇的补料泵。
·pH的自动控制。
培养基的准备：你需要准确配置下列溶液：·发酵所需的基本盐类（第11页）·PTM补充盐类（第11页）1·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM补充盐每升甘油。
1·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM补充盐每升甲醇。
1毕赤酵母生长的测定：在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。
培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定：简介：溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。
毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。
毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。
然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。
毕赤酵母发酵罐发酵
微生物发酵罐发酵（毕赤酵母）灭菌前：室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）；室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定灭菌：1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。
接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。
2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。
（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。
）灭菌后:A.消耗甘油阶段1.灭菌后冷却30℃时：2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐；3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。
4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。
【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。
】5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。
毕赤酵母发酵过程的染菌分析及预防策略
毕赤酵母发酵过程的染菌分析及预防策略毕赤酵母是一种重要的工业微生物，在酿酒、制曲、酱油等方面都有着重要的作用。
毕赤酵母的发酵过程中，往往会受到细菌、霉菌等其他微生物的影响，引起发酵产物的变质甚至失败。
对毕赤酵母发酵过程的染菌分析及预防策略进行研究和探讨，对于保障毕赤酵母的发酵质量具有重要的意义。
1. 毕赤酵母发酵过程的染菌分析毕赤酵母发酵过程中主要存在的染菌有细菌和霉菌两类。
细菌主要包括乳酸菌、酪酸菌、醋酸菌等，它们会通过酸化作用和产生挥发性化合物等方式影响毕赤酵母的发酵过程。
而霉菌则主要包括曲霉、青霉、黄曲霉等，它们会产生孢子和毒素，引起毕赤酵母的变质和发酵失败。
在进行毕赤酵母发酵过程的染菌分析时，首先需要对发酵前的原料进行严格的检验，确保原料的无菌性和纯度。
需要对发酵过程中的环境、设备、操作人员等方面进行监测和检测，及时发现和处理可能存在的污染源。
还需要对已发酵的毕赤酵母产品进行微生物学检测，了解发酵过程中是否存在染菌情况以及染菌程度，为后续的预防控制提供依据。
对于毕赤酵母发酵过程的染菌预防，可以从原料、环境、设备、操作人员等方面进行全面的控制和管理。
对于原料方面，要求原料的质量要求高，保证原料的无菌性和纯度。
在接收原料时，需要对原料进行检验和检测，严格控制原料的品质。
还需要对原料进行合理的储存和运输，避免在储存和运输过程中引入细菌和霉菌等污染源。
对于发酵过程中的环境、设备和操作人员等方面也需要进行严格的控制和管理。
在发酵车间内，要求保持清洁、干燥、通风良好的环境，避免空气中的细菌和霉菌引入发酵过程。
对于发酵设备和工具，要求进行定期的清洁和消毒，确保设备的无菌性和洁净度。
操作人员要求严格执行卫生操作规程，穿着合格的工作服和使用个人防护用品，避免人为的污染。
对于发酵后的毕赤酵母产品也需要进行合理的储存和运输管理。
在储存和运输过程中，要求避免产品受到污染和变质，保障毕赤酵母产品的质量和安全性。
对毕赤酵母发酵过程的染菌分析及预防策略进行研究和探讨，可以有效保障毕赤酵母的发酵质量，避免因染菌引起的发酵变质和失败。
毕赤酵母的摇瓶发酵方法[指南]
![毕赤酵母的摇瓶发酵方法[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/3ffac097d5d8d15abe23482fb4daa58da1111c5e.png)
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：一、摇瓶发酵方法:毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMMY培养基，10X的甲醇，摇瓶1L（灭菌），温控摇床，50ml离心管（灭菌）。
紫外分光光度计，石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基，然后加入约1ml脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。
置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，OD600=2.0-6.0，时间约为15-24小时。
（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。
去掉上清，用BMMY 培养基将菌体浓度稀释至OD600=1.0，约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml发酵液（绝不能超过200ml）。
（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。
连续诱导表达48小时。
（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMGY培养基的配制（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油 100ml。
BMMY培养基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甲醇 100ml。
重组毕赤酵母发酵产脂肪酶及其应用
重组毕赤酵母发酵产脂肪酶及其应用引言:脂肪酶是一种重要的生物催化剂，在食品加工、工业生产和生物医学领域中具有广泛的应用前景。
而重组毕赤酵母发酵产脂肪酶则成为了一种备受关注的方法，本文将从发酵产脂肪酶的原理、重组毕赤酵母的构建、脂肪酶应用以及前景展望等方面进行阐述。
一、发酵产脂肪酶的原理脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，其生产过程通常采用微生物发酵。
重组毕赤酵母发酵产脂肪酶的原理是通过将脂肪酶的基因导入毕赤酵母中，通过发酵过程使其表达并产生脂肪酶。
脂肪酶的基因导入毕赤酵母后，经过转录、翻译等生物过程，最终在酵母细胞内合成脂肪酶。
这种方法具有高效、经济、环境友好等优点，因此备受关注。
二、重组毕赤酵母的构建重组毕赤酵母的构建是实现发酵产脂肪酶的关键。
首先，需要从天然来源中提取脂肪酶基因。
然后，将脂肪酶基因与毕赤酵母的表达载体连接，并导入毕赤酵母细胞中。
接下来，通过筛选和培养优化等方法，得到高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母菌株。
通过这一构建过程，可以实现大规模、高效率产脂肪酶的目标。
三、脂肪酶的应用脂肪酶在食品加工、工业生产和生物医学领域中有着广泛的应用。
在食品加工领域，脂肪酶可用于改善食品的质感和口感，例如在奶制品中应用脂肪酶可使其更加顺滑、细腻。
在工业生产领域，脂肪酶可用于生产生物柴油和洗涤剂等，具有良好的环境友好性。
在生物医学领域，脂肪酶可用于药物制剂、诊断试剂和生物传感器等，对疾病的治疗和检测有着重要的作用。
四、前景展望重组毕赤酵母发酵产脂肪酶技术的发展为脂肪酶的生产和应用提供了新的途径。
随着基因工程技术的不断进步，重组毕赤酵母发酵产脂肪酶的效率将进一步提高，产量将大幅增加。
同时，脂肪酶的应用领域将不断扩展，为食品工业、化工工业和医药领域带来更多的创新和应用。
结论:重组毕赤酵母发酵产脂肪酶是一种高效、经济、环境友好的方法。
通过构建重组毕赤酵母菌株，可以实现大规模、高效率产脂肪酶的目标。
脂肪酶在食品加工、工业生产和生物医学领域中有着广泛的应用，且前景广阔。
《毕赤酵母(Pichiapastoris)LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》
《毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》一、引言随着生物技术的快速发展，酶类物质在工业、医药及生物工程等领域的应用日益广泛。
纳豆激酶作为一种天然存在的溶栓酶，因其具有良好的生物活性和稳定性而备受关注。
本文选取毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013作为纳豆激酶的生产菌株，通过对其发酵过程进行优化及发酵动力学研究，以期提高纳豆激酶的产量及发酵效率。
二、材料与方法2.1 材料本研究所用材料包括毕赤酵母LNF013菌株、发酵培养基、酶活性检测试剂等。
2.2 方法（1）发酵过程优化：通过调整培养基组成、发酵温度、pH 值、接种量等参数，对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化。
（2）发酵动力学研究：采用动力学模型对发酵过程进行描述，分析各参数对纳豆激酶产量的影响，并建立相应的数学模型。
三、结果与分析3.1 发酵过程优化结果通过调整各参数，我们发现：（1）培养基组成：适当增加碳源、氮源浓度有助于提高纳豆激酶的产量。
（2）发酵温度：在30℃左右，毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的活性较高。
（3）pH值：pH值为6.5左右时，菌株生长及纳豆激酶产量达到最佳状态。
（4）接种量：适宜的接种量有助于提高菌株的生长速度及纳豆激酶的产量。
3.2 发酵动力学研究结果通过建立动力学模型，我们发现：（1）菌体生长与纳豆激酶产量之间存在明显的相关性，可通过监测菌体生长情况来预测纳豆激酶的产量。
（2）各参数对纳豆激酶产量的影响程度不同，其中培养基组成、温度和pH值对纳豆激酶产量的影响最为显著。
四、讨论通过对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化及发酵动力学研究，我们找到了提高纳豆激酶产量的关键因素。
在实际生产中，可根据实际情况调整这些参数，以实现更高的纳豆激酶产量及发酵效率。
此外，建立的动力学模型有助于预测和调控发酵过程，为工业化生产提供有力支持。
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3.4：ML，OL，及（b）SML 过氧化物酶体的生物合成三种 不同的培养条件下比较。 SML： 切换葡萄糖和甲醇进料。在过 氧化物酶体中使用GFP-SKL （YGLY31884）进行定量测定。 数据点表示在两个独立的运行 平均值。星号（*）表示甲醇阶 段
一类荟萃
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一类荟萃
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3.5三种不同的工艺条件下（YGLY29325）发酵特性 - ML， OL和SML。 （一）细胞的密度分布（gWCW/ L）; （二）细胞列 解指数（毫克 DNA/ L）; （三）抗体效价（毫克/升）; （d） OL条件下延长诱导时间的细胞密度和抗体效价。
一类荟萃
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• AOX1启动子是在ML最活跃下，但OL下不太活跃。
SML:甲醇培养20h用50%的葡萄糖15g/h的速度培养8h作为一个周期共培养3个周期 OL:甲醇进料保持反应器中甲醇1％，每当DO迅速增加，这表明甲醇消耗。 DO级联 被打开，关闭和搅拌速度 被减小到实现氧气的限制
一类荟萃
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2.4 GFP表达的定量和可视化：
约107固定的酵母细胞经PBS洗后用mounting solution重悬制作切片用 Axioscope 2 Plus 显微镜来观察OpenLAB软件来实现相机控制和图像收 集Volocity软件用来量化GFP在细胞中的强度
一类荟萃
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3.6 在甲醇补料阶段的代谢过程（a）甲醇限定（ML）（b） 氧受限（OL）条件下补料分批巴斯德毕赤酵母的培养。
一类荟萃
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4结论与分析
在这项研究中，我们调查AOX1启动子和过氧化物酶体如何被调 节以响应碳源（例如甲醇）和氧气分子的可用性 在蛋白质生产阶 段，以更好地了解在毕赤酵母发酵常用的工艺条件。
酵母表达手册）
一类荟萃
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一类荟萃
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一类荟萃
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2.3：补料分批培养条件
研究了三种不同发酵条件下的PpAOX1启动子（ YGLY29325 ）和过氧化物酶体 生物合成（ YGLY31884 ）的调控。
诱导阶段分批补料条件
ML:甲醇的起始供应速率为2.6gl/lh然后在0.0063.5抗体效价的测定
在培养上清液中于280nm处抗体浓度用二极管阵列检测器和蛋白A亲 和柱与HPLC系统
一类荟萃
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2.6:细胞裂解
从毕赤酵母细胞释放细胞外的DNA使用 Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit 双链DNA检测试剂盒检测
一类荟萃
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3实验结果与讨论 3.1:
额外增加1%甲醇（OL）DO (%) ：
黑色直线，甘油或葡萄糖：蓝色,甲 醇:红色。细胞湿重：黑色三角
一类荟萃
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一类荟萃
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3.3毕赤酵母AOX1启动子（YGLY29325）根据三种不同的补料分批条件规制 - 甲醇 -
限制（ML），切换与葡萄糖和甲醇（SML）和氧气限制（OL）补料分批条件。 （a）
通过荧光显微术 UB - R- GFP和GFP- SKL 被正确地定位于细胞 质和过氧化物酶体， 符合预期
一类荟萃
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一类荟萃
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3.2:YGLY29325的三种不同的补料
分批发酵条件的取样数据(a) 甲醇
限制 (ML); (b) 葡萄糖培养8h甲醇 培养(20 h) (SML); (c) 氧气限制并
题目
Regulation of alcohol oxidase 1 (AOX1) promoter and peroxisom biogenesis in different fermentation processes in Pichia pastoris
毕赤酵母不同发酵进程中乙醇氧化酶启动子和过氧物酶体生物合 成 的调控规律
文章来源：Journal of biotechnology
一类荟萃
1
• 1背景介绍
• 2实验材料和方法
• 3实验结果
• 4结论与分析
一类荟萃
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背景介绍
1.1醇氧化酶AOX1基因启动子作为甲醇诱导的强启动子,在Pichia pastoris表达系统生产重组蛋白中得到广泛应用。P.pastoris中的转录 因子通过特异的顺式作用元件与启动子相互作用而影响基因的转录,因此 通过调节AOX1基因启动子的活性可以控制下游基因的表达
一类荟萃
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1. 3GFP-SKL（过氧化物酶体定位蛋白）,该载体含有融合了过氧化物酶体 定位信号1(PTS1)的绿色荧光蛋白报告分子GFP-SKL编码基因 成功地用于描 述不同 时间进程的AOX1启动子和过氧物酶体生物合成因素的特征
1.4泛素蛋白（细胞液中的短周期荧光蛋白）泛素(ubiquitin)是一种存 在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质， 使其被水解。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会 将该蛋白质水解
GFP荧光表达图像（b）不同诱导时间的荧光蛋白相对密度。对于ML和OL，时间表示分
批阶段（T1），甘油补料分批阶段诱导前（T2）和诱导期（T3，10±2小时; T4中，
36±2小时; T5，62±2小时; T6，84±2小时）。对与SML条件下，细胞生长是在T2，T4
和T6 葡萄糖阶段，诱导是在T3和T5甲醇阶一段类荟萃
一类荟萃
4
二：实验材料和方法
2.1：质粒的构建
表达GFP- SKl pGLY11245或pGLY13173 转化YGLY27355或YGLY31884 YGLY14836生 产单克隆IgG1抗体
表达Ub-R-GFP pGLY10148转化 YGLY19309或YGLY29325 生产单克隆IgG1抗体 2.2：转化：毕赤酵母感受态的制备和电转化的方法（参见nvitrogen公司的Pichia