真菌胞内蛋白质提取方法的建立
真菌蛋白提取方法
真菌蛋白提取方法一TCA/丙酮法1 液氮将菌体研磨为粉末；2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮（含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇），过夜沉降；3 4 度20,000g 离心15 min；4 移处上清，用冰冷的含0.07% (v/v) β－巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次；5 离心后，沉淀干燥至丙酮挥发完全。
二酚抽提法1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末2 加入 6 ml 水饱和酚（buffer-saturated phenol）和 2 ml提取液（20mMTris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。
3 在4度混合30分钟。
4 12000 rmp 离心1min，使两相分开。
5 弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。
6 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。
7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。
三提取液抽提丙酮沉淀法1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。
2 取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。
3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液（20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。
4 混匀后4度震荡30分钟，以便蛋白溶解。
5 12000 rmp，4度，离心15分钟，吸取上清于另一EP管中。
7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮（含有0.07％β－巯基乙醇），混匀，－20℃，2小时沉淀蛋白质。
8 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白。
弃去上清，沉淀用乙醇洗三次，自然干燥蛋白沉淀。
四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。
提取蛋白质的具体步骤
提取蛋白质的具体步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：提取蛋白质是生物科学研究中非常重要的一个步骤，它能够帮助研究人员深入了解蛋白质的结构和功能。
下面将为您介绍一些常用的提取蛋白质的具体步骤，希望能对您有所帮助。
1. 选择样本：在进行蛋白质提取前，首先需要选择合适的样本。
样本可以是动植物组织、微生物、细胞等。
在选择样本时，需要考虑到所需提取的蛋白质种类和含量。
2. 细胞破碎：将样本破碎是提取蛋白质的第一步。
通过机械或化学方法破碎细胞壁，释放出蛋白质。
常用的方法包括超声波破碎、研钵研磨、高压破碎等。
3. 细胞裂解：将破碎后的细胞溶液进行裂解是提取蛋白质的下一步。
裂解可使蛋白质从细胞内释放出来。
常用的裂解方法包括离心、温度变化、酸碱处理等。
4. 蛋白质沉淀：裂解后的细胞溶液含有大量的蛋白质和其他杂质，需要进行沉淀分离。
常用的方法包括盐析、醇沉、酸沉淀等。
5. 蛋白质纯化：通过进一步的分离和纯化步骤，可以得到纯度较高的蛋白质。
常用的方法包括柱层析、凝胶电泳、亲和纯化等。
6. 蛋白质鉴定：最后一步是对提取得到的蛋白质进行鉴定和分析。
常用的鉴定方法包括质谱分析、Western blotting等。
以上就是提取蛋白质的具体步骤。
通过这些步骤，研究人员可以有效地提取并纯化蛋白质，为后续的实验和研究提供重要的支持。
希望以上内容对您有所帮助，谢谢！第二篇示例：蛋白质是生物体中重要的基本分子，具有多种生物学功能，包括结构支持、酶催化、信号传导等。
提取蛋白质是生物学研究中常用的实验方法之一。
下面我将介绍提取蛋白质的具体步骤。
1. 样品的制备首先要准备待提取的生物样品，可以是细胞、组织或者生物体。
样品的制备包括收集、洗涤、离心等步骤，确保样品的纯度和完整性。
2. 细胞破碎对于细胞样品，需要先将细胞破碎以释放蛋白质。
常用的细胞破碎方法包括超声波破碎、高压破碎、冻融破碎等，选择适合样品的方法进行破碎。
3. 蛋白质溶解破碎后的细胞溶液需要进行蛋白质溶解，这可以通过添加盐溶液、表面活性剂或有机溶剂等方法来实现。
真菌蛋白提取方法
真菌蛋白提取方法一TCA/丙酮法1 液氮将菌体研磨为粉末；2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮（含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇），过夜沉降；3 4 度20,000g 离心15 min；4 移处上清，用冰冷的含0.07% (v/v) β－巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次；5 离心后，沉淀干燥至丙酮挥发完全。
二酚抽提法1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末2 加入 6 ml 水饱和酚（buffer-saturated phenol）和 2 ml提取液（20mMTris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。
3 在4度混合30分钟。
4 12000 rmp 离心1min，使两相分开。
5 弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。
6 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。
7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。
三提取液抽提丙酮沉淀法1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。
2 取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。
3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液（20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。
4 混匀后4度震荡30分钟，以便蛋白溶解。
5 12000 rmp，4度，离心15分钟，吸取上清于另一EP管中。
7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮（含有0.07％β－巯基乙醇），混匀，－20℃，2小时沉淀蛋白质。
8 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白。
弃去上清，沉淀用乙醇洗三次，自然干燥蛋白沉淀。
四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。
蛋白质的分离提取方法
蛋白质的分离提取方法
蛋白质分离提取是生物分析中一种常见的分析方法。
它能够从各种细胞和蛋白溶液中分离提取出有用的蛋白质，并有效地检测蛋白质的结构和功能。
一般来说，蛋白质分离提取的具体工艺如下：
1.抽提溶解：通常，抽提溶解的工艺是将细胞或蛋白溶液抽提成单独的溶液，再通过更细的滤器或繁复的曲折手段将其中的一些蛋白分离提取出来。
抽提的溶液可以是一种细胞因子或去离子水，也可以是添加有特定蛋白的溶液。
抽提的方法包括溶胀（如乳酸钠溶解）、离心离液（如凝胶离心）、沉淀（如滤渣沉淀）和浓缩（如滤渣浓缩）等。
2.冷冻干燥：冷冻干燥的技术是改变物质的温度以及蒸发蒸馏，以将抽提的蛋白质溶解体转变为晶体状态。
冷冻干燥的具体工艺主要有：先冷冻、改变气压、蒸发水份，再加热恢复溶液容量。
3.结构分离：结构分离是指对抽提的蛋白质进行多种物理和化学方法分离提取，通过改变结构和性质来识别和纯化特定蛋白质。
结构分离的方法包括电泳（例如乳糖电泳）、离心离液（例如凝胶离心）、层析（例如膜滤层析）等。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
微生物蛋白提取和分离纯化
微生蛋白提取和分离纯化
预处理
菌体表达的胞外酶
上清（滤液）
菌体表达的胞外酶分解培养基形成的小肽 及一些氨基酸成分
未分解利用的部分培养基
沉淀（滤饼）
胞内匀浆：胞内表达的酶，小肽
微生物蛋白提取和分离纯化
离子交换柱层洗析脱液的的流速操也会作影响要离子点交换层析 分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。
• 1.平衡缓冲液
一般洗脱速度慢比快的分辨率要好， 但洗脱速度过慢会造成分离时间长、
• 2.上样
样品扩散、谱峰变宽等副作用，所以 要根据实际情况选择合适的洗脱速度。
• 3.洗脱缓冲液要保证各个待如分果离洗物脱质峰（相如对蛋集白中质某）个的区稳域定造；成要重使各 个待分离物首质先叠与要，离保则子证应交在适换整当剂个缩有洗小适脱梯当液度的梯范结度围合范或，围降并内低尽，洗量使
– 一般来说，pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响 较大，如对于弱酸酸型离子交换剂在pH较高时， 电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的 pH时，电荷基团不易解离，交换容量小；同时 pH也影响样品组分的带电性。
– 离子强度增大，交换容量则下降。实验中增大 离子强度进行洗脱，就是要通过降低交换容量 把结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。
微生物蛋白提取和分离纯化
层析过程
– （1）装柱 – （2）平衡（equilibrium) – （3）上样(loading) – （4）洗涤(washing) – （5）洗脱(elution) – （6）清洗与再生
微生物蛋白提取和分离纯化
离子交换柱特点
➢料液处理量大，在适宜的操作条件下，分离 过程具有浓缩作用；
真菌胞内蛋白质提取方法的建立
［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０５９０－０５［收稿日期］ ２０１１－０８－１５［基金项目］ 国家自然科学基金资助课题（３０９１０１０３９０３，３０７７０１２０）［作者简介］ 王 爽（１９７６－），女，吉林省长春市人，主治医师，医学博士，主要从事真菌分子学鉴定及耐药机制的研究。
［通信作者］ 王 丽（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９４８６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｌｉ９９＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）真菌胞内蛋白质提取方法的建立王 爽１，２，姜兰香１，张 宇２，３，贺 丹２，田 庄２，高 嵩２，横山耕治４，王 丽２（１．吉林大学第二医院皮肤科，吉林长春１３００４１；２．吉林大学白求恩医学院病原生物学系，吉林长春１３００２１；３．吉林大学第二医院检验科，吉林长春１３００４１；４．日本千叶大学真菌研究中心，日本千叶２６０－８６７３）［摘 要］ 目的：研究不同的提取方法对白假丝酵母和茄病镰刀菌胞内蛋白质浓度、种类及数量的影响，为建立一种稳定可靠的真菌胞内蛋白质提取方法提供依据。
方法：分别以白假丝酵母菌和茄病镰刀菌为研究对象，培养时间为３６、４８和７２ｈ，超声波工作时间为２０ｓ、３ｍｉｎ、５ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，超声波功率为３３２．５和４７５．０Ｗ，通过蛋白质浓度检测和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白质电泳分析，比较不同条件下提取的蛋白质浓度、种类及数量，观察不同因素对蛋白质提取效果的影响。
结果：２株真菌均在培养３６ｈ时提取胞内蛋白质的浓度最大，白假丝酵母在功率３３２．５Ｗ、超声３ｍｉｎ时得到胞内蛋白质的数量和种类最多，茄病镰刀菌在功率３３２．５Ｗ、超声１０ｍｉｎ时得到蛋白质的数量和种类最多。
结论：使用超声波法与玻璃珠研磨法结合提取胞内蛋白质，从菌株的培养时间、超声波工作时间和功率３方面建立了真菌胞内蛋白质的最佳提取方法。
［关键词］ 白假丝酵母；茄病镰刀菌；超声波；培养时间［中图分类号］ Ｒ３７９．２ ［文献标志码］ ＡＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ ｆｕｎｇｕｓＷＡＮＧ Ｓｈｕａｎｇ１，２，ＪＩＮＧ Ｌａｎ－ｘｉａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ２，３，ＨＥ Ｄａｎ２，ＴＩＡＮ Ｚｈｕａｎｇ２，ＧＡＯ Ｓｏｎｇ２，ＫＯＪＩ Ｙｏｋｏｙａｍａ４，ＷＡＮＧ Ｌｉ ２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００４１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００４１，Ｃｈｉｎａ；４．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｂｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｉｂａ ２６０－８６７３，Ｊａｐａｎ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ｔｉｍｅ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ｏｎ ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｙｐｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌｉｎａ ａｎｄ ｔｏｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍｆｕｎｇｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌｉｎａ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ．Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ（３６，４８，ａｎｄ ７２ｈ），ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ（２０ｓ，３ｍｉｎ，５ｍｉｎ，ａｎｄ １０ｍｉｎ）ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ（３３２．５Ｗａｎｄ ４７５．０Ｗ）．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｂｏｔｈ ｓｔｒａｉｎｓ ｇｏｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｑｕａｎｔｉｔｙｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｅｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒ ３６ｈ．Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ｗａｓ ３３２．５Ｗａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３ｍｉｎ，ｂｕｔ ａｓ ｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌｉｎａ，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ３３２．５Ｗａｎｄ １０ｍｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙｃｏｍｐｏｓｉｔｅｌｙ ｕｓｉｎｇ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ０９５第３８卷 第３期２０１２年５月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２０１２ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｆｕｎｇｕｓ ｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｗｏｒｋｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ；ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ；ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ 随着免疫力低下或免疫缺陷患者等易感人群的不断增加，条件致病性真菌感染的发生率呈上升趋势，严重威胁患者的健康和生命［１－２］，真菌致病和耐药机制的研究已成为当前研究的热点问题。
蛋白质提取的方法和原理
蛋白质提取的方法和原理
1、蛋白质提取方法
1.1 热处理法
热处理是一种简单而有效的蛋白质提取方法，通过高温高压或烧
焦来破坏细胞壁和细胞膜，并释放出蛋白质。
如热溶液法、微波法、
热压法等。
1.2 酸碱法
酸碱法是一种常用的蛋白质提取方法，通过改变蛋白质的电荷性质，使其带有正负电荷，从而在特定的pH下沉淀出来。
如硫酸钾法、
亚硫酸盐法、三氯乙酸法等。
1.3 有机溶剂法
有机溶剂法是一种常见的蛋白质提取方法，常用有机溶剂如甲醇、丙酮、氯仿等，通过溶解细胞膜并使蛋白质溶于有机溶剂中，经离心
分离得到蛋白质。
如甲醇法、氯仿法、醋酸纤维素膜法等。
1.4 冻融法
冻融法是一种新兴的蛋白质提取方法，通过冻结细胞后迅速回温，使细胞壁破裂并释放出蛋白质。
该方法不需要使用有机溶剂或酸碱处理，可避免蛋白质的降解和失活。
2、蛋白质提取的原理
蛋白质提取的原理是利用特定的化学物质或物理条件，破坏细胞
膜和细胞壁，从而释放出蛋白质。
蛋白质在细胞内可以存在于细胞膜、细胞壁、细胞质或细胞核中，提取蛋白质需要根据不同的生物学样品
及其组分情况采用不同的方法。
其中，热处理法是利用高温高压或烧焦等方式破坏细胞壁和细胞膜，从而释放出蛋白质；酸碱法是通过改变蛋白质的电荷性质，在特
定的pH值下使其沉淀出来；有机溶剂法是利用有机溶剂溶解细胞膜，
并使蛋白质溶于有机溶剂中；冻融法则是通过冻结细胞后迅速回温，
使细胞壁破裂并释放出蛋白质。
在蛋白质提取过程中，需要注意避免蛋白质的降解和失活，以及
尽量减少对蛋白质的污染。
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［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０５９０－０５［收稿日期］ ２０１１－０８－１５［基金项目］ 国家自然科学基金资助课题（３０９１０１０３９０３，３０７７０１２０）［作者简介］ 王 爽（１９７６－），女，吉林省长春市人，主治医师，医学博士，主要从事真菌分子学鉴定及耐药机制的研究。
［通信作者］ 王 丽（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９４８６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｌｉ９９＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）真菌胞内蛋白质提取方法的建立王 爽１，２，姜兰香１，张 宇２，３，贺 丹２，田 庄２，高 嵩２，横山耕治４，王 丽２（１．吉林大学第二医院皮肤科，吉林长春１３００４１；２．吉林大学白求恩医学院病原生物学系，吉林长春１３００２１；３．吉林大学第二医院检验科，吉林长春１３００４１；４．日本千叶大学真菌研究中心，日本千叶２６０－８６７３）［摘 要］ 目的：研究不同的提取方法对白假丝酵母和茄病镰刀菌胞内蛋白质浓度、种类及数量的影响，为建立一种稳定可靠的真菌胞内蛋白质提取方法提供依据。
方法：分别以白假丝酵母菌和茄病镰刀菌为研究对象，培养时间为３６、４８和７２ｈ，超声波工作时间为２０ｓ、３ｍｉｎ、５ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，超声波功率为３３２．５和４７５．０Ｗ，通过蛋白质浓度检测和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白质电泳分析，比较不同条件下提取的蛋白质浓度、种类及数量，观察不同因素对蛋白质提取效果的影响。
结果：２株真菌均在培养３６ｈ时提取胞内蛋白质的浓度最大，白假丝酵母在功率３３２．５Ｗ、超声３ｍｉｎ时得到胞内蛋白质的数量和种类最多，茄病镰刀菌在功率３３２．５Ｗ、超声１０ｍｉｎ时得到蛋白质的数量和种类最多。
结论：使用超声波法与玻璃珠研磨法结合提取胞内蛋白质，从菌株的培养时间、超声波工作时间和功率３方面建立了真菌胞内蛋白质的最佳提取方法。
［关键词］ 白假丝酵母；茄病镰刀菌；超声波；培养时间［中图分类号］ Ｒ３７９．２ ［文献标志码］ ＡＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ ｆｕｎｇｕｓＷＡＮＧ Ｓｈｕａｎｇ１，２，ＪＩＮＧ Ｌａｎ－ｘｉａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ２，３，ＨＥ Ｄａｎ２，ＴＩＡＮ Ｚｈｕａｎｇ２，ＧＡＯ Ｓｏｎｇ２，ＫＯＪＩ Ｙｏｋｏｙａｍａ４，ＷＡＮＧ Ｌｉ ２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００４１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００４１，Ｃｈｉｎａ；４．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｂｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｉｂａ ２６０－８６７３，Ｊａｐａｎ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ｔｉｍｅ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ｏｎ ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｙｐｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌｉｎａ ａｎｄ ｔｏｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍｆｕｎｇｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌｉｎａ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ．Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ（３６，４８，ａｎｄ ７２ｈ），ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ（２０ｓ，３ｍｉｎ，５ｍｉｎ，ａｎｄ １０ｍｉｎ）ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ（３３２．５Ｗａｎｄ ４７５．０Ｗ）．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｂｏｔｈ ｓｔｒａｉｎｓ ｇｏｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｑｕａｎｔｉｔｙｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｅｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒ ３６ｈ．Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ｗａｓ ３３２．５Ｗａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３ｍｉｎ，ｂｕｔ ａｓ ｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌｉｎａ，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ３３２．５Ｗａｎｄ １０ｍｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙｃｏｍｐｏｓｉｔｅｌｙ ｕｓｉｎｇ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ０９５第３８卷 第３期２０１２年５月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２０１２ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｆｕｎｇｕｓ ｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｗｏｒｋｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ；ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ；ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ 随着免疫力低下或免疫缺陷患者等易感人群的不断增加，条件致病性真菌感染的发生率呈上升趋势，严重威胁患者的健康和生命［１－２］，真菌致病和耐药机制的研究已成为当前研究的热点问题。
真菌感染性疾病的发生发展和抗真菌药物的作用，多数是在蛋白质水平上进行的［３］。
因此，在蛋白质水平上研究真菌的致病机制和耐药机制具有重大意义。
在真菌蛋白质组学研究中，获取相关胞内蛋白质是研究的首要问题。
真菌的细胞壁坚韧、不易被破碎，胞内蛋白质难以被释放，在破碎细胞壁的同时，如何减少胞内蛋白质损失非常关键。
目前，国内外常用的真菌破壁方法有超声波法、液氮冷冻研磨法和玻璃珠法等，其中超声波破壁操作简便，但是真菌破壁时间较长，超声工作时产生热量易引起蛋白质降解；液氮冷冻研磨在真菌的ＤＮＡ和蛋白质提取中均可应用，但液氮极易挥发，操作困难；而单纯玻璃珠研磨很难将菌丝体打散使细胞有效裂解。
也有部分研究者［４－６］制备原生质体提取蛋白质，但是其制备过程繁琐，得到数量很少，很难满足蛋白质研究需要。
本研究以２种较为常见的病原真菌白假丝酵母和茄病镰刀菌作为研究对象，联合使用几种破壁方法，在改变菌体培养时间、超声波功率以及工作时间３个条件下，比较不同提取条件下得到的胞内蛋白质浓度、种类及数量，旨在建立一种稳定、可靠的真菌胞内蛋白质提取方法。
１ 材料与方法１．１ 菌株、试剂与仪器 白假丝酵母ＪＬＣ ３０６９９和茄病镰刀菌ＪＬＣ ３０８７９均为临床分离株，由吉林大学真菌研究中心保藏。
ＨＺＱ全温震荡培养箱购自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；冷冻高速离心机（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｐｒｉｍｏｒ）购自力康生物发展有限公司；电子分析天平（ＡＢ２０４－Ｎ）购自梅特勒－托利多仪器上海有限公司；超声波细胞粉碎机（ＳＣＩＥＮＴＺ ＩＩＤ）购自宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外分光光度计（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ ６００）购自美国Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）、马铃薯葡萄糖液体培养基（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ，ＰＤＢ）购自美国Ｄｉｆｃｏ公司；尿素、硫脲、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、３－［３－（胆酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸内盐（ＣＨＡＰＳ）、苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）、蛋白纯化试剂盒Ｃｌｅａｎ－ｕｐｋｉｔ等试剂购自美国Ａｍｅｒｓｈａｍ－Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司。
１．２ 菌株的培养 白假丝酵母在ＰＤＡ斜面培养基上３７℃培养２４～４８ｈ，茄病镰刀菌在ＰＤＡ斜面培养基上２８℃培养３～５ｄ。
用无菌的生理盐水将其制备成浓度为１×１０７ ＣＦＵ·ｍＬ－１的菌悬液。
各取３０μＬ分别接种于３０ｍＬ ＰＤＢ液体培养基中，分别在３７℃和２８℃振荡培养３６～７２ｈ。
１．３ 胞内蛋白质的提取 分别于培养３６、４８和７２ｈ后，以３ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ收集菌体。
无菌蒸馏水洗涤菌体３次，３ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，弃上清。
每２００ｍｇ菌体（湿重）加１００μＬ蛋白质提取液Ⅰ（７．５ｍｏｌ·Ｌ－１尿素、２．５ｍｏｌ·Ｌ－１硫脲、２０．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＰＭＳＦ、１．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ、１０．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ Ｔｒｉｓ、２０．０ｍｇ·Ｌ－１Ｄｎａｓｅ、５．０ｍｇ·Ｌ－１ Ｒｎａｓｅ，ｐＨ ７．４），室温作用２０ｍｉｎ后；降温至０℃后，以３３２．５Ｗ功率超声５ｍｉｎ，得到混合液。
再加入３００ｍｇ酸洗玻璃珠（玻璃珠直径≥０．５ｍｍ），充分研磨１０ｍｉｎ后，１ ８００ｒ·ｍｉｎ－１涡旋振荡１０ｍｉｎ；然后加入２５μＬ蛋白质提取液Ⅱ（２％ＣＨＡＰＳ，１％ＤＴＴ，ｐＨ ９．０），涡旋振荡３０ｓ后，置于冰上１ｍｉｎ，该步骤重复６次。
１４ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，留取上清。