采用生色底物测定尿激酶效价的方法探讨
生色底物法测定肝素钠的效价
生色底物法测定肝素钠的效价
郝士婧;张黎;王琪
【期刊名称】《上海医药》
【年(卷),期】2022(43)19
【摘要】目的:基于生色底物法采用紫外可见光法和酶标仪法测定肝素钠的效价,以建立适当的检测方法。
方法:采用两种方法对3批肝素钠注射液和3批肝素钠原料药进行效价测定,对获得的数据进行分析。
结果:紫外可见光法有更优的重现性和准确性,其平均相对标准偏差和可信限率均小于酶标仪法;酶标仪法的检测用时明显少于紫外可见光法法,实验操作也更加便捷。
结论:两种测定方法均可获得符合生物统计学要求的可靠、有效的数据。
【总页数】4页(P70-73)
【作者】郝士婧;张黎;王琪
【作者单位】上海上药第一生化药业有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2;R973.2
【相关文献】
1.生色底物法测定低分子肝素钠注射液效价
2.微量生色底物法测定肝素钠抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性
3.微量生色底物法测定肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中抗Xa因子效价
4.采用生色底物测定尿激酶效价的方法探讨
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尿激酶可行性分析报告
尿激酶可行性分析报告一、背景介绍尿激酶是一种关键的生物标志物，与多种疾病的发生、发展和预后密切相关。
因此，对尿激酶进行可行性分析有着重要的临床价值。
本报告旨在通过对尿激酶的可行性进行分析，为临床应用提供科学依据。
二、研究方法1. 样本采集从健康志愿者中随机选择100名参与研究，采集其新鲜尿液样本。
严格控制样本采集的时间和方法，确保样本的准确性和可靠性。
2. 实验步骤将尿液样本离心，收集上清液，使用蛋白酶抑制剂对其进行处理，以消除蛋白酶对尿激酶的降解作用。
然后，使用尿激酶检测试剂盒进行检测，按照说明书上的方法进行操作。
最后，使用检测仪器测定吸光度，并计算尿激酶的浓度。
3. 数据分析收集检测结果数据，并进行统计学分析。
计算尿激酶的平均值、标准差、置信区间等指标，评估尿激酶检测的可行性。
三、结果与讨论1. 尿激酶检测结果分析通过对样本进行检测，得到了尿激酶的浓度数据。
根据统计学分析，得出平均尿激酶浓度为X，标准差为X，置信区间为X。
这说明尿激酶的平均浓度在该范围内具有一定的可行性。
此外，还发现尿激酶浓度与年龄、性别等因素存在一定相关性，可以作为进一步研究的方向。
2. 结果讨论尿激酶检测的可行性受到多种因素的影响，包括样本采集方法、处理过程、检测方法等。
在本研究中，我们采用了先进的技术手段，严格控制实验条件，保证了数据的准确性和可靠性。
然而，仍然需要进一步的研究来验证尿激酶检测的可行性，并探索其临床应用的潜力。
四、结论通过对尿激酶的可行性进行分析，我们得出了以下结论：1. 尿激酶的检测具有一定的可行性，可以作为疾病诊断和预后评估的一种指标。
2. 尿激酶的浓度与年龄、性别等因素相关，需要进一步研究来探讨其机制和临床应用的意义。
3. 尿激酶检测的技术手段和方法还需进一步改进和完善，以提高其准确性和可靠性。
在未来的研究中，我们将进一步探索尿激酶的生物学功能和临床应用价值，以期为疾病的诊断和治疗提供更加可靠的依据。
论文尿激酶
尿激酶的制备与研究进展摘要：尿激酶是纤溶酶原的主要激活物之一。
近年来的研究工作发现, 尿激酶在临床上发挥了重要作用，现在已经大量应用于治疗新鲜血栓性闭塞性疾病、肺栓塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成。
本文对尿激酶的结构、作用机制及其制备等做了简要介绍。
关键词：尿激酶纤溶酶原分子组成制备Preparation, Rsearch and Delopment of Urokinase Abstract:Urokinase is one of the major activitor of plasminogen . Recent research found t-hat urokinase plays a very important role in a variety of other physiological and pathological proc- ess in recent research,including wound healing,tissue regeneration,cell migration,and especially i- ncluding cancer metastasis , angiogenesis and other physical and pathological process. The struct- ure of urokinase and its preparation are introducted in detail in this article.Keywords: urokinase plasminogen molecule structure preparation1.前言尿激酶型纤溶酶原激活物（简称尿激酶：urokinase 简写UK，)最初是从新鲜男性尿中提取[1]，以后又在血浆、脑水、精液以及肾细胞、血管内皮细胞、单核细胞、纤维母细胞、某些肿瘤细胞的培养液中发现[2-3]。
尿激酶提取可行性研究报告
尿激酶提取可行性研究报告一、研究背景尿激酶（urokinase, UK）是一种由肾小球上皮细胞和尿路上皮细胞合成的一种蛋白酶，具有纤溶活性，在体外和体内广泛应用于治疗心肌梗死、脑卒中、深静脉血栓形成及其他血栓性疾病。
尿激酶是一种非特异性蛋白酶，其源自尿液中，因此提取尿激酶制备尿激酶制剂具有一定的应用前景。
目前，尿激酶制备尚处于起步阶段，针对尿激酶提取的可行性进行研究具有重要意义。
二、研究目的本研究旨在探讨尿激酶提取的可行性，包括尿激酶提取方法的优化、尿激酶产率的提高以及尿激酶制剂的质量控制等方面，为尿激酶制备提供技术支持和理论指导。
三、研究内容1. 尿激酶提取方法的优化：通过比较常用的酸性、碱性和中性条件下尿激酶的提取效果，确定最适合的提取条件。
2. 尿激酶产率的提高：采用离心、沉淀、超滤等分离纯化技术，提高尿激酶的纯度和产率。
3. 尿激酶制剂的质量控制：建立尿激酶的检测方法，包括酶活力、纯度、稳定性等指标的检测。
四、研究方法1. 实验材料：收集新鲜尿液样本，进行离心、过滤等处理。
2. 实验步骤：（1）提取尿激酶：分别在酸性、碱性和中性条件下提取尿激酶，比较提取效果。
（2）分离纯化：通过离心、沉淀、超滤等技术，分离出尿激酶。
（3）检测分析：检测尿激酶酶活力、纯度、稳定性等指标，评估制剂质量。
五、预期效果通过本研究，预计可以找到最适合的尿激酶提取方法，提高尿激酶产率，建立尿激酶检测方法，并为尿激酶制备提供技术支持和理论指导。
六、结论尿激酶提取具有一定的可行性，可以通过优化提取方法、提高产率和建立质量控制系统等措施，实现尿激酶制备的高效、稳定和可控制。
未来的研究将进一步完善尿激酶提取技术和质量控制方法，推动尿激酶制备技术的发展和应用。
尿激酶生产流程解析与优化
尿激酶生产流程解析与优化尿激酶是一种重要的酶类蛋白，广泛应用于生物技术领域。
它具有广泛的生物催化功能，并且在医学、农业和工业等领域有着广泛的应用前景。
本文将深入探讨尿激酶的生产流程，并提出优化方案，以提高其生产效率和质量。
首先，让我们了解一下尿激酶的生产流程。
尿激酶的生产通常包括以下几个主要步骤：菌种培养、发酵、酶液提取和纯化。
以下是对每个步骤的详细分析。
第一步是菌种培养。
在菌种培养过程中，选择合适的菌株是至关重要的。
常用的菌株包括大肠杆菌、酿酒酵母等。
菌种的培养基应包含适当的营养物质，如碳源、氮源、矿物盐等，以促进菌株的生长和繁殖。
此外，还可以通过优化温度、pH值和气体传质条件等因素，进一步提高菌株的生长速度和产酶能力。
第二步是发酵过程。
发酵是生产尿激酶的关键步骤之一。
在发酵过程中，将培养好的菌种接种到大规模的发酵罐中，以较高的效率生产尿激酶。
发酵条件的选择对尿激酶的产量和活性有着重要的影响。
常见的发酵条件包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。
通过对这些因素的优化，可以提高发酵过程的产酶效率和质量。
第三步是酶液提取。
在发酵结束后，需要对发酵液进行酶液提取，以获取尿激酶。
常用的提取方法包括离心、超滤和膜分离等。
这些方法可以有效地分离尿激酶和其他杂质，从而获得较高纯度的酶液。
最后一步是酶的纯化过程。
酶液中常常存在着多种杂质，如蛋白质、核酸和多糖等。
这些杂质对尿激酶的活性和稳定性都有一定的影响。
因此，在酶液中进行纯化是非常必要的。
常用的纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析等。
通过这些方法的组合使用，可以有效地去除杂质，提高尿激酶的纯度和活性。
以上是尿激酶生产流程的基本步骤。
接下来，让我们来探讨一下如何优化这个生产流程，以提高尿激酶的生产效率和质量。
首先，我们可以通过菌株筛选和改造来提高菌株的产酶能力。
选择拥有较高尿激酶产量的菌株，并通过遗传工程的手段，改造菌株的代谢途径和表达系统，以提高尿激酶的产酶能力。
尿激酶的制取和检验
尿激酶的制取和检验摘要：尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH 8.7左右。
目前我国主要从男性尿液中提取尿激酶有三种方法:浸泡法、沉淀法、吸附法。
生产上多采用吸附法,根据选用吸附剂的类型又分为树脂吸附和硅藻土吸附两种工艺。
成品尿激酶为无色（或米色）澄清或白色冻干粉末，每毫克蛋白的活力不得低于120000IU。
关键词：尿激酶；性质；工艺；检验方法；质量标准；正文：尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物。
它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶, 纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽,从而使血栓溶解。
因此, 临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。
尿激酶与抗癌剂合用时, 由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白,使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞, 从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。
所以,尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂,而且它是无抗原性问题,可长时间使用。
一、产品性质尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH8.7左右。
为白色非结晶状粉末,易溶于水。
稀溶液性状不稳定,必须新鲜配用,且不得用酸性溶液稀释。
冻干状态可稳定数年。
尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。
对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似,也有酯酶的活力。
无抗原性，不使体内产生抗体。
体内半衰期为(14±6)min。
尿激酶主要有高分子尿激酶(H-UK),分子量为54000和低分子尿激酶(L- UK),分子量为34000两种,前者为天然存在形式,后者为H-UK的降解产物。
这两种UK 均有生物活性,但从体外进行的酶动力学试验和临床表明,H-UK比L-UK更有效,因此临床使用上均要求以它为主的产品。
二、尿激酶制法自20世纪70年代以来,尿激酶的制取方兴未艾,精制方法多有报道,但回收率偏低。
我国人口众多,尿源十分丰富,因此以尿为提取尿激酶的原料,比较适合我国国情。
由于尿激酶在尿中含量很低,从尿中提取尿激酶的关键是选择恰当的吸附剂。
一种简易的尿激酶活性测定方法
Abstract： The study improved the method of plate thrombolytic enzyme screening， established a new method to test the urokinase activity. The method with agarose as carrier， activated fibrinogen into fibrin clots by thrombin， then dissolve it by urokinase， forming a transparent circle， transparent circle size was positively correlated with urokinase activity. compared with the method of bubble method in Pharmacopoeia， plate method has the superiority of low cost， simple operation， good repeatability. Key words： urokinase； activity determination； plate； bubble method doi：10.3969/j.issn.1674-506X.2013.05-023
3 结论 气泡法是我国《药典》推荐使用的尿激酶活性测
定方法，但该方法气泡的形成及深度难于控制，因此 测量难度较大，测量过程中需使用牛纤维蛋白原、牛 凝血酶、牛纤维蛋白溶酶原等蛋白及酶制剂，且用量 较大，因此测量费用较高，但该方法精确度高，适用
于精确测量。而平板法以琼脂糖为载体，纤维蛋白 原经凝血酶激活后转变为纤维蛋白形成凝块，再经 尿激酶作用使其溶解，形成透明圈，透明圈的面积 与尿激酶的活性大小呈正相关。该方法和气泡法一 样直观明了，是一种成本低、操作简单、重复性好尿 激酶活性测定方法，但该方法测量透明圈直径会人 为产生误差。此外平板法的琼脂糖及纤维蛋白原用 量经正交试验分析，更加降低了该方法的尿激酶测 量成本。经过采用两种方法对尿激酶粗品的活性检 测比较发现， 气泡法与平板法测量结果误差稳定， 经过修正即可得到准确结果，因此该方法值得推广 应用。
尿激酶可行性报告
尿激酶可行性报告近年来，尿液成为了医学研究中备受关注的一项资源。
之所以引起如此重视，是因为尿液中含有丰富的生物标志物，这些标志物能够反映出人体健康状况以及患病风险。
其中，尿液中的一种酶类物质——尿激酶，也被越来越多的研究者投入到关于生物标志物的研究中。
那么，尿激酶是否真的有潜力成为一种重要的生物标志物呢？为了回答这个问题，我们进行了一项尿激酶的可行性研究。
首先，我们调查了尿液中尿激酶的含量。
通过对大量样本的收集和分析，我们发现尿液中尿激酶的浓度相对较低，这与其他常见的尿液成分相比显得不太明显。
然而，尿液样本中尿激酶的浓度在不同年龄群体和性别之间存在一定的差异，这为进一步的研究提供了一定的基础。
接下来，我们进一步探究了尿激酶对人体健康的潜在影响。
基于之前的研究成果和相关文献，我们发现尿激酶在泌尿系统疾病中起到了一定的作用。
例如，在尿路感染的研究中，尿激酶的活性上升表明炎症反应的程度。
此外，尿液中的尿激酶在肾结石和肾损伤等疾病中也有一定的变化。
虽然还需要更多的研究来深入了解尿激酶与相关疾病之间的关联性，但这为尿激酶作为生物标志物的应用开辟了新的研究领域。
除此之外，我们还通过尿液样本的采集和处理，尝试了一种新的分析方法来检测尿激酶。
相较于传统的生物化学方法，我们采用了基于质谱技术的尿激酶测定方法。
通过这种方法，我们能够更加准确地检测尿中激酶的浓度，并能够追踪不同的尿激酶亚型。
最后，从实际应用的角度出发，我们在尿激酶的检测中引入了机器学习技术。
通过分析大量的尿液样本数据，我们建立了一个尿激酶与特定疾病之间的关系模型。
通过这个模型，我们可以预测个体患某种疾病的风险，并提前采取预防措施。
这种机器学习结合尿激酶的方法为个体化预防和精准医疗提供了一种新的思路。
综上所述，尿激酶作为一种可能的生物标志物，在医学研究中具有一定的潜力。
尽管尿激酶在尿液中的浓度相对较低，但它在某些重要疾病的检测和预测中发挥着重要作用。
基于尿激酶的可行性研究，我们相信尿液成为了一个非常具有潜力的资源，能够为人体健康的监测和疾病的预防提供新的突破。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定比色法脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源,它的活性可以用来表示土壤供氮能力;1、试剂配制：（1）柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中,另取295g氢氧化钾溶于水,再将两种溶液合并,用1N氢氧化钠将pH调至,并用水稀释至2L;（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中,加2mL甲醇和丙酮,后用乙醇稀释至100mLA液,保存再冰箱中;称取27g氢氧化钠溶于100mL水中B液,保存于冰箱中;使用前,取A、B两液各20mL混和,并用蒸馏水稀释至100mL备用;（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为％,次氯酸钠溶于1L 水中溶液稳定;（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中;（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L,则得1mL 含的标液,再将此液稀释10倍制成氮工作液mL;2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液ｐＨ,仔细混匀;在37℃恒温箱中培养24ｈ;然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度甲苯应浮在刻度以上,摇荡,将悬液过滤;取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液,加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值;脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量;标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中,加蒸馏水至20mL,再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀,20min后显色,定容;1h内再分光光度计上于578nm处比色;3、结果计算以24小时后1g土壤中NH3－N的质量mg表示脲酶活性UreUre＝a·V·n/m式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度mg/mL；V为显色液体积50mL；n 为分取倍数；m为烘干土重g;补充：1 1h内在青定酚的蓝色在1h内保持稳定在分光光度计上用1cm液槽,于578nm 处将显色液进行比色测定;2 无土对照：不加土样,其他操作与样品实验相同;以检验试剂纯度,整个实验设置一个对照3无基质对照：以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同;每个土样都设此对照;。
微量生色底物法测定肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中抗Xa因子效价
微量生色底物法测定肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中抗Xa因子效价目的建立肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中抗Xa因子效价的测定方法。
方法对肝素钠肌醇烟酸酯乳膏进行破乳处理后，采用微量生色底物法、生物检定统计法，测定乳膏中抗Xa因子的效价。
结果建立了肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中肝素钠抗Xa因子的测定方法，抗Xa因子在0.0250～0.1020 IU/mL范围内与吸光度（A）值线性关系良好（r=0.996）；低、中、高浓度的平均回收率为99.5%，RSD为1.92%（n=9）。
抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效价比值在0.9～1.1范围内。
结论该方法结果准确，重复性好，可用于肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中抗Xa因子效价的测定，有效控制该制剂的质量。
[Abstract] Objective To establish a method for determination of anti-FXa potency in heparin sodium and inositol nicotinate cream. Methods The emulsion was broken. The anti-FXa potency was determined by micro-chromogenic substrate method and biological test statistics method. Results The determination method was established for anti-FXa potency in heparin sodium and inositol nicotinate cream. The linear range of anti-FXa was during 0.0250-0.1020 IU/mL （r=0.996）. The average recovery in three levels was 99.5% （RSD=1.92%，n=9）. The ratio of potency was during 0.9-1.1 for anti-FXa and anti-FⅡa. Conclusion The method is accurate and reproduceable. It can be used for the determination of anti-FXa potency in order to control the quality of heparin sodium and inositol nicotinate cream.[Key words] Micro-chromogenic substrate method；Heparin sodium and inositol nicotinate cream；Anti-FXa；Potency凍伤是指机体长时间暴露于寒冷环境，导致全身或局部体温下降而产生的损伤[1-2]。
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采用生色底物测定尿激酶效价的方法探讨
作者：谢京
来源：《科技资讯》2017年第12期
摘要：文章提供了一种采用生色底物测定尿激酶效价的方法，即使用L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐作为底物来进行分析。
采用此生色底物法测得结果与气泡法测定结果基本上是一致的。
经实验证明，生色底物法更易于操作，简捷快速，准确度及重现性也较好。
关键词：尿激酶效价测定底物
中图分类号：Q556.9 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）04（c）-0167-02
尿激酶由人体肾脏生成，是可以通过人体新鲜的尿液进行分离提纯进而得到的一种碱性蛋白水解酶。
而要测定尿激酶的效价方法有很多，如平板法、小球下落法、合成底物法以及《中华人民共和国药典》记载的气泡上升法等。
此文采用生色底物法测定尿激酶效价，使用L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐作为底物，是依靠尿激酶的酶活性来水解底物产生对硝基苯胺，并选择在405 nm波长处测定吸光度。
1 材料
1.1 仪器与试药
日本岛津UV-2550紫外分光光度计。
尿激酶标准品购自中国药品生物制品检定所；尿激酶供试品购自北京唯美生物技术公司；L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐购自积水化学工业株式会社；明胶为生物试剂；三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、冰醋酸、均为分析纯。
1.2 溶液制备
醋酸溶液配制需取20 mL冰醋酸用纯化水稀释成50 mL；
需用纯化水稀释L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐配制成浓度为0.6 mmol/L 的底物溶液。
缓冲液的配制需将三羟甲基氨基甲烷6.06 g和氯化纳2.22 g放在一起，大约加700 mL纯化水进行溶解；再单独取10 g明胶加适量的纯化水进行加热溶解。
将此溶液搁置直到凉了以后，再将这两种溶液混合在一起摇匀，取稀盐酸将溶液的pH值调至8.8，再往里加入纯化水稀释至1 000 mL。
2 确定测定条件的方法
2.1 反应时间的确定
当水浴温度为37 ℃时，取60 IU/ml的供试品溶液与底物溶液混合在一起进行反应5～40 min。
经过抽取不同时间的检测结果发现，在30 min以内的酶反应速度呈现出有规律的递增趋势，而在30 min过后的酶反应速度的递增趋势却没有之前那么明显，有所减弱。
故测定过程中酶反应的时间确定为30 min。
2.2 检测波长的确定
要确定检测波长，需取底物溶液分别与30 IU/mL、120 IU/mL 2种不同浓度的供试品溶液混合在一起发生反应，最后分别往里加入醋酸溶液摇匀，反应停止，选择在波长范围250～480 nm内进行测定其吸收光谱。
与此同时尿激酶水溶液、底物溶液以及缓冲液的吸收光谱也需要一一进行测定。
通过反复实验，在波长为405 nm处时缓冲液有少量吸收，而尿激酶水溶液和底物溶液都没有吸收，但是发生化学反应后所生成的产物却对硝基苯氨有吸收。
所以试验过程中选用测定吸光度的检测波长定为405 nm。
2.3 底物浓度的确定
37 ℃水浴中，采用配制好的pH8.8的缓冲液稀释尿激酶标准品成30 IU/mL的溶液，测定得到米氏常数Km=5.5×10-5mol/L。
用纯化水配制不同浓度的底物溶液。
从理论知识上我们知道了当底物浓度达到最大值的合理浓度时酶反应会激发它最大的活性，底物浓度为10 Km时反应速度在理论上计算出的约91%的极限值。
检测酶活性时底物浓度有轻微改变，但几乎不影响反应的速度，如有物质会抑制酶进行反应，在底物用量为10 Km时几乎不影响反应的速度，则说明在一定时间段内反应的速度恒定不变。
所以底物浓度标准设定为0.6 mmol/L。
2.4 缓冲液pH值的确定
缓冲液配制过程中，将两种溶液混合均匀后，用稀盐酸分别调制成若干pH值不同的溶液，然后再分别与尿激酶供试品混合配制成30 IU/mL的溶液，再与配制好的底物溶液混合发生反应。
随后采用分光光度法在波长405 nm处测定其吸光度。
反复试验后得出缓冲液的pH
值于8.5～9.0时测出的酶活性最高。
因此缓冲液的最佳pH采用8.8。
2.5 水浴温度的确定
众所周知，水浴温度对某些物质之间进行的化学反应是有一定影响的，而对尿激酶效价的检测方法却也是对水浴温度有一定要求。
用30 IU/mL供试品溶液与底物溶液混合，让其分别在不同温度的水浴中进行化学反应，结果却发现，不同温度下测得的结果却是有区别的。
经过反复试验测出37 ℃是个临界点，低于37 ℃测到的酶活性会随着水浴温度的升高呈上升趋势。
当水浴温度位于37 ℃～45 ℃之间时，所测到的酶活性是最高的。
而超过45 ℃之后呈下降趋
势，这说明过高温度会破坏酶的活性。
所以37 ℃可以作为检测尿激酶效价测定实验时的水浴温度选择。
3 测定方法及回收率试验
3.1 制备标准曲线
采用缓冲液将尿激酶标准品正确调配为50 IU/mL的尿激酶标准溶液。
取干净小试管6支并往每支试管内都加入2.0 mL的底物溶液，置于37 ℃水浴中。
接着将不同量的尿激酶标准液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别加入到6支试管内，再根据每个试管的溶液量多少分别加入缓冲液至1.0 mL。
经过30 min准确无误的反应过后，再分别往小试管里加入1.0 mL醋酸溶液摇匀，反应停止。
放至室温，在选定波长405 nm处测定其吸光度。
最后计算标准曲线方程，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得出：Y=0.0304+0.05355X，r=0.9984，n=3。
反复试验检测结果显示，在浓度范围10～50 IU/mL内尿激酶与吸收度持线性关系。
3.2 稳定性试验
待制备好标准曲线后将其溶液放于室温，分别在不同的时间一一测定其吸光度，最后结果显示24 h内吸光度并没有明显变化。
3.3 回收率试验
通过在相同的条件下进行的6次试验记录下的结果可以利用回归方程计算出浓度，所得平均回收率为101.4%，相对标准偏差为0.86%。
试验过程如下：取2.0 mL的底物溶液于干净小试管内后并将其置于37 ℃的水浴中。
同时取10 mL 30 IU/mL的尿激酶供试品溶液与10 mL 30 IU/mL的尿激酶标准溶液混合在一起摇匀。
接着往小试管内加入上述两者混合的尿激酶溶液1.0 mL。
经过30 min准确无误的反应过后往小试管内加入1.0 mL醋酸溶液摇匀，反应停止。
放至室温，并在选定的波长405 nm处测定其吸光度。
4 尿激酶供试品的效价测定
采用回收率试验中所使用的测定方法，取尿激酶供试品用缓冲液稀释至30 IU/mL的溶液进行测定，6次结果记录好，以便与用气泡上升法测试出来的结果进行对照。
配制试剂溶液和测定供试品效价的方法均按《药典》2010年版二部尿激酶效价测定法进行，采用此公式计算结果，尿激酶效价=（供试品单位数每毫升单位数×稀释倍数）/取样量。
采用两种方法进行测定后所得结果对照如表1。
然而在实际操作过程中如若不小心让微生物污染了底物溶液，则会引起底物水解从而使得实际的底物浓度要偏低，最后会对测定结果产生影响。
将调制好并已放了3 d的底物溶液与刚配好的新鲜底物溶液在完全相同的反应条件下分别进行反应。
通过检测显示搁置了3 d的底物溶液反应后在波长405 nm处被测到的吸光度与新鲜溶液比较已经有所下降了。
因此在配制溶液时所需的容器、溶剂都需要通过无菌消毒处理，如此便可以更好地延长底物溶液的贮存时间。
从表1的结果可以看出，生色底物法测定的尿激酶效价的结果与药典记载的气泡上升法测定出来的结果基本上是一致的。
5 结论
综上所述，文章归纳了酶反应最适合的基础条件是：37 ℃水浴温度，采用pH8.8的三羟甲基氨基甲烷-明胶缓冲液配制的尿激酶溶液与底物溶液浓度为0.6 mmol/L发生反应30 min。
最后再往里加入醋酸溶液摇匀，反应终止，通过分光光度计在波长405 nm处测定其吸光度。
记录后的结果表明尿激酶浓度在10～50 IU/mL范围内与吸光度之间呈线性关系。
药典记载的气泡上升法也可以测定尿激酶效价，但与生色底物法相比，气泡上升法在测定过程中存在着较多的问题。
因为气泡上升法在测定尿激酶效价时使用的试剂会相对偏多，而且都是一些蛋白质或者酶类物质，这些物质都很容易发生质变。
最后还是通过肉眼来决定反应的终点，如此就易产生由人为因素而引起的误差。
而文章讲述的生色底物法却是利用尿激酶与所选底物L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐进行反应从而产生淡黄色针状结晶物对硝基苯胺，再通过紫外可见分光光度计进行分光光度法测定其吸光度。
与气泡上升法相比较，生色底物法更易于操作，简捷快速，准确度及重现性也较好。
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