中山大学 鼻咽癌

鼻咽癌基础研究的新前沿——长链非编码RNA

夏世同　王跃建

【摘要】最新研究证明人类基因组中的非蛋白编码部分在致癌和肿瘤细胞转移中有重要作

用。在众多种类的非蛋白编码RNA 中，长链非编码RNA （long non-coding RNA ，lncRNA ）在癌症生物学中承担了关键的监管作用。本文对lncRNA 在人类肿瘤，特别是鼻咽癌中的研究现状做一综述。

【关键词】RNA （RNA ）；基因表达调控（Gene Expression Regulation ）；肿瘤标记，生物学（Tumor Markers ，Biological ）；鼻咽肿瘤（Nasopharyngeal Neoplasms ）

DOI ：10.3760/cma.j.issn.1673-4106.2015.01.008作者单位：528000 佛山市第一人民医院（中山大学附属佛山医院）耳鼻咽喉头颈外科

通信作者：王跃建，Email ：wyjian@https://www.360docs.net/doc/214619584.html,

·综述：头颈肿瘤·

鼻咽癌好发生于中国南部、东南亚及北非地区，是我国南方地区最常见的恶性肿瘤之一，总的5年生存率已经提高至70%左右。但首程放疗后的复发率仍较高，另外转移也是鼻咽癌治疗失败的主要原因之一，其病因和发病机制尚不清楚，由于其非特异性的早期症状而导致确诊时常处于晚期，目前已造成了严重的全球性健康问题。鼻咽癌的发生发展是多步骤、多因素、多基因参与的过程。因此，探索其动态发展的分子机制，寻找早期诊断及评估预后相关的特异性分子标志物，以进一步明确发病机制，对实现降低复发转移率有深远意义，在基因组中大量转录的长链非编码RNA （long non-coding RNA ，lncRNA ）因在致癌和抑癌途径中显露出的潜在作用成为继microRNA 之后的研究新热点。

【lncRNA 概述】非编码RNA 包括以miRNA 、siRNA 和piRNA 等为代表的短小RNA 和lncRNA 。lncRNA 是一类转录本长度超过200 nt 核苷酸单位的功能性RNA 分子。Okazaki 等[1]在对小鼠全长互补DNA （complementary DNA ，cDNA ）文库的大规模测序过程中首次发现了新的转录物，即lncRNA ，其本身并不编码蛋白，而是以RNA 的形式在多种层面上调控基因的表达水平。lncRNA 在基因组内广泛分布，位于编码mRNA 基因的内含子或外显子中或编码mRNA 基因之间的序列。lncRNA 序列一般具有低保守性，但在启动子区域和二级结构上具有进化保守性，这不同于

mRNA 必须保证密码子的正确性以防止开放阅读

框改变。起初lncRNA 被认为是基因组转录的“噪声”，并不具有任何生物学功能[2]。但最近的研究表明，lncRNA 参与了基因组印记及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程[3]。

1. 作用方式。lncRNA 调控基因表达的方式具多样性，调控机制也多种多样。lncRNA 对于基因表达调控的方式大体上可分为以下几种。

1.1 染色质重塑。染色质状态是转录活性的关键因素，包括核小体结构和组蛋白修饰等[4]。一些lncRNA 通过影响染色质状态来调控基因表达，如同源异型框基因反义基因间RNA （HOX antisense intergenic RNA ，HOTAIR ）转录自同源异型框基因C （Homeobox C ，HOXC ）位点，通过募集PRC2复合体，反式抑制HOXD 位转录。Tsai 等[5]研究显示HOTAIR 作为骨架分子发挥作用，其两端结合不同的组蛋白修饰复合体-5'端结合PRC2复合体，而3'端结合LSD1/CoREST/REST 复合体。前一复合体具有促甲基化作用，后一复合体具有脱甲基化作用，由他们分别决定不同靶基因的特异性组蛋白修饰模式。HOTAIR 的过表达将引起PRC2复合体在全基因组范围内的重新定位，使若干抑癌基因沉默，终促进癌细胞的转移。

1.2 转录调控。①基因沉默。INK4位点反义非编码RNA （antisense non-coding RNA in the INK4 locus ，ANRIL ）是周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B （Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B ，CDKN2B ，即p15 INK4b ）基因的反义转录物，参与抑癌基因周期蛋白依赖性激酶抑制

因子2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，C D K N2A），即p16I N K4a基因的沉默[6]。ANRIL结合并募集PRC1和PRC2复合体，导致染色质状态的改变，从而抑制p16 INK4a基因的表达。②DNA损伤活化。p21相关非编码 RNA （p21 associated ncRNA DNA damage activated，PA N D A）是已被证明参与细胞周期调控的lncRNA。DNA损伤发生时，p53结合周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A），即p21基因位点，然后激活PANDA的表达，而PANDA可通过结合核转录因子Yα亚基（nuclear transcription factor Y subunitα，NF-YA）而阻止凋亡相关基因的表达，从而延长细胞的生存时间[7]。③转录后调控。lncRNA在转录后水平可与mRNA形成RNA双链复合物，以掩盖mRNA的主要顺式作用元件从而调控基因表达（如lncRNA-Zeb2），即Sip1能够和HOX位点转录的mRNA的一个内含子的5'端剪切位点形成双链从而防止该内含子被剪切，该区域含有对于Zeb2蛋白表达所必须的核糖体结合位点Zeb2，通过这种方式能够提高Zeb2蛋白的表达量[8]。

2.3 mRNA前体剪接的调控。一种被称为肺腺癌转移相关转录物1（metastasis-associated in lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）的lncRNA已被发现在多种癌症中异常表达，它由其初级转录物的3'端加工而来，主要位于剪接斑点（splicing speckle）。它与丝氨酸/精氨酸（serine/arginine，SR）剪接因子相互作用，并调控剪接因子在剪接斑点中的分布和磷酸化水平，从而改变mRNA前体的选择性剪接模式[9]。此外，MALAT1还与剪接因子反式激活应答DNA 结合蛋白-43（transactive response DNA binding protein-43，TDP-43）相互作用，影响mRNA前体的选择性剪接[10]。

【lncRNA与有关肿瘤】

1. 呼吸系统肿瘤。Ji等[11]通过测序等方法发现了长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录本（long noncoding RNA-metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript，lncRNA-MALAT1）在70例发生转移的患者转移标本中过表达，且MALAT1的表达是病程和组织特异性的。在其他肿瘤中也随之发现MALAT1，但MALAT1在非小细胞肺癌患者中的过表达最为显著。随后Tripathi等[9]发现MALAT1可以通过调节SR蛋白的磷酸化来影响mRNA前体的剪切。2014年Michalik等[12]证明MALAT1具有调节内皮细胞功能和血管生长的功能。

2. 消化系统肿瘤。Wang等[13]证明肝癌细胞中miR-372通过与启动子结合蛋白CREB相互作用来达到上调lncRNA-HULC的表达。此外，李丹等[14]在HepG2肝癌细胞中还发现lncRNA-HULC对邻近基因SLC35B3的表达有影响，其通过siRNA干扰lncRNA-HULC表达，SLC35B3的表达也下降40%左右，而过表达HULC对SLC35B3的表达却没有很大的影响。Yang等[15]研究证明lncRNA-HEIH可能是一个独立的肝癌患者总生存期的预后因素，并且参与肿瘤的生长和耐药性，为肝癌的诊断和治疗提供了一种新的思路。古志强等[16]发现linc-UCC在结直肠癌组织中的高表达与肿瘤淋巴结转移有明显相关，linc-UCC高表达与临床病理特征中肿瘤淋巴结转移明显相关，提示其可能参与了调控结直肠癌转移的机制，另外低表达的linc-DCC与其相邻的miR143HG的表达水平呈显著正相关。而miR-143/145在以往研究被证实在结直肠癌组织中明显低表达。

3. 泌尿系统肿瘤。通过比较正常组织与前列腺癌组织基因表达谱，Bussemakers等[17]发现lncRNA-DD3（PCA3）基因在前列腺癌组织中高表达。Ochiai等[18]实验显示PCA3在预测诊断上优于PSA，而且通过尿液可取得，对于避免不必要的活组织检查具有指导意义。

4. 乳腺癌。通过对比人类乳腺肿瘤与正常乳房组织，Wan等[19]证实lncRNA-JADE在人类乳腺癌中高度表达，并证明lncRNA-JADE是在DNA损伤后转录激活的，参与细胞增殖调控机制，是连接DDR和组蛋白H4乙酰化作用的一个关键功能链接，lncRNA-JADE失调可能导致乳腺肿瘤发生。

5. 血液淋巴系统肿瘤。Tanaka等[20]在人类B 细胞淋巴瘤中发现了一种新的内含子snoRNA基因，命名为lncRNA-U50HG，位于染色体6q15。U50HG基因有6个外显子，但这些剪切转录子几乎不编码蛋白，其内含子拥有一个核苷尿甘异构化通道，该通道主要作用就是调控细胞生长，考虑该基因可能与肿瘤细胞生长有关。

综合文献发现，有些肿瘤中不仅有一种lncRNA过表达，如前列腺癌DD3和PCGEM1均被发现过表达；另外，许多lncRNA也不仅在一种肿瘤中表达，如lncRNA-MALAT1在肺癌、肠癌、神经母细胞瘤等肿瘤中都有表达。

【lncRNA与鼻咽癌】结合相关疾病的研究显示失调的lncRNA可通过多种途径在疾病的发生和发展中发挥重要作用。借鉴lncRNA在其他肿瘤中的研究方法，Ng等[21]采用基因芯片技术确定在未分化人类鼻咽癌细胞株CNE-2明确上调的基因是人类印迹基因lncRNA-H19，而H19在分化良好的人类鼻咽癌细胞株HK1上不表达。Northern 印迹和原位杂交分析证实了这一点。实验还证明了在分化良好的人HK1鼻咽癌细胞H19基因表达的反常是由H19启动子区CpG位点的甲基化引起。因此，基因的启动子区域的甲基化可能是在人类鼻咽癌细胞的分化和印迹基因的转录沉默作用的重要表观遗传事件。Liu等[22]研究了lncRNA -BLU基因在鼻咽癌原发肿瘤及细胞系遗传和表观遗传变化，在此基因的整个编码区域中45例原发鼻咽癌和5个鼻咽癌细胞株没有检测到致病突变。而lncRNA-BLU 100%表达于非癌鼻咽上皮细胞，其转录物在所有5个鼻咽癌细胞株被丢失。另外，在鼻咽癌细胞株中，lncRNA-BLU表达缺失与CpG岛的启动子序列甲基化相关，经甲基化特异性PCR分析显示，lncRNA-BLU表达下调的原发肿瘤中该启动子高度甲基化74%左右，而在BLU启动子区9个非肿瘤性鼻咽上皮细胞仅仅其中2个显示出甲基化。lncRNA-BLU改变后的高发病率表明，它可能是染色体3p21.3区的重要抑癌基因，参与了鼻咽癌的发生发展。Nie等[23]采用原位杂交测定出石蜡包埋的鼻咽癌活检组织中HOTAIR高表达。实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）显示新鲜组织和石蜡包埋样品的HOTAIR表达水平比非癌组织样品高5.2～48.4倍。此外，HOTAIR表达水平随临床分期的进展，这与在石蜡包埋组织的原位杂交结果一致。使用单因素和多因素分析总生存期，显示有较高的HOTAIR表达水平的鼻咽癌患者预后较差。该研究证明HOTAIR可能参与介导肿瘤细胞迁移、侵袭、增殖，是鼻咽癌预后的潜在生物标志物。谢林英等[24]通过qRT-PCR检测lncRNA-MALAT1基因在鼻咽癌癌细胞株5-8F、C666-1、CNE-1、CNE-2、HONE-1、6-10B及永生化鼻咽上皮细胞NP69株中的表达；采用RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术和RNA激活技术，构建MALAT1慢病毒干扰载体和激活载体并稳定转染鼻咽癌细胞株CNE-1，采用平板克隆、划痕等试验分析MALAT1基因对CNE-1细胞生物学行为的影响。结果证明MALAT1在高转移的鼻咽癌细胞株中高表达，在正常鼻咽上皮细胞低表达；并通过经激活过表达MALAT1后发现CNE-1细胞的上皮性标志物E-Cadherin的表达显著下调，间质细胞标志物Vimentin表达上调，侵袭转移能力明显增强（P<0.05）。从而提示MALAT1基因上调能够促进鼻咽癌CNE-1细胞的增殖、侵袭和转移能力。

通过鼻咽癌组织芯片来检测L I N C00312（NAG7）表达，Zhang等[25]研究发现LINC00312与非癌鼻咽上皮组织相比，鼻咽癌组织中表达显著下调。LINC00312的阳性表达与肿瘤大小呈负相关，但与淋巴结转移呈正相关。通过ROC 曲线分析、Logistic回归分析及生存分析结果表明，LINC00312可能是鼻咽癌转移、发展及预后的潜在生物标志物。结合Huang等[26]证实NAG7可以促进鼻咽癌细胞侵袭，并参与启动2个JNK2/ AP-1/MMP1和上游H-RAS/PC-Raf信号通道，可以看出LINC00312可能是参与鼻咽癌发生发展的重要调控因素之一。Gao等[27]用微阵列芯片（Microarray）筛选出差异化表达的lncRNA，并用qRT-PCR技术量化和验证在鼻咽癌中筛选出的待定lncRNA。其研究表明LNC-C22orf32-1、LNC-AL355149.1-1和LNC-ZNF674-1表达上调。表达高水平的LNC-C22orf32-1和LNC-AL355149.1-1与患者为男性显著相关联。此外，复发鼻咽癌显示出特别的lncRNA表达谱，即LNC-BCL2L11-3是在复发鼻咽癌组织显著上调，而LNC-AL355149.1-1和LNC-ZNF674-1的表达显著下调。这些结果表明与性别、肿瘤大小有关系的某些lncRNA可能是鼻咽癌发病机制的一部分。此外，在复发鼻咽癌特定的lncRNA表达谱可能会发现一个潜在独特的发展机制致使肿瘤复发。

【展望】综上所述，lncRNA已经成为癌症基

础研究的重要成员。已经初步证明lncRNA与鼻咽癌密切相关，但目前其相关机制研究接近空白，现有报道仅限于lncRNA异常表达与细胞增殖及周期的调控、细胞凋亡、侵袭转移的初步研究，对于其确切的作用分子机制尚无深入探索；另一方面有关lncRNA与鼻咽癌的研究较其他恶性肿瘤明显较少，鼻咽癌领域的lncRNA研究仅在起步阶段，亟待进一步拓展。总之，lncRNA研究的相对较新的领域正在迅速扩大，但仍有大量未知因素需要探索。我们可以预见使用lncRNA在临床肿瘤或其他领域潜在的价值，这可能代表一个意想不到的且未知的潜在生物标记物的“金矿”。待充分阐明鼻咽癌中lncRNA的不同基因调控机制，并开发新的和有效的方法来预测目标基因，将有助于为鼻咽癌临床早期诊断和预后判断提供一类新的标志物，为鼻咽癌的靶向治疗和新药开发提供依据。

参 考 文 献

[1] Okazaki Y，Furuno M，Kasukawa T，et al. Analysis of the

mouse transcriptome based on functional annotation of 60，770 full-length cDNAs[J]. Nature，2002，420（6915）：563-573.

[2] Kung JT，Colognori D，Lee JT. Long noncoding RNAs：past，

present，and future[J]. Genetics，2013，193（3）：651-669. [3] Wang KC，Chang HY. Molecular mechanisms of long noncoding

RNAs[J]. Mol Cell，2011，43（6）：904-914.

[4] Faust T，Frankel A，D'Orso I. Transcription control by long non-

coding RNAs[J]. Transcription，2012，3（2）：78-86.

[5] Tsai MC，Manor O，Wan Y，et al. Long noncoding RNA as

modular scaffold of histone modi?cation complexes[J]. Science，2010，329（5992）：689-693.

[6] Wapinski O，Chang HY. Long noncoding RNAs and human

disease[J]. Trends Cell Biol，2011，21（6）：354-361.

[7] Hung T，Wang Y，Lin MF，et al. Extensive and coordinated

transcription of noncoding RNAs within cell-cycle promoters[J].

Nat Genet，2011，43（7）：621-629.

[8] Beltran M，Puig I，Pe?a C，et al. A natural antisense transcript

regulates Zeb2/Sip1 gene expression during Snail1-induced epithelial-mesenchymal transition[J]. Genes Dev，2008，22（6）：756-769.

[9] Tripathi V，Ellis JD，Shen Z，et al. The nuclear-retained

noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation[J]. Mol Cell，2010，39（6）：925-938.

[10] Bhardwaj A，Myers MP，Buratti E，et al. Characterizing TDP-

43 interaction with its RNA targets[J]. Nucleic Acids Res，2013，

41（9）：5062-5074.

[11] Ji P，Diederichs S，Wang W，et al. MALAT-1，a novel

noncoding RNA，and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer[J]. Oncogene，2003，22（39）：8031-8041.[12] Michalik KM，You X，Manavski Y，et al. Long Noncoding

RNA MALAT1 regulates endothelial cell function and vessel growth[J]. Circ Res，2014，114（9）：1389-1397.

[13] Wang J，Liu X，Wu H，et al. CREB up-regulates long non-

coding RNA，HULC expression through interaction with microRNA-372 in liver cancer[J]. Nucleic Acids Res，2010，38（16）：5366-5383.

[14] 李丹，宋咏梅，詹启敏. HULC RNA在肝癌细胞中的表达及其

对邻近基因SLC35B3表达的影响[J]. 中华医学杂志，2010，90（44）：3156-3159.

[15] Yang F，Zhang L，Huo XS，et al. Long noncoding RNA high

expression in hepatocellular carcinoma facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2 in humans[J]. Hepatology，2011，54（5）：1679-1689.

[16] 古志强，唐健，黄凤婷，等. 结直肠癌中lincRNAs表达特征的

初步研究[J]. 肿瘤，2014，34（3）：245-252

[17] Bussemakers MJ，van Bokhoven A，Verhaegh GW，et al.

DD3：a new prostate-specific gene，highly overexpressed in prostate cancer[J]. Cancer Res，1999，59（23）：5975-5979. [18] Ochiai A，Okihara K，Kamoi K，et al. Clinical utility of the

prostate cancer gene 3（PCA3）urine assay in Japanese men undergoing prostate biopsy[J]. BJU Int，2013，111（6）：928-933.

[19] Wan G，Hu X，Liu Y，et al. A novel non-coding RNA

lncRNA-JADE connects DNA damage signalling to histone H4 acetylation[J]. EMBO J，2013，32（21）：2833-2847. [20] Tanaka R，Satoh H，Moriyama M，et al. Intronic U50 small-

nucleolar-RNA （snoRNA）host gene of no protein-coding potential is mapped at the chromosome breakpoint t（3；6）（q27；q15）of human B-cell lymphoma[J]. Genes Cells，2000，5（4）：277-287.

[21] Ng A，Tang JP，Goh CH，et al. Regulation of the H19

imprinting gene expression in human nasopharyngeal carcinoma by methylation[J]. Int J Cancer，2003，104（2）：179-187.

[22] Liu XQ，Chen HK，Zhang XS，et al. Alterations of BLU，

a candidate tumor suppressor gene on chromosome 3p21.3，in

human nasopharyngeal carcinoma[J]. Int J Cancer，2003，106（1）：60-65.

[23] Nie Y，Liu X，Qu S，et al. Long non-coding RNA HOTAIR is

an independent prognostic marker for nasopharyngeal carcinoma progression and survival[J]. Cancer Sci，2013，104（4）：458-464.

[24] 谢林英，胡志燕，王晓燕，等. 长非编码MALAT1 基因在人

鼻咽癌细胞株的表达及生物学意义[J]. 南方医科大学学报，2013，33（5）：692-697.

[25] Zhang W，Huang C，Gong Z，et al. Expression of LINC00312，

a long intergenic non-coding RNA，is negatively correlated with

tumor size but positively correlated with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma[J]. J Mol Histol，2013，44（5）：545-554.

[26] Huang C，Wu M，Tang Y，et al. NAG7 promotes human

nasopharyngeal carcinoma invasion through inhibition of estrogen receptor alpha and up-regulation of JNK2/AP-1/MMP1 pathways[J]. J Cell Physiol，2009，221（2）：394-401. [27] Gao W，Chan JY，Wong TS. Differential expression of long

noncoding RNA in primary and recurrent nasopharyngeal carcinoma[J]. Biomed Res Int，2014，2014：404567.

（收稿日期：2014-08-13）