Cytospin-Giemsa Staining-cell
改良支气管肺泡灌洗液细胞分类计数制片及染色法
改良支气管肺泡灌洗液细胞分类计数制片及染色法徐佳;黄媛;吴卫;董玉香;崔京涛;崔巍【摘要】目的改良支气管肺泡灌洗液细胞分类制片及染色方法,并对其临床实用性进行验证.方法随机抽取50例门诊及住院患者肺泡灌洗液标本,分别用改良的自动化瑞氏吉姆萨染色法及传统手工HE染色法染色,由两名具有专业技术能力的检验人员分别进行显微镜下细胞分类计数,评估两种制片方法检测结果的可比性.结果两种方法对肺泡灌洗液中吞噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数一致性较好,相关系数(r)均＞0.95.改良法染色的细胞形态完整,细胞核和细胞浆分辨清楚,可见颗粒、空泡等细微结构;而传统法染色后的细胞固缩明显,细胞体积变小,细胞核和细胞浆分辨清晰度下降,颗粒和空泡等细胞结构辨认不清.改良法比传统法省去了滤液离心富集细胞的过程(6 min),并且使用自动化瑞氏吉姆萨染色法(20 min)代替了手工HE染色法(30 min),每份标本至少节省了15～20 min的制片和染色时间.结论改良的自动化瑞氏吉姆萨染色法优于手工HE染色法,更适用于支气管肺泡灌洗液细胞分类计数,尤其是批量检测.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2014(032)002【总页数】4页(P98-101)【关键词】支气管肺泡灌洗液;细胞分类计数;瑞氏吉姆萨染色;HE染色【作者】徐佳;黄媛;吴卫;董玉香;崔京涛;崔巍【作者单位】北京协和医院检验科,北京100730;北京协和医院检验科,北京100730;北京协和医院检验科,北京100730;北京协和医院检验科,北京100730;北京协和医院检验科,北京100730;北京协和医院检验科,北京100730【正文语种】中文【中图分类】R446支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)技术是一种通过纤维支气管镜对支气管以下肺段或亚肺段以无菌生理盐水反复灌洗、回收、获取样本，并进行检查与分析的技术[1]。
巨噬细胞极化对心肌成纤维细胞活化的影响
天津医药2020年7月第48卷第7期巨噬细胞极化对心肌成纤维细胞活化的影响吴惠娟1，张盛昔1，杨潇2，胡因铭1，王乐旬1△，郭姣1摘要：目的观察巨噬细胞极化上清对心肌成纤维细胞活化的影响。
方法提取SD 大鼠的骨髓细胞和心肌成纤维细胞。
利用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF ）处理骨髓细胞后，加入刺激因子：M0（无刺激因子）、M1（100μg/L 脂多糖+10μg/L 干扰素-γ）、M2（20μg/L 白细胞介素-4）诱导巨噬细胞极化。
将极化后的不同型别巨噬细胞及其培养上清分别与心肌成纤维细胞共培养，分别设空白对照组、M0组、M1组和M2组，通过细胞免疫荧光检测心肌成纤维细胞中纤维化蛋白的表达水平；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测巨噬细胞和成纤维细胞特征分子的表达；Western blot 检测纤维化相关蛋白及转化生长因子β受体（TGFβR ）、血小板衍生生长因子受体（PDGFRs ）信号通路活化情况。
结果经M-CSF 及相应刺激因子诱导，成功获得M1和M2型巨噬细胞。
细胞共培养结果显示，与M0组相比，M1组上清培养的心肌成纤维细胞中胶原蛋白1（Col1a1）和Col3a1的mRNA 水平以及平滑肌肌动蛋白（α-SMA ）表达水平显著降低（P ＜0.05），而M2组上清培养的心肌成纤维细胞中Col1a1和Col3a1的mRNA 水平以及α-SMA 、结缔组织生长因子（CCN2）表达水平显著升高（P ＜0.05）。
M1组上清培养的心肌成纤维细胞中PDGFRβ蛋白磷酸化水平显著低于M0组（P ＜0.01），而M2组上清培养的心肌成纤维细胞中PDGFRβ蛋白磷酸化水平显著高于M0组（P ＜0.05）。
结论M1型巨噬细胞上清能够抑制心肌成纤维细胞活化，而M2型巨噬细胞上清能够激活心肌成纤维细胞。
M1型巨噬细胞抑制纤维化的作用可能与抑制PDGFRβ通路的活化有关。
关键词：纤维化；心脏；成纤维细胞；巨噬细胞；受体，血小板源生长因子β中图分类号：R392.12文献标志码：ADOI ：10.11958/20200169Effects of macrophage polarization on the activation of cardiac fibroblastWU Hui-juan 1,ZHANG Sheng-xi 1,YANG Xiao 2,HU Yin-ming 1,WANG Le-xun 1△,GUO Jiao 11Guangdong Metabolic Disease Research Center of Integrated Chinese and Western Medicine,Guangdong Key Laboratory of Metabolic Disease Prevention and Treatment of Traditional Chinese Medicine,Joint Laboratory of Guangdong,Hong Kong and Macao on Glycolipid Metabolic Diseases,Institute of Chinese Medicine Sciences,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2Department of Clinical Laboratory,Guangzhou First People's Hospital△Corresponding Author E-mail:*********************Abstract:ObjectiveTo observe the effects of macrophage polarization supernatant on the activation of cardiacfibroblasts.MethodsBone marrow cells and cardiac fibroblasts of SD rats were extracted.Bone marrow cells were inducedto M1and M2by treating with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF),and cells were divided into M0group (no stimulating factor),M1group (100μg/L LPS+10μg/L INF-γ)and M2group (20μg/L IL-4).Different macrophages were co-cultured with cardiac fibroblasts,and different macrophage supernatants were collected to culture with cardiac fibroblasts.Immunofluorescence was performed to examine the fibrotic protein expression in cardiac fibroblasts.The mRNA levels of macrophage-specific molecules,fibrosis-related genes and signaling pathways were tested by real-time PCR.The fibrosis-related proteins and the activation of TGFβR and PDGFRs signal pathways were detected by Western blot assay.Results After treatment with M-CSF and stimulating factors,M1macrophages and M2macrophages were pared with the M0group,the mRNA levels of Col1a1and Col3a1and the protein level of α-SMA were significantly decreased in the cardiac fibroblasts treated by the supernatant of M1macrophage group (P ＜0.05),while the mRNA levels of Col1a1and基金项目：广东省自然科学基金博士启动纵向协同项目（2018A030310403）；广东省自然科学基金（2018A0303130168）；广东省医学科学技术研究基金（A2018068）；广东省基础与应用基础研究基金项目（2020A1515010155）作者单位：1广东省代谢病中西医结合研究中心，广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室，粤港澳联合代谢病重点实验室，广东药科大学中医药研究院（邮编510006）；2广州市第一人民医院检验科作者简介：吴惠娟（1995），女，硕士在读，主要从事中医药防治糖脂代谢病方面研究△通信作者E-mail ：*********************细胞与分子生物学611Tianjin Med J,July2020,Vol.48No.7《中国心血管病报告2018》显示我国心血管病现患人数约为2.9亿，其中90%以上与心脏有关［1］。
肿瘤动物模型的构建——白血病篇知识讲解
肿瘤动物模型的构建——白血病篇肿瘤动物模型的构建——白血病篇导读白血病（Leukemia）是一种常见的恶性血液疾病，俗称血癌。
据统计，白血病是儿童恶性肿瘤的头号原因，在儿童及35岁以下成人中发病率位居第一[1]。
同时也是十大恶性肿瘤之一。
目前，白血病具体的发病原因至今尚未研究透彻，因此建立合适的白血病动物模型，对于白血病发病机制及药物研发具有重要意义。
本期为大家综述了白血病的基本情况及小鼠模型的分类、建立方法和应用。
第一章：白血病基本常识白血病是常见液体瘤白血病是常见的液体瘤，与结肠癌、肝癌等实体瘤不同的是，它是造血干细胞的异常分化和过度增殖导致，因此肿瘤细胞会遍布全身，会侵犯身体的每个脏器，造成全身衰竭。
造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新和分化成各类成熟血细胞的能力。
如下图为造血干细胞可分类形成各种血细胞，如红细胞、血小板和白细胞：造血干细胞分化成各类血细胞（图片来自网站）白血病致病因素有哪些呢？现阶段认为白血病的发病因素：化学因素、电离辐射、药物、毒物、病毒、遗传因素等有关。
白血病主要分为四类根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类，临床上，白血病共分为四大类：急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）。
儿童白血病90%以上是急性的，其中急性白血病中70%～80%是ALL。
第二章：实验研究所用白血病模型首先，来了解一下常用的细胞株白血病中常用的小鼠品系用于建立白血病小鼠模型的小鼠可分为近交系和突变系。
根据不同类型和目的选择不同的小鼠品系，具体如下图所示：最后说说常用的动物模型，主要分为三类：一、异种移植模型异种移植模型是最常用的淋巴瘤动物模型。
根据实验目的选择相应的小鼠品系和细胞株后，通常细胞的接种方式为皮下注射、腹腔注射和尾静脉注射。
皮下注射和腹腔注射操作简单，很快在接种部位形成肿瘤或腹腔内形成多发性肿瘤，适合筛选针对白血病的药物。
脂多糖刺激巨噬细胞分泌含miR-155-5p_的外泌体促进肝星状细胞的活化及迁移
肝纤维化是肝炎-肝硬化-肝癌三部曲的重要病理表型，研究表明抑制肝纤维化能有效减缓肝炎向肝癌的进程［1］。
但目前临床上针对肝纤维化没有行之有效的治疗方案［2］。
因而，深入探索纤维化机制为寻找延缓乃至逆转纤维化的治疗靶点和节约医疗资源具有十分重要意义。
肝巨噬细胞在肝纤维化中发挥至关重要的作用，其主要功能与炎症、肝细胞损伤、肝星状细胞的活化和纤维化密切相关［3］。
肝星状细胞在肝脏生理和纤维生成起到关键作用，其能够受到肝巨噬细胞的调控［4］。
近来Lipopolysaccharide stimulates macrophages to secrete exosomes containing miR-155-5p to promote activation and migration of hepatic stellate cellsLIN Jiayi 1,LOU Anni 1,LI Xu 1,21Department of Emergency Medicine,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2Key Laboratory of First Aid and Trauma Research,Ministry of Education,Hainan Medical College,Haikou 571199,China摘要：目的探索脂多糖（LPS ）刺激下的巨噬细胞来源的外泌体对肝星状细胞的激活及迁移能力的影响及分子机制。
方法以100ng/mL 丙二醇甲醚醋酸（PMA ）处理人THP-1巨噬细胞24h ，诱导其分化为巨噬细胞，给予脂多糖刺激后收集巨噬细胞的培养上清，运用超速离心法提取外泌体并加以鉴定。
荧光定量PCR （qRT-PCR ）检测外泌体中miR-155-5p 的表达。
采用Transwell 共培养体系观察巨噬细胞分泌的外泌体对肝星状细胞LX2增殖、氧化应激、迁移和I 型胶原等纤维化标志物表达的影响。
肿瘤坏死因子偏高的原因
肿瘤坏死因子偏高的原因引言肿瘤坏死因子（TNF）是一种重要的细胞因子，它在炎症、免疫和肿瘤发生中起着重要作用。
然而，当肿瘤坏死因子的水平异常增高时，可能会引发一系列健康问题。
本文将探讨肿瘤坏死因子偏高的原因，并对其影响进行全面、详细、完整且深入地分析。
肿瘤坏死因子的作用肿瘤坏死因子是一种由多种细胞产生的细胞因子，包括巨噬细胞、T细胞和B细胞等。
它在炎症反应、免疫应答和肿瘤发生中发挥重要作用。
肿瘤坏死因子主要有两种形式：TNF-α和TNF-β。
它们通过结合细胞表面的受体，如TNFR1和TNFR2，来发挥作用。
TNF-α主要由巨噬细胞和T细胞产生，而TNF-β则主要由淋巴细胞产生。
肿瘤坏死因子在炎症反应中起着重要作用。
它能够引起血管内皮细胞的活化，导致炎症细胞的浸润。
此外，肿瘤坏死因子还能够诱导一系列炎症相关的细胞因子的产生，如白细胞介素1（IL-1）和白细胞介素6（IL-6），从而加剧炎症反应。
肿瘤坏死因子在免疫应答中也起着重要作用。
它能够促进巨噬细胞和其他免疫细胞的活化，增强它们对病原体的杀伤作用。
此外，肿瘤坏死因子还能够促进T细胞和B细胞的增殖和分化，从而增强免疫应答。
肿瘤坏死因子在肿瘤发生中也发挥重要作用。
它能够直接杀伤肿瘤细胞，并通过诱导细胞凋亡的方式抑制肿瘤生长。
此外，肿瘤坏死因子还能够诱导血管生成，从而促进肿瘤的生长和转移。
肿瘤坏死因子偏高的原因肿瘤坏死因子的水平异常增高可能是由多种原因引起的。
下面将对其中几个常见的原因进行详细探讨。
1. 炎症反应炎症反应是肿瘤坏死因子水平增高的常见原因之一。
当机体受到感染或损伤时，免疫系统会释放大量的肿瘤坏死因子来应对炎症刺激。
这种情况下，肿瘤坏死因子的产生增加，从而导致其水平升高。
2. 自身免疫性疾病自身免疫性疾病是指机体的免疫系统错误地攻击自身组织和器官。
在自身免疫性疾病中，免疫系统会释放过多的肿瘤坏死因子，导致其水平升高。
例如，类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病都与肿瘤坏死因子的水平升高相关。
前列腺不典型小腺泡增生
ASAP与前列腺微小癌 (m inimal volume p rostatic adeno2 carcinoma,癌占活检组织总量的 5%以下 )之间的鉴别标准 中 ,腺泡数目和病灶大小是最主要的一条 , ASAP腺泡的数目 是癌腺泡数目的 2 /3 (11、17) , ASAP病灶比癌性病灶小一半 (014 mm、018 mm ) 。核增大 、明显的核仁 、核分裂象 、腔内蓝 色黏液及并存 P IN等形态特征在前列腺微小癌中更明显 ,但 核深染及中 ～重度萎缩在 ASAP 比癌中更为常见 (分别为 44%、9%和 59%、35% ) 。 100%前列腺微小癌呈浸润性生 长 ,但浸润性的生长方式也存在于 75%的 ASAP病例中 。嗜 酸性颗粒性分泌物与类晶体在两者无明显差异 [12 ] 。
前列腺癌占男性恶性肿瘤的第 2位 ,在发达国家 ,前列 腺癌占全部恶性肿瘤的 19% ,在发展中国家为 513% [1 ] 。前 列腺穿刺活检是发现和确诊前列腺癌的重要手段 ,但穿刺标 本中经常会遇到少量不典型腺泡 ,疑似癌却又不能确定为 癌 ,这便是前列腺不典型小腺泡增生 ( atyp ical small acinar p roliferation, ASAP) 。现将 ASAP形态特征 、诊断标准 、发病 率 、临床意义以及对发现前列腺癌的预测价值等作一综述 。
1 A SA P的病理特征及应用现状
ASAP也称不典型腺体 ( atyp ia / atyp ical glands) [2 ] ,是由 Bostw ick等 [3 ]于 1993年首次提出的一个描述不典型腺样前 列腺增生的诊断术语 。4 年后这一诊断的临床意义得到首 次阐述 [4 ] 。
ASAP为不典型腺泡病变 ,表现为排列紧密的灶性增生 的小腺泡集落 。这些小腺泡被覆一层几近透明的分泌细胞 上皮 ,而基底细胞呈断片状或消失 (可经 34βE12 免疫组化 证实 ) 。组织特点为 : ①有限数量的腺体 ; ② 极少腺体出现 细胞不典型性 ,包括核增大 、核仁增大 ; ③ 组织异型 :缺乏核 异型的小腺泡杂乱无章地排列 ; ④ 腔内可见蓝色黏液 、结晶 体或粉红色蛋白样分泌物 [5 ] 。这些腺泡的结构形态和 /或细 胞形态类似于分化较好的前列腺癌 ,但数量太少 ,只是怀疑 为癌但不能明确诊断 。不足以诊断为癌而做出 ASAP这一 诊断主要见于两种情况 [6 ] : ①质的方面 ,缺乏足够的前列腺 癌细胞和组织结构特点 。例如一个病灶可能包括 12 个腺 泡 ,腺泡缺乏基底细胞层 ,呈浸润性生长 ,但细胞形态和组织 结构上尚未达到癌的诊断标准 (如缺少明显的核仁和明显 的核增大 ) ; ②量的方面 ,包含的腺泡数量太少 ,腺泡的细胞 和组织结构方面已经达到癌的诊断标准 ,但病灶的大小是其 主要限制 (如 1～3个腺泡 ) 。
银杏达莫注射液联合骨髓间充质干细胞移植改善脑梗死后的神经功能
银杏达莫注射液联合骨髓间充质干细胞移植改善脑梗死后的神经功能杨朝阳【摘要】背景：通过细胞移植重建损伤脑组织成为治疗脑梗死的新途径，骨髓间充质干细胞成为近年来细胞移植治疗领域的研究热点。
<br> 目的：探讨银杏达莫注射液联合骨髓间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能的改善作用及相关机制。
<br> 方法：利用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型，建模成功后60只SD大鼠随机分为对照组、细胞移植组及联合组。
对照组尾静脉注射PBS、细胞移植组尾静脉注射2.5×109 L-1的骨髓间充质干细胞悬液、联合组尾静脉注射2.5×109 L-1的骨髓间充质干细胞悬液和银杏达莫2 mL/kg，1次/d，连续注射5 d。
于移植后的1，3 d及1，2周进行mNSS行为学评分，以观察大鼠神经功能缺损状况。
移植后2周RT-PCR检测脑组织中脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43基因表达变化，TUNEL法检测细胞凋亡情况，免疫组化法检测BrdU阳性细胞数。
<br> 结果与结论：移植后的1，3 d各组大鼠神经功能缺损评分差异无显著性意义(P >0.05)，在移植后1，2周，联合组神经功能缺损评分低于细胞移植组及对照组(P <0.05)；移植后2周，联合组脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43 mRNA表达明显高于细胞移植组及对照组(P<0.05)，联合组凋亡细胞数目明显少于细胞移植组及对照组(P <0.05)，联合组BrdU阳性细胞数量明显多于细胞移植组及对照组(P <0.05)。
结果表明骨髓间充质干细胞联合银杏达莫干预能促进脑梗死组织脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43 mRNA的表达，抑制细胞凋亡，改善大鼠神经功能。
%BACKGROUND:Reconstruction of damaged brain tissue through cel transplantation has become a new way to treat cerebral infarction. In recent years, bone marrow mesenchymal stem celshave become the new darling in cel transplantation therapy. <br> OBJECTIVE:To investigate the effect of ginkgo-damole injection combined with bone marrow mesenchymal stem cel transplantation to improve the neurological function of acute cerebral infarction rats and its mechanism. <br> METHODS:Animal models of middle cerebral artery occlusion were made in rats using suture method, and then 60 rat models were randomly divided into control group, cel transplantation group and combination group. The control group was given intravenous injection of PBSvia the tail vein; the cel transplantation group was given intravenous injection of bone marrow mesenchymal stem cel suspension (2.5×109/L) via the tail vein; the combination group was given intravenous injection of bone marrow mesenchymal stem cel suspension (2.5×109 /L) and ginkgo-damole injection (2 mL/kg, once a day, totaly 5 days)via the tail vein. Modified neurological severity scores were recorded at 1, 3 days and 1, 2 weeks after transplantation. At 2 weeks after transplantation, expressions of brain-derived neurotrophic factor and growth associated protein 43 in the brain were detected using RT-PCR; cel apoptosis detected using MTT assay; BrdU positive cels counted using <br> immunohistochemistry method.<br> RESULTS AND CONCLUSION:There were no differences in the modified neurologic severity scores among the three groups at 1, 3 days after transplantation (P > 0.05), but the modified neurological severity scores in the combination group were lower than those in the cel transplantation group and control group at 1, 2 weeks after transplantation (P < 0.05). The expressions of brain-derived neurotrophicfactor and growth associated protein 43 in the brain were significantly higher in the combination group than the other two groups at 2 weeks after transplantation (P < 0.05); compared with the other two groups, the number of apoptotic cels was less but the number of BrdU positive cels was higher in the combination group (P < 0.05). These findings indicate that the combination of ginkgo-damole injection and bone marrow mesenchymal stem cel transplantation can increase the expressions of brain-derived neurotrophic factor and growth associated protein 43 in the brain, inhibit cel apoptosis and improve neurological function in rats with cerebral infarction.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)050【总页数】6页(P8108-8113)【关键词】干细胞;移植;银杏达莫注射液;骨髓间充质干细胞;干细胞移植;脑源性神经生长因子;GAP-43;脑梗死【作者】杨朝阳【作者单位】济源市人民医院普内科，河南省济源市 454000【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章亮点：1“干细胞循环”理论与中医理论中的“活血化瘀”法与有相通之处，银杏达莫注射液是从中药银杏叶中提取的复方制剂，能清除自由基、改善血液循环。
线粒体内参抗体：推荐Abbkine
线粒体内参抗体：推荐Abbkine COX IV抗体细胞⾊素c氧化酶(Cytochrome c oxidase，简称COX)是⼀种异源寡聚酶，通常含有13个亚基，定位于线粒体内膜，是线粒体呼吸链的酶复合物。
细胞⾊素c氧化酶中形成催化中⼼的3个最⼤的亚基由线粒体DNA编码，其余10个亚基包括COX IV由细胞核内的基因组DNA编码。
细胞⾊素c氧化酶(COX)活性缺陷和⼈类多种疾病相关。
COX IV抗体可⽤作线粒体蛋⽩上样量的内参抗体，其检测⽬标蛋⽩⼤⼩为16kD左右。
什么时候选择线粒体内参抗体？我们知道，在Western Blotting中使⽤内参其实就是在WB过程中的另外⽤内参对应的抗体检测内参蛋⽩，这样在检测⽬的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以⽤于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。
此外使⽤内参可以作为空⽩对照，检测蛋⽩转膜情况是否完全、整个Western Blot显⾊或者发光体系是否正常。
常⽤的细胞总蛋⽩质内参有GAPDH和细胞⾻架蛋⽩β-Actin或β-Tubulin等。
对于⼀些植物的样本，则需要特别的植物Actin蛋⽩作为内参。
当实验样品中只是核蛋⽩，⽽不是细胞总蛋⽩提取液时，可以⽤组蛋⽩H（Histone H），或者增殖细胞核抗原（PCNA）等为核内参抗体。
⽽在⼀些特别的针对线粒体作为微环境的研究课题时，需要提取线粒体总蛋⽩并检测其中的⽬标蛋⽩含量，这时候常规的细胞总蛋⽩内参就不是很合适，我们推荐使⽤线粒体总蛋⽩的内参抗体，对于线粒体蛋⽩的检测，常⽤COX IV或VDAC1作为内参抗体，这⾥⾯COX IV⼜是被引⽤最多的线粒体内参。
COX IV的检测分⼦量⼤约在16kD左右，⽐较适合⽤于检测⽬标蛋⽩在较⼤的WB实验。
我们课题组是做凋亡和线粒体⽅⾯研究的，经常研究线粒体⽅⾯的通道蛋⽩，⼀直使⽤Abbkine的COX IV抗体来做WB，效价挺⾼的。
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Cytospin
∙Extract 100ul of blood cells in Tricane buffer (0.02% Tricane/PBS with 0.1% BSA) from approx. 10 fish by clipping off at the tails.
∙Before blood cell cytospin, load 100ul of Tricane buffer into cytofunnel to normalize.
∙Load sample. Spin at 400rpm, 3min (Shandon Cytospin 4).
Giemsa staining
∙Add 1ml May-grunwald stain solution (May-grunwald solution:methanol = 1:3) gently to cover cytospin area. Leave for 5min.
∙Run off solution completely.
∙Apply 1ml Giemasa stain solution (freshly prepared; Giemsa solution:Phosphate buffer = 1:20) onto cytospin area. Shake gently for 15-30min. normal 20 min
∙Run off solution with slow running water.
∙Leave slide to air-dry.
Phosphate buffer
KH2PO4 6.63g
Na2HPO4 2.56g
Make to 1000ml, adjust to pH 6.4. Filter before use.
May-Grunwald’s eosin methylene blue solution , BDH 352064V
Microscopy Gismsa Staining Solution , Merck 1.09204.0500
Immunohistochemistry (Cryostaining)
∙Fix cytospin slides in 4% PFA/PBS (freshly prepared), 30min.
∙Wash slide by rinsing 3 X 10min in 0.1% Triton/PBS.
∙Optional: -20 acetone treat sample at room temperature for 2 min
∙Rinse with water for several times.
∙Block with 4% BSA/PBS or 10% Lamb serum/PBS (freshly prepared), 30min.
∙Wash 3 X 10min in 0.1% Triton/PBS.
∙Incubate in primary Ab/Blocking buffer, 1hr, RT or o/n, 4C.
∙Wash 3 X 10min in 0.1% Triton/PBS.
∙Incubate in secondary Ab/Blocking buffer, 1hr, RT or o/n, 4C (1:400)
∙Wash 3 X 10min in 0.1% Triton/PBS.
∙Leave slide to air-dry.
∙Mount with DAPI.。