使用对pH敏感的聚(乙二醇)-聚-L-组氨酸的水凝胶控制二型重组腺相关病毒的释放

Biomaterials 33 (2012) 9239e9245内容可在SciVerse ScienceDirect列表中查询Biomaterials期刊首页: w ww.elsevi /locate/biomaterial s使用对pH敏感的聚（乙二醇）-聚-L-组氨酸的水凝胶控制二型重组腺相关病毒的释放Yi-Fang Zeng a,1, S.-Ja Tseng b,1, Ivan M. Kempson b, Shu-Fen Peng c, d, e, Wen-Teng Wu f, Je-Ruei Liu a, g, h, *a Institute of Biotechnology, National Taiwan University, Taipei 106, Taiwanb Institute of Physics, Academia Sinica, Taipei 115, Taiwanc Department of Biological Science and Technology, China Medical University, Taichung 404, Taiwand Department of Medical Research, Children’s Hospital, China Medical University Hospital, Taichung 404, Taiwane Department of Pediatrics, Children’s Hospital, China Medical University Hospital, Taichung 404, Taiwanf Department of Chemical Engineering, National Cheng Kung University, Tainan 701, Taiwang Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University, Taipei 106, Taiwanh Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica, Taipei 115, Taiwan文章信息文章信息:2012年8月28日揽收2012年9月11日通过2012年9月29日上线关键字:聚（乙二醇）-聚-L-组氨酸二型重组腺局部基因传递pH值敏感伤口处理文章简介以合成聚合物为载体装载病毒的方法，在病毒基因传递相关领域是一个很有前景的方向。

在特定的场合中通过水凝胶来传递基因表达是一种多用途的方式。

在这项研究中，将含有绿色荧光蛋白基因（rAAV2-GFP）的腺相关病毒血清2型装入聚（乙二醇）（PEG）水凝胶，通过掺入或者不掺入聚-L-组氨酸肽来进行论证。

生理范围中由聚组氨酸肽组成pH敏感的水凝胶，包含损坏的血管结构系统、细胞吞噬系统。

聚组氨酸肽用于控制膨胀、吸水率和后续发生的水凝胶降解程度以及rAAV2-GFP的释放速率。

所述PEG-组氨酸肽水凝胶的溶胀率与环境pH值的增加呈反比。

随着pH值从7.4下降到6.0，PEG-组氨酸肽水凝胶溶胀率和降解率分别提高875％和135％。

结果显示，在人体HT-1080纤维肉瘤细胞中的PEG-组氨酸肽释放的rAVV2-GFP的释放和传递效率与PEG水凝胶相比显著提升。

传递速度可以通过水凝胶的组氨酸肽浓度进行控制，并且在局部发生炎症的范围里降低了对pH值的敏感度。

这涉及到目前最先进的伤口护理与再生医学的应用。

© 2012 Elsevier Ltd. 保留所有权利.1. 前言非病毒载体由于免疫原性较低在基因传递领域中广泛应用，它的能力可适应和提供大尺寸遗传物质，并且存在有关生物相互作用的表面物理评估和化学性质改性的潜力[1e4]。

然而，非病毒的基因表达载体的相对低的效率，相较于病毒载体，降低了基因传递的效率。

但重组腺相关病毒（腺相关病毒）作为备选选择是用于递送遗传分子有力的转基因载体。

腺相关病毒的优点包括相对容易地产生高滴度、高效率转染分裂和非分裂细胞的能力、大基因组传递的稳定性，低水平的病毒基因组整合度以及广泛的病毒生物学特性的能力[5]。

* 作者通讯地址： Institute of Biotechnology, National Taiwan University,4F,No. 81, Chang-Xing St., Taipei 106, Taiwan. Tel.: +886 2 3366 6011; fax: +886 23366 6001.电子邮编: jrliu@.tw (J.-R. Liu).1 文章第一、二作者 (Y.F. Zeng and S.J. Tseng) 对本文有相同贡献.在人类临床试验中，腺相关病毒携带特定基因材料进行基因治疗已显示出可喜的成果[6,7]。

然而，非特异性和更有疗效的基因表达内容不足仍是亟待解决的问题。

传递的基因远离的目标位置可能会导致一种或者多种不良结果：如损失效率、基因表达异位或会有很高的风险引发严重的免疫反应。

最近一些研究已经表明，随着生物材料基质与病毒载体的结合，通过支架结构固定或封装到一个基质的表面可以提高基因表达。

[8e11]。

报告证实使用复合再生医学工程与病毒基因治疗技术结合，在治疗皮肤创伤及骨移植是有前景的方向。

[12e14].此外，病毒载体与生物材料层层叠加可以达到调节病毒嗜性或降低炎症和免疫反应的目的[15e17]。

0142-9612/$ e see front matter © 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved./10.1016/j.biomaterials.2012.09.0189240Y.-F. Zeng et al. / Biomaterials 33 (2012) 9239e9245聚合物涂层的载体的表面可以通过循环动力学提高在血浆中的流动程度，接触被动的或官能化的体内目标。

然而，聚合物涂覆的载体的一个主要相关的作用是非特异性结合并通过内吞作用进入非靶细胞，特别是可以通过表面正电荷进行促进这种效应的发生。

因此，生物相容基质为可控制的、长期的、并且可以局部传递。

一种方法是在一个特定的环境下触动释放病毒的机制。

利用伤口部位的生理特性，用于受控药物递送的pH依赖型输送系统已经在多个例证中出现[4,18e22]。

聚（乙二醇）（PEG）基水凝胶已经表明已被广泛用于组织再生医学及在多个例证中的药物递送[23e27]。

PEG在很大程度上是由亲水部分是无免疫原性及抗蛋白质吸附的部分组成[27,28]。

因此，PEG水凝胶经常被认为是可以模仿非生物污损特性和天然的细胞外基质的功能而存在。

PEG水凝胶的稳定性和降解速率可以通过调节其固含量来控制;并且还可以优化控制药物和基因的传递特性[23e27]。

由于在微酸性的生理pH值范围内构成正电荷的属性，对于药物或基因递送的目的，组氨酸被频繁作为传递工具。

[18,19,21]。

另外，通过组氨酸的胺基团的质子化可调节基质的表面Zeta电位，促进水的吸收[18,19,21]。

因此，在本研究中，我们力图通过将各种浓度的多聚组氨酸的插入PEG水凝胶中来合成对pH敏感的水凝胶。

组氨酸的咪唑环的氨基的离子化是由pH值所控制的，其pKa 值定义为 6.10，被称为生物性酸中毒。

为在吞噬损坏的血管的过程中释放了酶，受伤/受损组织的生理环境被证明更加酸性（pH值5.5）或更低[29]。

当这些组织生长或自我修复完成后，损伤部位的pH值将会恢复到正常的生理范围。

在本所述中，我们促进特定蛋白质的高效表达的方法是通过病毒介导的酸性范围内的遗传操作。

我们利用包括基于PEG的水凝胶pH敏感部分来传授对pH值的响应，这样我们将达到预期的对局部的pH引发病毒释放有益的物理化学机制。

在方案1中将会展示出合成了参入多组氨酸（聚氨酸）的PEG水凝胶，它是可生物降解且对pH敏感的一种水凝胶。

我们还在中性和弱酸性的环境条件下，对红肿生理环境状态的水凝胶的稳定性/降解进行了测定。

此外，还将含有绿色荧光蛋白基因（AAV2-GFP）的rAAV2作为对照组装入所述PEG聚组氨酸水凝胶。

根据在不同pH条件下HT-1080细胞释放的rAAV2-GFP的传递效率确认来环境介导的释放。

方案1的pH敏感水凝胶的实验方法示意如图：rAAV2-GFP被嵌入到PEG或PEG聚组氨酸水凝胶和在中性（pH值为7.4）或酸性（pH6.0）的环境下培养。

在酸性条件下，多聚组氨酸的胺基是大部分质子化的，从而导致由PEG聚组氨酸水凝胶增强了对水分的吸收。

Y.-F. Zeng et al. / Biomaterials 33 (2012) 9239e924592412.材料和方法2.1.化学试剂①聚乙二醇二丙烯酸酯（Mn ¼ 700g/mol）②氘代二甲基亚砜（DMSO-D 6）③2-羟基-40-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮④聚-L-组氨酸盐酸盐（聚氨酸，分子量Mw¼5000 Da）⑤聚-L-赖氨酸溶液（聚赖氨酸，分子量70,000e 150,000 Da）和磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）分别从SigmaeAldrich有限公司（圣路易斯，密苏里州）购得。

②rAAV2-GFP病毒（浓度：1×1012的基因组副本（GC）/毫升），从细胞生物实验室（加利福尼亚州圣迭戈）购买。

CellTiter96®水性单溶液细胞增殖测定试剂盒3-（4,5 - 二甲基吡啶-2 - 基）-5-（3 - 羧基甲氧基苯基）-2 - （4 - 磺苯基）-2H-四唑鎓（MTS）的测定是从Promega（麦迪逊，威斯康星州）购得。

2.2.PEG和PEG-聚组氨酸水凝胶的合成对于PEG水凝胶的制备，通过将聚乙二醇二丙烯酸酯溶解在含光引发剂的去离子水和聚赖氨酸中来制备的PEG前驱体溶液（2-羟基-4′-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯基丙酮），在PEG终浓度为0.02%（w／v）、0.05%（W / V）的光引发剂和10%（W / V）polylys(聚赖氨酸)中。

PEG的前体溶液，放在透明的圆柱形容器（10毫米直径，5毫米高）暴露于8-20 mW/cm2的365纳米的紫外光下10分钟以便于光聚合反应。

光聚合后，直到进一步的分析，形成的PEG水凝胶在去离子水。

对于PEG-聚组氨酸水凝胶的制备，polyHis（多聚组氨酸）与含有光引发剂的去离子水溶液和polylys（聚赖氨酸）搅拌溶解，在终浓度为0.05%（w／v）的光引发剂、10%（W / V）polylys(聚赖氨酸)和1、2、5、10、或20%（W / V）polyHis(多聚组氨酸)。