细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)
背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在—70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中,温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理:细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容(操作步骤）：一、材料（一)仪器1。
净化工作台2. 离心机3。
恒温水浴箱4. 冰箱(4℃、—20℃、—70℃）5。
倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱易生物仪器库：http://www.ebioe。
com/yp/product—list-42。
html（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1。
吸头2. 枪头3。
胶塞4。
移液管(10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml)（四)其他物品1。
微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5。
移液枪（五)试剂1。
D—Hanks液2. 小牛血清3。
培养液4。
双抗（青霉素、链霉素）5。
胰蛋白酶(0。
08%）6. 1NHCl7。
7.4%NaHCO38。
DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：http：//www。
ebioe。
com/yp/product-list—43.html二、操作步骤（一）细胞冻存1。
配制含10%DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液;2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、;3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养传代及冻存操作规程细胞培养、传代及冻存操作规程⼀、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊⼦、温⽔（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%⾎清、双抗、1.5ml 离⼼管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放⼊到培养板中并加⼊双抗，放⼊CO2培养箱中预热，然后取适量的冷⽔加⼊到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开⽔边⽤温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升⾄39℃为⽌（为防⽌在移动过程中温度降低可把温度调⾼1——2℃。
②⽤镊⼦将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放⼊提前准备好的温⽔中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后⽤移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液⼀起吸出放到1.5ml离⼼管中，5000rpm/min 离⼼2min，尽量的除掉上清，然后在加⼊500µl培养基反复吹打待混合均匀后放⼊到事先准备好的培养板中并注明名称、⽇期及操作⼈。
⼆、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加⼊相应体积的培养基之后放⼊培养箱中预热，添加培养基的⽅法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，⽤DPBS清洗两遍，在加⼊相应体积的0.25％胰蛋⽩酶，使板底细胞都浸⼊溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋⽩酶的体积如下表所⽰③消化时间完成后应⽴即终⽌消化，⼀是直接加⼊培养基，⼆是吸除胰蛋⽩酶之后在加培养基，加⼊培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停⽌吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放⼊培养箱24⼩时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的⽣长状态，以便于下⼀步实验的顺利进⾏。
其中有两点很重要，第⼀消化的时间，消化的时间并不是⼀成不变的，要根据细胞的状态随时终⽌消化，上⾯②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第⼆吹打的⼒度跟全⾯性，吹打的⼒度⼀定要适中，不能太⽤⼒避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边⾓的，那⾥会有很多细胞残留，需要提醒的是⼀定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可⽤枪头将其刮下在吹打。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。
紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。
然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心3分钟。
弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。
贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。
2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。
3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。
可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。
4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。
5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。
6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。
首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。
7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。
细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。
细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。
而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。
细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。
2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。
3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。
一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。
4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。
最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。
MSC细胞复苏、传代及冻存操作步骤
MSC细胞复苏、传代及冻存操作步骤MSCs不仅可以下调免疫应答强度以调节机体的先天性免疫与适应性免疫，⽽且还可以促进⾎管⽣成、抑制细胞凋亡。
近⼏年，MSCs已然成为⽣命科学研究的热点之⼀。
然⽽，MSC细胞的培养却⾮易事，成功建⽴可靠的MSC细胞培养操作体系往往需要处理好各种操作细节。
对脐带分离MSC细胞的实操感兴趣的朋友，可以点击链接：历史⽂章-脐带分离原代MSC细胞操作步骤MSC细胞复苏1、仪器设备、耗材及试剂仪器设备：超净⼯作台⼀台、⼆氧化碳培养箱⼀台、⽔浴锅⼀台、低温离⼼机⼀台、显微镜⼀台、1mL电动移液枪、电动移液器。
耗材：镊⼦、15mL离⼼管、细胞培养瓶、10mL移液管。
试剂：MSC培养基础培养基、MSC培养完全培养基、台盼蓝染⾊液。
2、细胞复苏操作步骤实验前准备细胞培养基置于4℃平衡，⽔浴锅预先调⾄37℃，离⼼机开机预冷⾄4℃。
细胞复苏a. 从液氮罐中取出冻存管，如有液氮渗漏进冻存管内，先稍微拧松管盖，让⽓化的液氮逃逸（否则冻存管有爆炸危险）。
b. ⽤镊⼦夹住冻存管，浸⼊37℃温⽔中（注意管⼝不要浸⼊液⾯以下），并不时摇动，待管中冰核溶解⾄黄⾖粒⼤⼩时拿出，酒精擦拭后转移⾄超净⼯作台内。
注：该步骤对细胞存活率⾄关重要，既要尽快融化，减少融化过程对细胞的损害，⼜要尽可能减少细胞在较⾼温度停留的时间，以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在⽔浴锅中不管。
c. 将冻存管内细胞悬液（约1mL）转移⾄装有（约14ml）4℃预冷MSC培养基础培养基的15mL 离⼼管中，上下颠倒混匀（所有操作轻柔缓慢，以防损伤细胞）。
d. 4℃，210g，离⼼4min，吸去上清液，加⼊1mL MSC培养完全培养基重悬混匀。
e. 取出10uL细胞悬液⽤PBS稀释⼀定的倍数，取10µL稀释后的细胞悬液加⼊台盼蓝染⾊液，显微镜下计数；根据计数结果及所使⽤培养基推荐的接种密度（如使⽤达优GF20培养基，推荐接种密度4000-5000个cells/cm2）计算所需细胞悬液体积。
细胞的培养-传代-计数-冻存-复苏
一、细胞复苏（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000r/min 离心5分钟。
（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。
（4）加入足量的培养液，放在CO培养箱中细胞培养，第二天换液。
2二、细胞冻存（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。
生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80%时，换液后 12～24h 换液培养。
吸去培养液，D-Hanks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
（2）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。
反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。
进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500r/min 离心 5 min。
（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73% DMEM 培养液，20％FBS，最后添加 7％DMSO 二甲基亚砜），细胞计数达到2×106/ml 以上。
细胞混匀后加入冻存管中，每管 1ml。
注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。
降温程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→-80℃ 16～18 小时（或隔夜）→液氮槽（-196℃）长期储存。
三、细胞传代（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
当细胞长满培养瓶底的约80%时，吸弃原先的培养液。
（2）加D-Hanks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
步骤不能再精细！细胞复苏、传代及冻存
步骤不能再精细！细胞复苏、传代及冻存细胞复苏、传代及冻存实验步骤:一复苏传代（ 1）准备无菌超净台，酒精灯，75%酒精喷壶，CO2培养箱，37℃水浴锅，离心机；培养瓶，含10%胎牛血清的完全培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液（提前放置超净台使平衡到室温），无菌工作服（白大褂），口罩，手套，记号笔（2）步骤1穿好无菌工作服，带上口罩和手套，快速从液氮里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻，注意冻存管的封口膜不要破裂，防止污染。
2 解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴，酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。
3 开超净台，点燃酒精灯燃烧片刻后（可提前准备），冻存管放超净台，换新手套，小心打开冻存管，避免污染，无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管，补加9ml基础培养基稀释，1000rpm，离心5min使细胞沉淀，弃上清。
4 加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml，轻轻混匀，用吸管将细胞移至25T培养瓶。
5平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。
6培养24小时后，显微镜观察细胞（贴壁细胞）贴壁后，小心更换培养基，继续培养，根据不同细胞的生长状态进行传代培养，培养瓶上标记：操作者，时间，细胞类型。
7有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染，但是这对于掌握细胞培养是非常不利的，不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。
一旦细胞出现污染，易于发现，一旦发现污染的细胞应立刻煮沸丢弃，以免污染同实验室其他细胞。
8细胞长满90%-100%即可传代，小心打开培养瓶，瓶口过酒精灯消毒，弃培养基。
9加入1mlPBS，润洗细胞，重复3次，弃PBS。
10加入4ml完全培养基，用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。
11转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶，各瓶补加完全培养基至4ml。
12小心封口，平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。
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细胞培养程序材料A、仪器1. 净化工作台，2. 离心机，3. 恒温水浴箱，4. 冰箱（4℃）5. 倒置相差显微镜，6. CO2培养箱，7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器B、玻璃器皿1. 吸管，2. 小烧杯（100ml），3. 废液缸，C、塑料器皿1. 吸头，2. 枪头，3. 96孔培养板，4. 15ml离心管，5. 50ml离心管，6. 胶塞，D、其他物品1. 微量加样枪，2. 红血球计数板，F、试剂1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，4. 双抗（青霉素、链霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025% EDTA7. 二甲基亚砜（DMSO），8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。
一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养：（一）细胞原代培养1.贴壁细胞培养法：1）、组织块培养法将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此，5分钟/次。
取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。
待24小时候补液。
或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。
培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。
开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
其他方法：消化分离法、器官培养略2.悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。
（二）细胞株(系)细胞复苏培养细胞复苏的主要操作步骤(1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。
(3) 然后在无菌下取出细胞。
冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。
(4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。
若细胞密度较高，及时传代。
或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。
加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。
注意事项在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。
这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。
然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。
此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。
二、细胞维持培养（细胞换液培养）、培养选拔常规观察(一)原代细胞的维持1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。
第三天换液一次，其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。
待不同组织块周围的细胞连接成片时即可传代。
2、悬浮细胞凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。
白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。
换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。
半量换液的方法如下：将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。
若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。
（二）传代细胞维持培养：同上（三）培养选拔常规观察：1.培养液2.细胞生长情况3.细胞形态变化4.污染情况三、细胞的传代培养：(1)弃旧培养液：吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。
(2)漂洗：每瓶加入2mL，无钙、镁PBS或HANKS液，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。
（此步可以省略）(3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变园后加适量完全培养液终止。
或细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化）。
在37°或25°以上环境进行消化。
(4)终止：加入完全培养基适量（通常10-20%胎牛血清培养基）5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。
(5)离心：离心（1100rpm）沉淀细胞（5-10分钟），去除培养基（含胰酶及EDTA）。
(6)计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度。
(7)传代或冻存：离心后用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养（可1:3至1:5传代，在25cm2的培养瓶中长满细胞可达5*106/ml，经10倍稀释每瓶达105/ml即可，25cm2的培养瓶每瓶5ml培养液）。
或用冻存液调整浓度（一般达1*107）冻存。
（到此步时经证实未被细菌或真菌污染，则撤去抗生素，以免对细胞的生长长生不利影响，指原代培养细胞）四．细胞冻存：细胞冻存液：20% 小牛血清10% 二甲基亚砜DMSO70% 培养液操作步骤：1.选对数增生期细胞（证明无支原体污染），在冻存前一天换液。
2.按常规方法把培养细胞制成悬液，计数，使细胞密度达5*107/ml左右，离心，去上清液。
（冻存细胞数量要充分，密度达5*107/ml，在溶后稀释20倍时，仍能保持5*105ml数量）。
一般25cm2的培养瓶满瓶才达到105.3.加入配置好的冻存液，与去上清液相同的量一滴一滴的加入离心管中，让侯用吸管轻轻吹打令细胞重悬。
冻存细胞室培养液中加入保护剂10%二甲亚砜(DMSO)或甘油，可使冰点降低，使细胞内水份在冻结前透出细胞外。
（细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSP和90-95%原来的细胞生长用之新鲜培养基均匀混合。
注意由于DMSO稀释时会释放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成）4.分装于无菌冻存管中，每管1.5ml悬液。
5.旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标志。
6.冻存：1）冰箱4℃放2小时，-75℃过夜，转液氮保存，2）4°，0°，-20°各30分钟（现代分子生物学实验技术P647），最后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。
附件一、培养细胞的生长状况观察（一）细胞计数操作规程胎盘蓝法原理：（产品批号：T8154，T6146和Z35,962－9）使用胎盘蓝染色决定血细胞总数和活细胞数目，胎盘蓝是用于染色的多种染料中能被活细胞排斥的一种染料，这种方法的成立是基于活细胞不能被染色：胎盘蓝对血清蛋白比细胞蛋白有一种更强的亲和力，如果背景太深，在计数之前细胞应成球状并重悬在无蛋白的培养基或盐液中。
方法：1、预先在平衡盐液中悬浮细胞（例如：Hank’s平稳盐液HBSS，产品批号：H2513）2、取0.5ml 0.4%胎盘蓝于一试管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml细胞悬液（稀释倍数＝5）并且混匀，允许放置5－15分钟。
注意：如果细胞在胎盘蓝中暴露时间过长，活细胞也会像死细胞一样被染上色。
3、在血细胞计数板上盖上盖玻片，使用巴斯德毛细吸管或其它合适的器材取少量的胎盘蓝细胞悬液于血细胞计数板上的两个小室中。
将巴斯德毛细吸管小心的靠在盖玻片边缘，利用毛细张力充满小室，不要过度或过少充盈。
1）从血细胞计数板的一个小室开始，计数中间和四角边长/mm的正方形中的所有细胞数（详见sigmaP1845的图样I）死细胞被染成蓝色，分别计数活细胞和死细胞数。
注意：压线细胞的计数原则，数上不数下，数左不数右（详见sigmaP1845的图II）2）重复上述步骤计数第2个小室注意：如果超过10%的细胞成串，应重复全部程序通过吹打务必使细胞在原液中和在胎盘蓝细胞悬液中一样分散，如果在10个正方形方格中细胞数少于200个或多于500个（20－50个细胞/正方形）应重复这个步骤，以调节细胞稀释倍数。
3）准备第二份样品并重新计数以保证准确4）细胞计数－血细胞计数板上盖好盖玻片的每个正方形（指中央大方格，其长度宽度均为1mm的正方形，与盖玻片的距离为0.1mm），总体积为0.1mm3或10-4cm3。
若1cm3近仍等于1ml，那么每毫升中集中的细胞数（和细胞总数）则可以这样来计算。
每毫升细胞数＝每个正方形的平均细胞数⨯稀释倍数⨯104（10个正方形的细胞计数）例：如果每个正方形的平均细胞数是45⨯5⨯104＝2.25⨯106个细胞/ml总细胞数＝每毫升细胞数⨯最初的细胞样品的体积例：2.25⨯106 (个细胞/ml) ⨯10ml（最初体积）＝2.25⨯107个细胞（总细胞）5）活细胞比例（%）＝总的活细胞数（没染上色的）÷总的细胞（染上色的和没染上色的）⨯100例：如果每个正方形中没染上色的（活的）细胞平均数是37.5，总活细胞数＝(37.5⨯5⨯104)活细胞数/ml⨯10ml（最初体积）＝1.875⨯107个活细胞，活细胞比率（%）＝1.875⨯107（活细胞数）÷2.25⨯107(总细胞数) ⨯100＝83%.血球计数板的使用16×25型的计数板将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数（见图二）。