液质联用操作规程

1、适用范围

本设备配备ACQUITY UPLC液相色谱仪、ＴＱS ＭS/MS 质谱仪,适用于食品、药品中各种有机物得定性、定量分析,就是一种具有高灵敏度得检测仪器,仪器由主机、计算机与数据处理软件等组成、

2、职责

2.1操作人员按照本规程操作仪器,认真填写实验使用记录、

２、２保管人员负责对仪器进行定期维护与保养。

2.3科室负责人负责监督检查规程得执行。

3.操作程序

日常操作步骤:

准备UPLC —→设置样品表—→运行样品—→定量—→打印报告、

注:如果一个星期内不运行样品请不要关质谱仪,使其保持真空。

建立新方法与proｊeｃｔ得操作步骤:

准备UＰLC-→建立新得project —→用标准品调谐—→编辑质谱方法-→编辑UP ＬC方法—→设置样品表—→运行样品—→定量—→打印报告、

3。1开机:

3.1.１彻底开机顺序(仪器已关闭)

确定MS及其它仪器电源电缆已连接,开氮气发生器、开氩气,小表〈0。1mｐa。打开计算机电源〉等待windｏws正常启动＞电脑界面右下角网络图标红叉。打开UPＬC自动进样器电源,等到电脑界面右下角网络图标出现感叹号！、

打开ＵPLC泵电源,等约3０s或者就是有响声。

打开质谱电源,等待5min,离子源透视镜里面亮。

打开Ｍasｓlynｘ软件,mａsslynx主界面—-——－左侧ｉｎstruｍent—--—Maｓs tune－-－界面菜单栏vａcｕum——-pｕmｐ同样界面左侧偏上dｉagnosｔｉc ｓ—--vacuｕm—－－aｎalyser MＳ１ｔurbo speｅｄ［%］要在5分钟内升到８0。至少抽真空4个小时〉查瞧真空状态主界面mass ｃonｓoｌe--—界面左侧xe

ｖo tq ms ｄeｔectoｒ加号展开——-ｍs diｓｐlay > 碰撞室真空度〉达

到7、ｘｅ-5mbａr。

３.1．２日常开机顺序(仪器未关闭)

开氮气发生器、开氩气,小表＜0.1mpａ,打开Masslynx软件,进入工作站。

３、２建立项目

点击file下得projｅcｔｗizard ,出现对话框,单击yｅs 出现对话框,输入proｊecｔ,ｌocａｔioｎ为Ｃ:\MS ＤＡTA ,单击next ,选择cｒeａte exiｓtiｎg ｐrｏject as ｔｅmｐlａte,并以ｃ:\ｍａｓsｌｙnx\dｅfaｕlt、pro 为模板,单击ｆiniｓｈ.点击OK。

３。３准备ＵＰＬC系统

准备液相得一般流程:准备流动相> 准备样品〉灌注二元泵＞灌注自动进样器〉建立液相方法> 平衡液相

３．3.1.准备流动相

用0、22ｕｍ得膜过滤缓冲液,所有得缓冲液与超纯水都要新配制,超纯水与缓冲液使用不得超过二天,缓冲盐一定要就是可挥发得,而且浓度不要大于1０ｍＭ。

3。3.2、样品要求

所有样品都要用流动相初始梯度比例得溶剂来溶解,并用0、22um得膜过滤、3.3．３灌注二元泵

在Mａsslynｘ主界面,单击MS Coｎｓｏlｅ,进入ＵPＬC交互显示界面,点击左栏ＡcquitｙＵPＬC Sysｔem>Control〉Ｓtart Up System ,单击ＱSM,选择需要用到得流动相位置,如A 与Ｂ,选择seal wash,时间设为３分钟。

单击SM,选择Stroｎg Wａsh 5 cycｌes, Ｓaｍple syｒiｎgｅ20

单击ＥqｕiｌibrａｔｅtｏMetｈod,将流速设为0 ,单击Stａrｔ开始灌注.时间大约为9min 左右、

设定流速,平衡液相

在Ｍａsｓlynx主界面,单击ＩnleｔMetｈod 图标,打开液相方法编辑窗口,单击ｓtatｕs＞ACＱＵＩＴY AdｄitionaｌSｔatus,进入液相控制台,单击A 或Ｂ或流速得位置,出现流速、比例设定对话框, 设定液相流速与比例,单击对勾,开始平

衡液相,如果后面要做调谐,可设定流速0.2ml/min,有机相与水相得比例为50:50。

3。4 准备质谱

3。４.１、计算化合物单同位素质量数

Mａssｌynx主界面＞单击Tooｌs〉MoleｃuｌarＷｅｉght Caｌculator, 输入化合物得分子式(大写—注意Cl、Ｂr等正确得输入方法) ,注意选单同位素Moｎｏiso ,Ion Ｍode:离子化模式,+ve 正离子,-ｖe 负离子,单击Cａlculａtｅ。

3．4.２用Inteｌliｓtａrt进行自动调谐

在Masslyｎｘ主界面单击ＭS Tunｅ图标,打开调谐窗口,

单击Ion Ｍｏde＞ES+ 或ＥS－,单击API Gａs图标打开氮气, 单击

打开高压

选择ＭS Moｄe 图标,设定液相流速0.2ml/min, 水:乙腈得比例为50:5０。

把标准品调谐液放入质谱仪塑料瓶位置处得Ａ(或B或C)号位(注:浓度在200ppb左右)

单击Fluidicｓ,选择Resｅrvoｉr为A ,Ｆlow Staｔe 为ＬC模式,点击Ｐｕrge 图标。

Ｐurge结束后,将Ｆlｏw Staｔe 改为Cｏｍbｉｎe 模式,设定Funｃtion为ＭS １sｃａn, Masｓ为计算出化合物得质量数,ｓpan 为５,点击进样,开始进样,直到离子得响应比较稳定。保存调谐文件:Filｅ〉SavｅAs至已建得项目下。

在Masslynx主界面,选择Ms Consｏle> Xeｖo ＴQ MＳＤeteｃtoｒ

选择Intellｉstarｔ,选择SampｌｅＴune aｎd Dｅvelop Mｅｔhod ,ES+

单击Start 图标,出现Ｉntｅlｌisｔart 自动调谐编辑窗口,选择Sｗｉｔch to Aｄvanｃed

mｏdｅ,输入Coｍpounｄｎame (化合物名称) ,Moleculａr Mass/Ｆormuｌa (分子量或分子式) Adduct A+(［M+Ｈ］+, 选择LｏaｄExiｓtiｎg SampｌeＴunｅ,在SamplｅTune Ｎame 方框后得“。。。"处调用开始保存得调谐文件,在DeveｌoｐMＲM Method前得方框打钩,并在方框出输入MＲＭ方法得文件名,路径为已建得项目下。在Priｎt Rｅｐort 前方框打钩,Cone Vｏltａge,Ｃo

ｌliｓion Enｅrgｙ处为默认值,Fluiｄics 下得Ｆlow Path 选择bｉnｅｄ模式,Sａmple Reservｏir 与SaｍplｅFｌow Rate 参数与Ｆulｄics 下Ｃombined模式下得进样参数保持一致、单击右边得Start 开始自动调谐。调谐成功,会有绿勾出现,查瞧intellisｔａrｔ报告

3。4。3查瞧ｉntｅllistａｒt 中自动生成得质谱方法:

从MassＬｙnx主窗口,单击MS Meｔhｏd,出现MＳMｅthoｄ编辑对话框,

选择Fiｌe 〉ｏｐｅn, 选择Intｅllｉsｔａｒt中保存得质谱方法得文件,双击方法,如发现自动调谐生产得质谱方法中部分参数有误,则可以在Cｈａnｎｅｌｓ窗口手动修改参数,填写relｅntinoｎwiｎdow 中得enｄ时间,此时间必须与液相色谱方法运行时间保持一致,选择AutoＤｗｅll,单击OＫ,点击Fｉｌe> Sav ｅAs,保存质谱方法文件。

3、5建立液相方法

３.５。１编辑液相方法

在液相方法编辑窗口,单击Iｎle t ,输入溶剂名称,ｒｕn ｔiｍe及梯度洗脱程序,梯度洗脱程序中最后阶段时间必须与ｒun ｔｉｍｅ符合,单击OK, 选择Ｆile

＞Save As保存方法,单击Load Ｍethod ,平衡液相。

3。５.2建立样品列表

在Ｍａssｌynx主窗口,选择File 〉New 建立一个空白得表ｓampleliｓｔ。输入文件名,样品信息,双击MS Ｆile ,选择质谱方法,双击Iｎlet Filｅ, 选择液相方法,在Ｂottle 中输入样品瓶得位置,在Inject Volume中输入进样体积,可右键〉Add, 增加样品表得行数,保存样品表:Ｆｉle > Ｓave As 。

3.６数据采集与处理

3.6．1、选中要采集得样品,单击Ｒun > Ｓtart ,选择Acquiｒe Sample Datａonly,,单击OＫ开始进样并采集、

3.６。2在采集过程中,可查瞧色谱图,点击Ｃｈroｍatogram窗口,点击Reａｌ—tim ｅ

Updａｔe iｃon 。如果不能见整个ＴＩＣ图,单击DefaｕｌｔRange 图标。

如果方法中包括多个通道,可通过Dｉsplaｙ〉Ｍass 查瞧

如果方法中包括多个检测器或多个Function,可通过Display ＞TIＣ查瞧

3.６。3处理多个Ｆunｃtion得数据

如果质谱方法中有多个Funｃtion,如有三个Ｆunctioｎ,如想瞧第二个Fuｎctｉo ｎ,MS Ｓcａｎ得数据。

3。６.3。1 在色谱图窗口,点击Ｄisｐｌay ＞ＴＩC,选中MＳSｃan ,选择Add trace ,单击OK。

3。６．3.2如想查第二个Funcｔｉoｎ, DaughtｅrＳcan 质谱图,在色谱图中,

选择Ｄｉsｐlay ＞TIＣ, 选择ＳcanＷaveＤSＡdd ｔｒａcｅ,单击ＯＫ。

３。6．3。3、选择Ｐrocess ＞Coｍbinｅspectra。分别用右键输入信号与本底噪音。单击OK、得到Dａuｇｈtｅr Ｓcａn得质谱图,单击Proｃe ｓs>Smoｏth…,单击OK、

3.7数据处理－外标定量法

３．7.1在Massｌynx主页面单击Targｅtｌynx/Ｅdiｔｍｅthｏd,出现定量方法编辑对话框,

单击新建方法图标,新建一个定量方法。

3。7.２单击Aｄd new coｍpouｎd (添加新得化合物)图标,添加一个新得化合物。

3.7．３单击菜单栏updatｅ,选中Qｕaｎｔiｔatｉｏn Ioｎ与CｏmｐounｄName(前面打勾)

在Massｌynx 主页面,打开中等偏下低浓度标准品得色谱图,Diｓpｌａy/Mass

chrｏmatogｒａm选出要定量得化合物得离子对,一般强度高得化合物用来做为定量离子,另一个离子对则作为确证离子,用鼠标右键在定量离子对色谱图上拉一下,则pｏunｄname, Ａcquisition Fuｎctｉon Ｎumber,Quantificaｔｉｏn Ｔrace, Preｄicｔｅd Reｔenｔｉｏn Ｔime与ReｔeｎtioｎTime wiｎｄow 将自动输入到定量方法中。注意:在色谱图上拉得时候,要遵循两个原则,拉得位置要以色谱峰得峰尖左右对称,拉得宽度要超过峰得起点与终点、

３。7。4单击工作曲线图标,在工作曲线设置页面,填入

Concｅntration Uｎitｓ:浓度单位,例如ng／ml, ug／kg,ppb,ppm等。

Concｅntｒatｉon of Standard: Leｖｅl–选择Cｏnc。Ａ。

PoｌｙnomiａlＴypｅ–选择Lineａr。(可根据自己行业得规定)

CaｌibratioｎOrｉgｉn_选择eｘcludｅ(排除原点),inｃlｕde(包含原点),ｆ

orce(强制过原点)

Weithting Fｕnction(权重)_1/ｘ(根据自己行业规定)

Prｏpagate CalｉｂｒatioｎParameters_如果所有得化合物均用相同得工作曲线得参数,选Yes

３.7。５打开积分参数列表,选中Aｐex Tｒack Eｎabｌed (打勾,YEＳ),Inteｇration Ｗｉndow Eｘtｅnt输入2,选中PrｏｐagatｅIntegｒation Parameｔerｓ(打勾),如果色谱峰并不就是很对称得色谱图,可先在色谱图上先设定参数,积分,好积分参数满意之后,proｃeｓs/inｔegrate…/cｏpy,在Ｔarｇetlyｎx 方法中Ｅdｉt/Past就可将其粘贴到Tａrｇｅtｌynx方法中。建议用Ａpex Traｃk 积分方法,Smｏoth 方法建议用ｓmooｔｈｉtｅraｔioｎ1,ｓmooth wiｄtｈ2。重复上面得过程,把其她几个化合物得信息全部加入,

保存方法: As, 保存到当前项目得ＭｅtｈDB 文件夹中,正确得saｍplelisｔ表格模板,除了前面进样时得选项之外,还要有saｍpｌe ｔypｅ, ConA,等选中要处理得样品,单击ProcｅsｓSampleｓ,出现下图得对话框,确保选中,Ｉnteｇrａtｅ、sampl ｅ,caｌibratｅＳtandａｒｄ,Ｑuanｔify Sample,选择刚才编辑得Ｔａrｇｅtly ｎx方法,单击OK后,出现定量结果对话框、可根据自己得需要,用鼠标右键,ＣｈanｇCｏlumn Ordeｒ来增加或减少Ｓumｍａｒy中得选项。

３。8关机程序

３.8.1日常关机:

３．8。1。１如果流动相中有缓冲盐必须先将缓冲盐换成水,灌注2分钟,流速设为0、２ｍｌ／min,80%水相,冲洗至少3０分钟,换成80%有机相,冲洗至少20分钟,停流速,水相,冲洗至少３0分钟,换成80%有机相,冲洗至少2０分钟,停流速,柱温为室

温。

3。8．1、2关质谱:主界面mass tune或者电脑下面仪器图标－－－－界面左侧偏上ｆluidicｓ—--floｗsｔａtｅ选择为waste、关氩气,mass tuｎｅ界面或者电脑下面仪器图标工具栏第６个＞关高压mａss ｔuｎe界面右下角>等待去溶剂气

温度降低至10０度以下mａｓs tune界面或者电脑下面仪器图标左侧偏上。ＥＳ+soｕrce－—－--teｍperatｕｒe－—-desolvatiｏn > 关氮气,点击氮气发生器开启开关。

3．8。2彻底关机

3.8.2.1 先完成日常关机

３。8.２。2泄真空: tune page> ｖaｃuum 〉vｅnｔ—－-yes > 等待涡轮分子泵转速降到10以下,massｌynx主界面-－－—-左侧insｔｒumenｔ－---Mass tune——-界面左侧偏上diaｇnoｓtics—-—vａcuum——-source ｔｕrboｓpeｅd ［%]

3。８.２、3退出软件,其她界面先退出,主界面最后退出

3。8。２、4关质谱电源> 关所有ＵPＬC电源,计算机电源,仪器三个电源顺序无所谓,关氮气发生器,氩气。

3。8。2.５如果有UＰS,关闭UPS电源,计算机电源。

4日常维护、保养及注意事项

４.1仪器室要保持整洁、干净、无尘;配套设施布局合理。

4、2 仪器室温度应相对稳定,一般应控制在20-2５℃,保持恒温;相对湿度最好为50－70%,室内应备有温度计与湿度计,一般采用空调与吸湿机调节温度与湿度。４。3气压过滤机械泵油 ,停止样品采集、停止流动相、关闭高压、关闭所有气流,关闭离子源内得真空隔离阀。用一字镙丝刀顺时针方向拧开机械泵上得Gａs Ballaｓt 阀四分之一圈,运行 30 分钟后再把Ｇas Baｌlast 阀旋转到原来

关闭得位置。对于ＥSI源,至少每星期做一次,对于APCI源,每天做一次。

4、4开高压之前一定要先开氮气,关氮气之前一定要先关高压。

４。5 ESI 离子化与溶剂密切相关,在使用某些溶剂与添加物需要注意以下几个方面:三氟乙酸(TＦA)多用于蛋白质与多肽分析,但对EＳＩ离子化有抑制效应;三乙胺(TEA)在ｍ／z 1０２处有较强得［M+Ｈ］＋峰,有可能会抑制某些碱性化合物在正离子ESI条件下得离子化,也有可能会增强某些碱性化合物在负离子EＳＩ条件下得响应;

4。6 要避免使用非挥发性得盐 (phoｓｐｈaｔｅ, boｒate, ciｔrate, etc、);表面活性剂、清洁剂与去污剂 (会抑制离子化);以及无机酸 (sｕlpｈｕric acid, phosphoric acｉd etc、)等。

4、7 连接UPLC泵、色谱柱、注射泵以及ＥSＩ探头时,要将仪器置于staｎdby 状

态。

4.8、当改变分辨率得时候,仪器得质量数也会有轻微得偏移,所以在不同分辨率得条件下,应该做质量数校正。

４.9样品贮存在塑料离心管中,其中得添加剂很容易混入,尤其就是被有机溶剂浸泡时间较长时,会产生干扰物信号。

4.10工作站计算机不要安装与仪器操作无关得软件,要经常清理计算机磁盘碎片,定期查杀病毒,定期备份实验数据。

4。11仪器应定期检查,并有专人管理,负责维护保养及清洁。

4、12实验完毕要清洗进样针、进样阀等,用过含酸得流动相后,色谱柱、离子源都要用甲醇/水冲洗,延长仪器寿命。

４。13定期清洗样品锥孔:关闭隔断阀,取下样品锥孔,先用甲醇:水:甲酸(45:45:１0)得溶液超声清洗1０分钟,然后在分别用超纯水与甲醇各溶液超声清洗１０分钟,待晾干后再安装到仪器上。当灵敏度下降时,需要清洗Ｓource、二级锥孔与六级杆、

４.14定期(每星期)检查机械泵得油得状态,如果发现浑浊、缺油等状况,或者已

经累积运行超过３000小时,要及时更换机械泵油。

5 支持性文件

Wateｒｓ Xeｖo—TＱS液质联用仪使用手册。