核酸检测在血液筛查中的应用PCR(新).ppt
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新冠病毒核酸检测标本采集PPT培训课件
答
采样后请立即将拭子放入采样管中，并旋紧管盖。
操作演示与学员练习
操作演示
通过PPT展示或现场演示的方式，向 学员展示正确的鼻咽拭子采集方法。
学员练习
在指导老师的监督下，学员分组进行 鼻咽拭子采集练习，确保掌握正确的 操作方法。
03
口咽拭子标本采集方法
口咽拭子采集部位及操作要点
采集部位：口咽部， 包括咽后壁、扁桃体 隐窝及侧壁等部位。
单独处理。
06
总结回顾与考核评估
总结回顾本次培训内容要点
01
02
03
04
新冠病毒核酸检测的基本原理 和重要性
标本采集的种类、方法和注意 事项
标本保存、运输和处理的规范 操作
实验室生物安全和个人防护措 施
考核评估学员掌握情况并反馈结果
针对学员提出的问题和困惑进行 解答和指导
根据考核结果，对学员进行针对 性的指导和建议，帮助其进一步 提高操作技能水平
操作演示
通过PPT展示口咽拭子采集的详细步 骤，包括采样前准备、采样部位选择 、采样操作及标本保存等。
学员练习
在模拟人上进行口咽拭子采集操作练 习，确保每位学员都能熟练掌握采集 方法。同时，学员之间可相互监督、 指正操作中的不足之处，共同提高操 作技能。
04
血清标本采集方法
血清标本采集部位及操作要点
采样人员应站在患者侧 方，让患者头部微仰， 用拭子贴鼻孔进入，沿 下鼻道底部向后缓缓深 入，由于鼻道呈弧形， 不可用力过猛，以免发 生外伤出血。
待拭子顶端到达鼻咽腔 后壁时，轻轻旋转一周 （如遇反射性咳嗽，应 停留片刻），然后缓缓 取出拭子，将拭子头浸 入含2～3ml病毒保存液 的管中。
注意事项与常见问题解答
采样后请立即将拭子放入采样管中，并旋紧管盖。
操作演示与学员练习
操作演示
通过PPT展示或现场演示的方式，向 学员展示正确的鼻咽拭子采集方法。
学员练习
在指导老师的监督下，学员分组进行 鼻咽拭子采集练习，确保掌握正确的 操作方法。
03
口咽拭子标本采集方法
口咽拭子采集部位及操作要点
采集部位：口咽部， 包括咽后壁、扁桃体 隐窝及侧壁等部位。
单独处理。
06
总结回顾与考核评估
总结回顾本次培训内容要点
01
02
03
04
新冠病毒核酸检测的基本原理 和重要性
标本采集的种类、方法和注意 事项
标本保存、运输和处理的规范 操作
实验室生物安全和个人防护措 施
考核评估学员掌握情况并反馈结果
针对学员提出的问题和困惑进行 解答和指导
根据考核结果，对学员进行针对 性的指导和建议，帮助其进一步 提高操作技能水平
操作演示
通过PPT展示口咽拭子采集的详细步 骤，包括采样前准备、采样部位选择 、采样操作及标本保存等。
学员练习
在模拟人上进行口咽拭子采集操作练 习，确保每位学员都能熟练掌握采集 方法。同时，学员之间可相互监督、 指正操作中的不足之处，共同提高操 作技能。
04
血清标本采集方法
血清标本采集部位及操作要点
采样人员应站在患者侧 方，让患者头部微仰， 用拭子贴鼻孔进入，沿 下鼻道底部向后缓缓深 入，由于鼻道呈弧形， 不可用力过猛，以免发 生外伤出血。
待拭子顶端到达鼻咽腔 后壁时，轻轻旋转一周 （如遇反射性咳嗽，应 停留片刻），然后缓缓 取出拭子，将拭子头浸 入含2～3ml病毒保存液 的管中。
注意事项与常见问题解答
PCR技术在临床检验中的应用.ppt
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CT
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20 0.001
Sample
y = -1.2908Ln(x) + 27.187 R2 = 0.997
0.010
0.100
1.000
(Log N) initial concentration
10.000
100.000
DNA标准品扩增图
50 ng/ µL
Smaller the CT number the more DNA detected
约40％
假基因
基因片段
内含子，非翻 译序列
串联重复序列/ 成簇重复序列
散在重复序列
人类基因组的组织成分
DNA指纹技术基本流程图
DNA指纹图的遗传规律
遗传方式：子代图谱中所有的片段都可以在双亲的图谱 中找到，片段的传递符合孟德尔遗传规律。
个体的组织同一性：即来源于身体不同部位与类型的组 织，其DNA指纹图谱是一致的。
Threshold – 即能够检测到的荧光信号域值，通过比较不
同样品达到域值所需的循环数，从而可以比较不同样品的 浓度。
CT (Cycle Threshold) -在荧光定量PCR技术中，有一
个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表 threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到 达设定的域值时所经历的循环数。
STR分析个体基因型原理
引物
AATG AATG AATG
7 repeats
引物
引物
引物
8 repeats
重复单位的不同决定了个体之间的特异性
纯合子 = 双等位基因等长 杂合子 = 双等位基因不等长
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理ppt课件
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
第一代：手动/机械手式水浴基因扩 增
➢ 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在 三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃）低温复 性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。 再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同 温度的水浴箱中依次水浴。
➢ 核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。 DNA和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA 所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而 RNA含脲嘧啶U。
➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是
单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一
➢ 这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易 因疲劳引起差错P；CR技术而及临优床应用点原、理新是冠病毒:核设酸检备测 简单，投资少，
第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
➢周而复始的升降温度进行扩增，每 PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
PCR扩增步骤
➢DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成 单链DNA。
➢退火（25℃-65℃）：系统温度降 低，引物与DNA模板结合，形成局
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
PCR扩增示意图
➢ 因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突 变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结 果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
第一代：手动/机械手式水浴基因扩 增
➢ 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在 三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃）低温复 性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。 再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同 温度的水浴箱中依次水浴。
➢ 核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。 DNA和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA 所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而 RNA含脲嘧啶U。
➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是
单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一
➢ 这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易 因疲劳引起差错P；CR技术而及临优床应用点原、理新是冠病毒:核设酸检备测 简单，投资少，
第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
➢周而复始的升降温度进行扩增，每 PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
PCR扩增步骤
➢DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成 单链DNA。
➢退火（25℃-65℃）：系统温度降 低，引物与DNA模板结合，形成局
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
PCR扩增示意图
➢ 因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突 变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结 果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
PCR临床应用PPT优秀课件
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1,073,741,824 9
荧光PCR的原理
10
PCR技术的特点
灵敏度高 特异性强 快速简便 应用范围广
11
Ct值的意义
FQ-PCR
Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次
扩增
Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct
值不同
12
荧光定量PCR的临床应用
28
HCV
(二) HCV-RNA定量检测的临床意义
1. 早期诊断 a. 临床以< 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。 b. HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。 c. 严格筛选献血员 ,提高对窗口期感染者的检出率。
HBV
5. HBsAb (＋) 、 HBcAb (＋) 、 HBeAb (＋)三抗体阳性 与HBV DNA 2.5× 103 copy /ml 结果解释。
24
HBV
(三) HBV-DNA定量检测的临床意义
1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性
2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效
a. 专家提出<103 copy /ml做为阴性或临床治愈标准 b. HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后) c. 拉咪呋啶
一般不存在于血循环中
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
22
HBV
（二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；
核酸检测技术PPT课件
28
多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR: How
• Same as regular PCR • Care in primer design
– Much greater chance of primer-dimers – Much greater chance of artifacts – Annealing temperatures must be close
……
26
2.1 多重PCR（multiplex PCR）
多重PCR（multiplex PCR）:What
• PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLY
• Typically generates a product band for each primer pair
21
PCR的扩增？
22
The first cycle
The second cycle
How does PCR work
23
The third cycle
The fourth cycle
24
How does PCR work
2. PCR的类型
25
1. 多重PCR（multiplex PCR） 2. 巢式PCR（nested PCR） 3. 定量PCR（quantitative PCR） 4. 不对称PCR（asymmetric PCR） 5. 反向PCR（inverse PCR） 6. 逆转录PCR（reverse transcription PCR） 7. Overlap PCR
平台期
平台期
基线期
Cycle（循环数）
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多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR: How
• Same as regular PCR • Care in primer design
– Much greater chance of primer-dimers – Much greater chance of artifacts – Annealing temperatures must be close
……
26
2.1 多重PCR（multiplex PCR）
多重PCR（multiplex PCR）:What
• PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLY
• Typically generates a product band for each primer pair
21
PCR的扩增？
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The first cycle
The second cycle
How does PCR work
23
The third cycle
The fourth cycle
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How does PCR work
2. PCR的类型
25
1. 多重PCR（multiplex PCR） 2. 巢式PCR（nested PCR） 3. 定量PCR（quantitative PCR） 4. 不对称PCR（asymmetric PCR） 5. 反向PCR（inverse PCR） 6. 逆转录PCR（reverse transcription PCR） 7. Overlap PCR
平台期
平台期
基线期
Cycle（循环数）
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1PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理PPT
三、PCR技术简介
➢ 高温可以使双链DNA解链成为单链，这一过 程称为变性。
➢ 变性后的DNA通过降温可以重新接合为双链， 这一过程称为复性。
➢ PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过 程，它的特异性取决于与靶序列两➢ 设计引物作为启动序列，加入DNA聚合酶、
➢ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。
PCR扩增示意图
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 12
二、PCR的发展史
➢ 1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开 启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学, 分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。
➢ 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
➢ 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其 扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望 的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。
24
38
4 16
5 32
30次循环后靶序列扩增6的数量64
20 1,048,576
常用的ＰＣＲ技术
➢ 定性ＰＣＲ 电泳检测、放射自显影 特异性差、易污染、只能定性
➢ ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ 特异性较好，极易污染、定量不准确
➢ 终点法荧光ＰＣＲ 特异性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好
➢ 实时荧光ＰＣＲ 特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好
和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的 戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧 啶U。 ➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核 苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为 戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。
核酸检测ppt课件
经过治疗后的HBsAg转阴，ELISA方法 检测阴性的献血者。
精选ppt
3
NAT与ELISA互补
病毒变异 免疫静默期 实验操作失误 病毒感染的窗口期
精选ppt
4
病毒检测窗口期
项目 HBsAg 抗-HCV 抗-HIV
ELISA窗口期 项目 NAT窗口期
56
HBV 25
72
HCV 59
22
《全国艾滋病检测技术规范》用于核酸定性检 测时，采集的抗凝全血应在48h内分离PBMC和 血浆，否则应在2448h内分离血浆和血细胞。
精选ppt
31
试剂的稳定性
试剂的灵敏度 试剂内标的最佳标准 试剂与全自动工作站的磨合
精选ppt
32
完善实验室管理
• 技术要求更高 • 操做要求更专业 • 质量控制更严格
核酸检测在血液筛查中的应用
深圳市血液中心
精选ppt
1
血液筛查是否需要进行核酸检测
精选ppt
2
无偿献血的新动态
“定期无偿献血者是低危的献血者” ，但是“以体检为目的定期无偿献血 者是高危献血者”而且这部分人群的 献血队伍正在扩大。这部分人群窗口 期的机率高于其他人群。因为在他们 中间高危的传播行为经常发生。
HCV、HIV窗口期浓度高，因此对灵敏度要求较低。
美国FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被 检出
HBV的窗口期标本在30-300IU/ml之间，因此对灵敏 度要求高
低于灵敏度也有检出的可能，这与取样几率有关
精选ppt
9
血液筛查常用的NAT技术
精选ppt
10
容性强的设备、试剂销路好) 试剂成本 质量成本
精选ppt
3
NAT与ELISA互补
病毒变异 免疫静默期 实验操作失误 病毒感染的窗口期
精选ppt
4
病毒检测窗口期
项目 HBsAg 抗-HCV 抗-HIV
ELISA窗口期 项目 NAT窗口期
56
HBV 25
72
HCV 59
22
《全国艾滋病检测技术规范》用于核酸定性检 测时，采集的抗凝全血应在48h内分离PBMC和 血浆，否则应在2448h内分离血浆和血细胞。
精选ppt
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试剂的稳定性
试剂的灵敏度 试剂内标的最佳标准 试剂与全自动工作站的磨合
精选ppt
32
完善实验室管理
• 技术要求更高 • 操做要求更专业 • 质量控制更严格
核酸检测在血液筛查中的应用
深圳市血液中心
精选ppt
1
血液筛查是否需要进行核酸检测
精选ppt
2
无偿献血的新动态
“定期无偿献血者是低危的献血者” ，但是“以体检为目的定期无偿献血 者是高危献血者”而且这部分人群的 献血队伍正在扩大。这部分人群窗口 期的机率高于其他人群。因为在他们 中间高危的传播行为经常发生。
HCV、HIV窗口期浓度高，因此对灵敏度要求较低。
美国FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被 检出
HBV的窗口期标本在30-300IU/ml之间，因此对灵敏 度要求高
低于灵敏度也有检出的可能，这与取样几率有关
精选ppt
9
血液筛查常用的NAT技术
精选ppt
10
容性强的设备、试剂销路好) 试剂成本 质量成本
1PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理ppt课件
和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的 戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧 啶U。 ➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核 苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为 戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。
须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。
9
第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
10
第三代PCR：实时荧光定量PCR
14
PCR扩增步骤
➢ DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢 键断裂，形成单链DNA。
➢ 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。
➢ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。
26灵敏度高特异性强快速简便应用范围广27新药验证28传染病发病的监控预测与预防29对新型冠状病毒2019ncovorf1ab及编码核衣壳蛋白或e基因的特异性保守序列为靶区域进行了双靶标基因的设计配以pcr反应液在荧光定量pcr应用实时荧光定量rtpcr检测技术通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒rna检测
PCR技术及临床应用、新冠病毒核 酸检测原理
授课人：刘翔宇
1
目录
一．核酸基本知识 二．PCR的发展史 三．PCR技术简介 四．实时荧光PCR技术 五．实时荧光PCR的临床应用 六．新冠病毒核酸检测原理
须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。
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第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
10
第三代PCR：实时荧光定量PCR
14
PCR扩增步骤
➢ DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢 键断裂，形成单链DNA。
➢ 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。
➢ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。
26灵敏度高特异性强快速简便应用范围广27新药验证28传染病发病的监控预测与预防29对新型冠状病毒2019ncovorf1ab及编码核衣壳蛋白或e基因的特异性保守序列为靶区域进行了双靶标基因的设计配以pcr反应液在荧光定量pcr应用实时荧光定量rtpcr检测技术通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒rna检测
PCR技术及临床应用、新冠病毒核 酸检测原理
授课人：刘翔宇
1
目录
一．核酸基本知识 二．PCR的发展史 三．PCR技术简介 四．实时荧光PCR技术 五．实时荧光PCR的临床应用 六．新冠病毒核酸检测原理