酵母的分子生物学鉴定
实验讲义
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。
一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。
酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。
酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。
此作用即酒精发酵。
C6H i2O6（葡萄糖）T 2 C2H5OH（酒精）+2 CO2 f 在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。
而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。
微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。
包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。
目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。
【实验一】一、酵母菌的分离与培养一、【实验目的】学习用选择性培养基分离酵母菌。
二、【实验原理】大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH值为4.5〜6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。
酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。
利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。
酵母基因提取实验报告
一、实验目的1. 学习酵母基因提取的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用CTAB法提取酵母基因组DNA的方法。
3. 熟悉DNA纯化、定量和鉴定等实验技术。
二、实验原理酵母基因提取是通过物理或化学方法将酵母细胞中的DNA与蛋白质、RNA等杂质分离的过程。
CTAB法是一种常用的DNA提取方法，其原理是利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）与DNA的结合能力，以及酚/氯仿等有机溶剂的界面作用，将DNA从细胞中提取出来。
三、实验材料与仪器1. 材料：酵母菌（如酿酒酵母）、Tris-HCl缓冲液、NaCl、CTAB、酚/氯仿、无水乙醇、RNase A、DNA标准品、琼脂糖凝胶电泳系统等。
2. 仪器：高速离心机、恒温培养箱、紫外分光光度计、凝胶成像系统、电泳仪、微波炉等。
四、实验步骤1. 酵母菌培养：将酵母菌接种于YEP培养基中，于28℃恒温培养箱中培养至对数生长期。
2. 酵母菌收集：用无菌吸管吸取适量酵母菌培养液，转移到无菌离心管中，以8000 r/min离心5分钟，弃上清液。
3. 细胞裂解：向离心管中加入适量Tris-HCl缓冲液、NaCl、CTAB、酚/氯仿，混匀后室温放置10分钟。
4. 分相：将上述混合液转移至新的离心管中，以12,000 r/min离心5分钟，弃上清液。
5. DNA纯化：向沉淀中加入适量Tris-HCl缓冲液、酚/氯仿，混匀后室温放置10分钟。
6. 分相：将上述混合液转移至新的离心管中，以12,000 r/min离心5分钟，取上清液。
7. 洗涤：向上清液加入等体积的无水乙醇，混匀后室温放置10分钟。
8. 离心：以12,000 r/min离心5分钟，弃上清液。
9. 洗涤：向沉淀中加入适量70%乙醇，混匀后室温放置5分钟。
10. 离心：以12,000 r/min离心5分钟，弃上清液。
11. DNA溶解：向沉淀中加入适量TE缓冲液，室温放置5分钟，使DNA溶解。
12. 定量：利用紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度。
酵母双杂交的原理及其应用
酵母双杂交的原理及其应用1. 引言酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，可以用于研究蛋白质相互作用、识别蛋白质结构域、筛选靶蛋白等。
本文将介绍酵母双杂交的原理及其在科研和药物研发领域的应用。
2. 酵母双杂交的原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录激活因子（TF）和DNA结合域（DBD）的相互作用来探测蛋白质的相互作用。
该技术主要包括两个重要组成部分：诱饵（bait）与猎物（prey）。
2.1 诱饵（bait）诱饵通常是感兴趣蛋白质的DNA结合域（DBD），可以通过基因工程方法将其与转录激活因子（TF）融合，并构建到酵母细胞中。
2.2 猎物（prey）猎物是待测蛋白质，可以将其与激活域融合，并构建到酵母细胞中。
2.3 相互作用检测当诱饵与猎物相互作用时，其融合蛋白质能够形成转录激活复合物。
该复合物能够通过激活报告基因（如LacZ或荧光蛋白）的表达来检测相互作用的发生。
3. 酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在科研和药物研发领域有广泛的应用。
3.1 蛋白质相互作用的研究酵母双杂交技术可以用于筛选和验证蛋白质相互作用的目标。
通过构建不同的诱饵和猎物，可以识别和验证蛋白质相互作用的蛋白质。
3.2 靶蛋白筛选酵母双杂交技术可以用于筛选潜在的靶向蛋白质。
通过将蛋白质库（library）与诱饵进行组合，可以筛选出与诱饵相互作用的猎物，进而识别潜在的靶向蛋白质。
3.3 药物研发酵母双杂交技术可以用于药物研发的初步筛选。
通过将化合物库与诱饵进行组合，可以筛选出与诱饵相互作用的化合物，进而确定潜在的药物候选物。
3.4 蛋白质结构域识别酵母双杂交技术可以用于识别蛋白质的结构域。
通过将蛋白质的不同结构域与诱饵进行组合，可以确定某个结构域的相互作用蛋白质。
4. 结论酵母双杂交是一种有效的蛋白质相互作用研究方法，广泛应用于科研和药物研发领域。
通过酵母双杂交技术，可以识别蛋白质相互作用、筛选靶蛋白等，为蛋白质相关研究和药物研发提供了有力的工具。
酵母细胞在分子生物学研究中的应用
酵母细胞在分子生物学研究中的应用酵母细胞是一种单细胞真菌，是生物学研究中常见的模式生物。
自20世纪初以来，酵母细胞就成为了遗传学、细胞生物学和生物化学等领域的研究对象。
酵母细胞的优点是繁殖迅速、生长简单、体积小、遗传多型性高等，因此在遗传学、分子生物学和生物化学研究中有着广泛的应用。
一、酵母细胞在遗传学研究中的应用酵母细胞与人类有很高的相似度，其遗传物质的组成和基因的数量也很接近。
因此，酵母细胞在基因研究中可以发挥巨大的作用。
1. 突变分析酵母细胞是一种真核生物，其基因组结构和人类非常接近。
因此，酵母细胞在基因突变和遗传纯化方面具有独特的优势。
对于某些基因，酵母细胞可以人工诱导突变，以此来更好的研究基因破坏对细胞的影响。
2. 显性和隐性基因的研究酵母细胞中存在着显性和隐性两种基因类型。
显性基因在表型上能够直接反映出来，而隐性基因则不能。
通过对酵母细胞进行突变，可以研究不同显性和隐性基因的表达特征和作用机制。
二、酵母细胞是单细胞生物，其组织结构和形态都非常简单，因此可以快速、轻松地进行生物化学和分子生物学研究。
1. 基础代谢研究酵母细胞具有许多与人类细胞相似的基础代谢通路，包括糖类代谢、脂肪酸代谢等。
酵母细胞还可以分泌蛋白质，对分子生物学研究有非常重要的作用。
2. 蛋白质研究酵母细胞可以通过基因工程方式表达外源蛋白质。
这种方法具有简单、快速、成本低的优势，并且能够供应大量的蛋白质，使得分子生物学研究更加便利。
三、酵母细胞在生物化学研究中的应用生物化学研究是对生物中各种物质的成分、结构、功能等性质的研究。
酵母细胞在生物化学研究中也发挥了非常长远的作用。
1. 酿酒作用的研究酵母细胞的最常见的应用是在面包和啤酒制造中。
完成酿酒和发酵过程的十分相似，因此酵母细胞的酿酒作用的研究对于发酵和生物化学研究具有非常重要的参考作用。
2. 转录和翻译调控研究酵母细胞中的mRNA可被逆转录成cDNA，且可用于研究转录水平的变化和差异。
酵母的分子生物学鉴定
生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・技术与方法・２００８年第５期收稿日期：２００８－０３－１４基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）项目基金（２００３ＡＡ２１４０６１，２００６ＡＡ０２０２０３）作者简介：唐玲（１９８３－），女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉｎｇ１０１４９９＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：闫云君（１９６９－），男，教授，博士生导师；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｙｕｎｊｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：（０２７）８７７９２２１４酵母种类繁多，不仅作为一种重要的工业微生物被广泛应用于各个领域，近年来，人们还利用酵母发酵来生产抗生素，维生素和酶等高附加值的产品，但酵母也会引发食物、制造物的腐坏变质，从而给人们带来巨大的经济损失，有的酵母还是人体和动物的致病菌（如，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）。
近两个世纪以来，酵母菌分类主要依据形态学鉴定和生理生化特性。
目前，已发展起来各种用于酵母快速检测的商业化的试剂盒，可实现部分酵母（多是针对导致疾病的部分致病酵母）的鉴定，但是该类试剂盒对酵母的检测不仅费时，而且鉴定结果准确性不高。
由于受到环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面差异极不显著，在这样的背景下，以化学为基础的分类法建立起来，通过细胞壁的成份、生物合成以及同功酶电泳图谱分析来对酵母进行分类鉴定。
现在，随着分子生物学的发展，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，染色体组型分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ），染色体ＤＮＡ的限制性片段长度的多态性分析（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ），线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ）及核糖体ＤＮＡ序列分析（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ），基因芯片（ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）等分子生物学的方法广泛地应用于酵母的鉴定中。
酵母菌的分类与鉴定
酵母菌的分类与鉴定
酵母菌是一类单细胞真菌，常用于面包、啤酒、发酵食品、生物技术等领域。
酵母菌的分类和鉴定主要依据其形态、生理特性和分子生物学特征。
1. 形态分类：根据菌体形态、大小、颜色等特征，将酵母菌分为不同属。
常见的属有酵母属（Saccharomyces）、球孢酵母属（Candida）、香霉酵母属（Schizosaccharomyces）等。
2. 生理分类：通过酵母菌的代谢特征、培养条件等进行分类。
例如，氧气需求、酵母菌对不同碳源（如葡萄糖、果糖等）利用的能力等。
3. 分子生物学分类：通过对酵母菌基因序列进行分析，以及对不同遗传标记（如基因型、DNA指纹等）的测定，可以确定不同酵母属、种、亚种。
酵母菌的鉴定可以通过比较分析其形态、生理和分子生物学特征，使用不同的鉴定方法和技术。
其中，常用的技术包括传统的形态学方法、生理生化测试、酵母菌基因检测、热循环放大（PCR）技术等。
酵母菌遗传学和分子生物学的研究及其在蛋白质表达调控中的应用
酵母菌遗传学和分子生物学的研究及其在蛋白质表达调控中的应用酵母菌是一种常见的单细胞真菌，因其具有许多生物学特征以及适合于遗传和分子生物学研究而成为了研究生物学的优秀模型。
本文将介绍酵母菌遗传学和分子生物学的研究以及它们在蛋白质表达调控中的应用。
1. 酵母菌遗传学研究1.1 酵母菌遗传学的发展酵母菌遗传学研究的主要目的是通过研究其遗传变异现象来探索细胞生长、发育等生物学过程的遗传机制。
早期的酵母菌遗传学研究主要是利用人工诱变进行基因突变，并利用这些突变体进行遗传分析。
随着分子遗传学的发展，酵母菌的基因组序列得到了全面测序，使得酵母菌遗传学研究得以快速发展。
现在我们可以通过基因工程技术对酵母菌进行靶向基因突变，利用这些定向突变体对基因功能进行研究。
1.2 酵母菌的遗传变异现象酵母菌的遗传变异现象包括基因突变、基因转座子、基因表达异常等。
这些遗传变异现象在分子水平上被证明与酵母菌生物学中的很多关键过程相关联。
例如，基因突变体的分子克隆和功能分析揭示了酵母菌基因的特定功能及其相互作用；遗传转座子研究则提供了关于转座子活性的信息；基因表达异常相关的研究则为酵母菌的表观遗传学研究提供了突破。
2. 酵母菌分子生物学研究2.1 酵母菌分子生物学的发展随着分子生物学技术的不断发展，酵母菌分子生物学研究的范围也不断扩展。
除了利用已知酵母菌基因进行遗传突变分析外，我们还可以通过利用遗传工程技术构建可控制的基因表达系统，从而研究细胞发育、代谢、应答等方面的分子机制。
2.2 酵母菌分子生物学应用2.2.1 酵母菌作为蛋白表达系统酵母菌作为蛋白质表达系统具有许多优点，包括高效、低成本、易于进行基因操作等。
它可以被用于大规模蛋白质表达以及药物筛选。
2.2.2 酵母菌在基因组学研究中的应用酵母菌基因组中的完备性，以及多数酵母菌适应快速分裂生长的天然系统性状，和已知的遗传信息使其成为研究生物学科学研究和开发主要方法的重要工具。
酵母菌分析“存活抑制策略” (survival avoidance strategy)，这本质上是一种遗传可变的发育缺陷、细胞周期性质和各种形式的质量控制反应。
酵母同源重组技术流程
酵母同源重组技术流程
酵母同源重组技术是一种基础的分子生物学技术，可用于研究基因功能、蛋白质分析、疾病模型等方面。
下面就是酵母同源重组技术的流程：
1.选择目标基因：在酿酒酵母、拟南芥酵母或其他物种的基因库中选择目标基因，或者直接合成目标基因。
2.构建质粒：将目标基因克隆到可表达的质粒中，加入必要的启动子、终止子、标签等元件。
3.转化酵母：先将质粒转化到大肠杆菌中，进行扩增后再将质粒导入酿酒酵母或拟南芥酵母等受体菌中。
转化可通过电击、冷冻脉冲或化学法实现。
4.筛选菌株：对转化后的菌株进行筛选，选择带有目标基因的克隆。
5.鉴定结果：通过PCR、酶切、序列分析等方法对转化后的菌株进行鉴定，确保目标基因已被稳定地整合到了酵母基因组中。
6.蛋白表达和分析：在合适的培养条件下，将目标基因表达出来，提取
蛋白质进行分析。
可使用SDS-PAGE、Western blot等技术对蛋白质进行检测和定量化。
总的来说，酵母同源重组技术的流程从选择基因、构建质粒、转化酵母、筛选菌株、鉴定结果、蛋白表达和分析六个步骤组成。
在实际应用中，对每一步细节的把握都非常重要，只有充分理解每一个环节的意义，正确操作才能确保实验结果的准确性和可靠性。
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生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・技术与方法・２００８年第５期收稿日期：２００８－０３－１４基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）项目基金（２００３ＡＡ２１４０６１，２００６ＡＡ０２０２０３）作者简介：唐玲（１９８３－），女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉｎｇ１０１４９９＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：闫云君（１９６９－），男，教授，博士生导师；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｙｕｎｊｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：（０２７）８７７９２２１４酵母种类繁多，不仅作为一种重要的工业微生物被广泛应用于各个领域，近年来，人们还利用酵母发酵来生产抗生素，维生素和酶等高附加值的产品，但酵母也会引发食物、制造物的腐坏变质，从而给人们带来巨大的经济损失，有的酵母还是人体和动物的致病菌（如，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）。
近两个世纪以来，酵母菌分类主要依据形态学鉴定和生理生化特性。
目前，已发展起来各种用于酵母快速检测的商业化的试剂盒，可实现部分酵母（多是针对导致疾病的部分致病酵母）的鉴定，但是该类试剂盒对酵母的检测不仅费时，而且鉴定结果准确性不高。
由于受到环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面差异极不显著，在这样的背景下，以化学为基础的分类法建立起来，通过细胞壁的成份、生物合成以及同功酶电泳图谱分析来对酵母进行分类鉴定。
现在，随着分子生物学的发展，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，染色体组型分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ），染色体ＤＮＡ的限制性片段长度的多态性分析（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ），线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ）及核糖体ＤＮＡ序列分析（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ），基因芯片（ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）等分子生物学的方法广泛地应用于酵母的鉴定中。
分子生物学的方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种，而且鉴定的结果精确度更高。
随着数据库中分子信息量的增加，近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛。
１核糖体ＤＮＡ鉴定法核糖体ＤＮＡ普遍存在于生物中，真核生物的核糖体ＲＮＡ中包括２６Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ和５Ｓ４种不同酵母的分子生物学鉴定唐玲刘平黄瑛杨江科闫云君（华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４）摘要：酵母种类繁多，与人类的关系极其密切，但目前由于研究方法的不同，对于酵母的分类还存在着不同的分类体系。
而准确快速的对酵母进行鉴定，既可以有效防止食品腐化变质，又可以增加经济效益，同时也为酵母的分类鉴定奠定一定的理论基础。
对常用的核糖体ＤＮＡ鉴定法、ＤＮＡ指纹图谱鉴定、脉冲场电泳鉴定、实时ＰＣＲ和基因芯片等分子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作中的研究情况进行了比较。
关键词：核糖体ＤＮＡＤＮＡ指纹图谱脉冲场凝胶电泳实时ＰＣＲ基因芯片ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＹｅａｓｔＴａｎｇＬｉｎｇＬｉｕＰｉｎｇＨｕａｎｇＹｉｎｇＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅＹａｎＹｕｎｊｕｎ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｙｅａｓｔｓｈａｖｅｗｉｄｅｒａｎｇｅａｎｄａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｈｕｍａｎｂｅｉｎｇｓ．Ｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔｓｏｍｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆｙｅａｓｔｓｂａｓｅｄｏｎｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｆｉｎｄａｎａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｙｅａｓｔｓ，ｔｈｕｓｂｅｉｎｇａｂｌｅｔｏｐｒｅｖｅｎｔｆｏｏｄｃｏｒｒｕｐｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｅｃｏｎｏｍｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｌｓｏ，ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｐｒｏｖｉｄｅｄ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｄｅｓｃｒｉｂｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｙｅａｓｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ，ＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｇｅｎｅｃｈｉｐｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇＰｕｌｓｅｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＧｅｎｅｃｈｉｐｓ２００８年第５期沉降系数的核糖体ＲＮＡ片段，它们分别对应的基因片段既具有遗传上的相对稳定性，同时由于各种原因具有一定的突变，使它们作为一种良好的生物分类鉴定材料得到广泛的重视。
早期一般选取大小适中的１８Ｓ序列作为鉴定的标准，随后２６Ｓ的Ｄ１／Ｄ２区序列和ＩＴＳ序列也被用于应用于鉴定工作中（图１）。
１．１２６ＳｒＤＮＡ的Ｄ１／Ｄ２序列２６ＳｒＤＮＡ５＇末端有一个长约６００ｂｐ的Ｄ１／Ｄ２序列，根据Ｐｅｔｅｒｃｏｎ［１］对核苷酸序列可变区Ｄ２的多态性分析，发现这一区域在同种间的该区域核苷酸的差异小于１％，而不同种之间的差异通常远远大于这个数据，这一试验结果表明可以利用２６ＳｒＤＮＡ的Ｄ２区域进行引物设计ＮＬ１（５′－ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧ－３′）和ＮＬ４（５′－ＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧ－３′）扩增２６ＳｒＤＮＡＤ２区基因片段，根据同源性序列来对待测酵母进行分类。
该方法已经作为一种酵母分类和鉴定的方法被人们广泛采用。
通过Ｋｕｒｔｚｍａｎ等［２］在子囊类酵母２６Ｓ大亚基的研究以及Ｆｅｌｌ等［３］对担子酵母和类酵母真菌２６Ｓ大亚基的研究，基于２６Ｓ的Ｄ１／Ｄ２的酵母鉴定数据库初步形成。
目前绝大多数酵母菌种模式菌株的２６ＳｒＤＮＡ大亚基序列已被测定和公布，对于鉴定提供了很大的帮助。
因此，现在广泛采用这种方法进行酵母菌的鉴定［４］。
但是Ｋｕｒｔｚｍａｎ与Ｆｅｌｌ在利用该方法进行鉴定工作中发现，有的亲缘关系很接近的种类仍旧没有办法进行明确的鉴定。
为此，分别引入了ＤＮＡ杂交和ＩＴＳ的方法对鉴定工作中有分歧或不确定的种类进行进一步的确证。
１．２１８ＳｒＤＮＡ基因序列１８ＳｒＤＮＡ作为一种经典的鉴定方式在真菌的鉴定工作中占有重要作用。
用于扩增１８Ｓ片段的ＰＣＲ引物是根据真菌１８Ｓ的保守区域设计。
常用的引物：正向引物：５＇－ＣＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＡ－３＇和反向引物：５＇－ＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴ－３＇。
通过ＰＣＲ对酵母１８ＳｒＤＮＡ片段特异性的扩增并测序，把测序结果进行多态性分析，从而将待测酵母正确的分类［５］。
１．３５．８Ｓ－ＩＴＳＩＴＳ１与ＩＴＳ２属于间隔区，利用ＩＴＳ１和ＩＴＳ２的保守序列设计引物（ＩＴＳ１：５＇－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３＇，ＩＴＳ４：５＇－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３＇），扩增ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２ｒＤＮＡ序列，扩增产物大小在３５０￣１０００ｂｐ不等。
通过扩增产物多态性分析对酵母进行分类。
Ｒｏｓａ在对Ｃａｎｄｉｄａｓｐ．中的各个种的确定中也也发现了这个缺陷，在将ＰＣＲ扩增产物比对时发现２６ＳｒＤＮＡＤ１／Ｄ２序列的特异性没有５．８Ｓ－ＩＴＳ的效果好。
１．４ＩＧＳｒＤＮＡ基因序列ＩＧＳｒＤＮＡ处于转录间隔区，由于该区段选择压力相对较小，在进化过程中存在着比表达序列更为丰富的变异。
序列差异较好地反映了种属间的系统发育关系。
根据ＩＧＳｒＤＮＡ的保守区域设计引物：（２６ＳＦ：５＇－ＡＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＴＧＡ－３＇，５ＳＲ：５＇－ＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＡＴＣＧＧ－３＇），５７℃退火进行扩增，得到大小各异的ＩＧＳ１片段，根据片段的同源性对酵母进行分类。
利用ＩＧＳ１来鉴定遗传距离近得菌株能够更加有效的将其快速便捷的分类，其种间分辨能力远大于ＩＴＳ鉴定。
目前，这一方法的应用仍旧相对较少，在对同源性非常接近的种属研究中，这一方法有很大的研究前景［６］。
核糖体ＤＮＡ多态性分析越来越广泛的应用于各种微生物的鉴定工作中。
其中，研究最为广泛的是２６ＳｒＤＮＡ大亚基。
通过Ｋｕｒｔｚｍａｎ和Ｆｅｌｌ的努力，将子囊菌和担子菌中的大部分酵母的２６ＳＤ１／Ｄ２序列测定出来进一步的确证，并在相应数据库中公布了相关的数据资料，够迅速有效的对未知的酵母进行快捷的分类鉴定。
但是２６ＳｒＤＮＡＤ１／Ｄ２序列的研究的精确性却不如５．８Ｓ－ＩＴＳ、ＩＧＳ方法。
由于ＩＧＳ是处于转录间隔区，其遗传的稳定性相对较弱，从而使其在种与种之间的特异性增强，以达到快速准确鉴定的目的。
现在对于ＩＴＳ和ＩＧＳ的信息有待进一步的完善。
２ＤＮＡ指纹图谱鉴定法２．１ＩＴＳ／ＲＦＬＰ只利用５．８Ｓ－ＩＴＳ扩增结果对于酵母进行鉴定，图１真核生物中编码核糖体的序列（５＇－３＇）唐玲等：酵母的分子生物学鉴定８５生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００８年第５期需要了解这段序列的一级结构。
如果用ＣｆｏＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨａｅＩＩＩ限制性内切酶酶切，通常经过３种内切酶酶切后的ＤＮＡ片段大小显示出来的电泳结果的多态性就可以将不同种属的酵母进行归类。
Ｅｓｔｅｖｅ－Ｚａｒｚｏｓｏ［７］利用这种方法对包括子囊菌类酵母和担子菌类酵母的２５个属中的１３２株菌种成功的进行了鉴定，并提供了一个初级的酵母ＩＴＳ／ＲＦＬＰ数据库。
除Ｃｒ．ａｌｂｉｄｕｓ和Ｋ．ｌａｃｔｉｓ等少数种类以外，大多数的酵母都可以利用这个方法进行鉴定。
但是有的种需要用特殊的限制性内切酶进行切割协助鉴定工作。
Ｒｏｓａ［８］采用这个方法将Ｃａｎｄｉｄａ的１６３个种进行了分类鉴定，初步获得了ＩＴＳ／ＲＦＬＰ在酵母分类鉴定的应用的数据库。
这种方法对于研究自然发酵过程中酵母的有性无性世代及过程中的优势种的研究有很重要的作用。
现在这一方法已经广泛的用于酵母的鉴定及其他的真菌的鉴定工作中，并获得了较好的效果。
但是由于已公布的５．８Ｓ／ＲＦＬＰ的序列信息相对还比较少，尽管限制性图谱可以反映各种属的特异性，但对于单个的酵母细胞的快速鉴定还有一些困难。
而且凡是可以引起酶切位点变异的突变均可导致ＲＦＬＰ的产生，从而影响图谱的特异性，进而影响鉴定的结果。
２．２ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）技术利用约１０个碱基随机组成的片段作为引物对基因组的ＤＮＡ或者直接用单菌落进行ＰＣＲ扩增，根据基因组ＤＮＡ的多态性来检测菌株间基因组ＤＮＡ内核苷酸序列存在的微小变异。