限制性内切酶

4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而
在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶
降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作
用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶
。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
用 20 单位（Units）限制酶切割 1g 标记的寡核苷酸做测试时，发现 不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求（表 2-3）。相对来说， EcoRⅠ 对两端的序列长度要求较小，在识别序列外侧有一个碱基对时在 2 小时的切割活性可达 90% 。而 AccⅠ 和 HindⅢ 对两端的序列长度要 求较大。
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定义和命名
• DNA限制性内切酶： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列 的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切 断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之 失去活力，但对自己的DNA却无损害作用， 这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种 切割作用是在DNA分子内部进行的，故有专一性，是随机的。如 EcoK 和 EcoB
。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于
酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR、
hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK 编码基
因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。
SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部 分字母代表的碱基如下。
R=A 或 G
Y=C 或 T
M=A 或 C
K=G 或 T
S=C 或 G
W=A 或 T
H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G
•
D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
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时选择酶切秩序。
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• 表2-3：靠近DNA片段末端的切割效率%（用 寡核苷酸检测）
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影响酶活性的因素
•
• 影响酶切活性的因素有许多，概略的说可分为 外因和内因。外因是可预见和控制的，如反应 条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚 的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体 积的选择以及反应时间的长短等等。内因包括 位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象 的影响主要指切割线性 DNA 和超螺旋 DNA 时的活性，如与切割 λDNA 相比， EcoRⅠ 、PstⅠ、SalⅠ 需要至少 2.5-10 倍的酶来切 割 pBR322 2020/4/27 的超螺旋 DNA 。 PaeRTⅠ 与
Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似的 辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切 割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。
Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反 方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互 补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分 别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。
•
用 DNA 片段（线性载体）检测末端长度对切割的影响时，同样发现
识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响，不同的酶对末端长度的要
求是不同。
在设计 PCR 引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺
利切割扩增的 PCR 产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基
数目。另外，了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点
系统中的种类。
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限制酶识别的序列
• 1．限制酶识别序列的长度 限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表
2-2）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机 的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（ 4^4=256，4^6=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置 。
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• 2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制
与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。 Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ型
酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切 割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在 才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或 更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列 ，切割位置因酶而异，有些是隔开的。
•
4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC
5 个碱基识别位点：EcoRⅡ ↓CCWGG；NciⅠ CC↓SGG
6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC；
•
HindⅢ A↓AGCTT
7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC；
•
PpuMⅠ RG↓GWCCY
8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC
EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表
示任意碱基。
•
TGA*（N）8TGCT
EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点
。
AA°C（N）6GTGC
但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外，且
无特异性。
Ⅲ 型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ，
在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的 一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme）， 如 N.Bst NBI 。
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•
Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，能识别
专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的
• 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属 名2020/的4/27 第一个字母和种名的前两个字母组成，第
特征和种类
•
1．限制与修饰现象
•
早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄
主控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现象
便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（
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DNA末端长度对限制酶切割的影响
• 限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就
是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥 切割活性。
表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。
•
E.coli 菌株 λ噬菌体感染率
•
lK lB lC
•
E.coli K 1 10-4 10-4
•
E.coli B 10-4 1 10-4
•
E.coli C 1 1 1
•
说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 10-
也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个
核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的，如
EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切
割位点则在下游 24-26bp 处。
在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 Ⅱ 型
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