常用限制性内切酶酶切位点保护残基
分子生物学实验常用工具酶总结
现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。
（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R IH Ham H IBacillus amyloliquefaciensHaemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。
若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。
酶切位点保护碱基表
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，Eco RI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，Pa cI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260位的寡核苷酸。
酶切位点保护碱基表
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A2单位的寡核苷酸。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
常用限制性内切酶酶切位点汇总情况
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常用限制性内切酶酶切位点总结
常用限制性内切酶酶切位点总结————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点BbvCI识别位点BbvI识别位点BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点BsiEI识别位点BsiHKAI识别位点BsiWI识别位点BslI识别位点BsmAI识别位点BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点BstXI识别位点BstYI识别位点BstZ17I识别位点Bsu36I识别位点BtgI识别位点BtgZI识别位点BtsCI识别位点BtsI识别位点Cac8I识别位点ClaI识别位点CspCI识别位点CviAII识别位点CviKI-1识别位点CviQI识别位点DdeI识别位点DpnI识别位点DpnII识别位点DraI识别位点DraIII识别位点DrdI识别位点EaeI识别位点EaeI识别位点EagI识别位点EarI识别位点EciI识别位点EcoNI识别位点EcoO109I识别位点EcoP15I识别位点EcoRI识别位点EcoRV识别位点FatI识别位点FauI识别位点Fnu4HI识别位点FokI识别位点FseI识别位点FspI识别位点HaeII识别位点HaeIIIHgaI识别位点HhaI识别位点HincII识别位点HindIII识别位点HinfI识别位点HinP1I识别位点HpaI识别位点HpaII识别位点HphI识别位点Hpy188I识别位点Hpy188III识别位点Hpy99I识别位点HpyAV识别位点HpyCH4III识别位点HpyCH4IV HpyCH4V识别位点KasI识别位点KpnI识别位点MboI识别位点MboII识别位点MfeI识别位点MluI识别位点MlyI识别位点MmeI识别位点MnlI识别位点MscI识别位点MseI识别位点MslI识别位点MspA1I识别位点MspI识别位点MwoI识别位点NaeI识别位点NarI识别位点NciI识别位点NdeI识别位点NgoMIV识别位点NheI识别位点NlaIII识别位点NlaIV识别位点NmeAIII识别位点NotI识别位点NruI识别位点NsiI识别位点NspI识别位点PacI识别位点PaeR7I识别位点PciI识别位点PflFI识别位点PflMI识别位点PhoI识别位点PleI识别位点PmeI识别位点PmlI识别位点PpuMI识别位点PshAI识别位点PsiI识别位点PspGI识别位点PspOMI识别位点PspXI识别位点PstI识别位点PvuI识别位点PvuII识别位点RsrII识别位点SacI识别位点SacII识别位点SalI识别位点SapI识别位点Sau3AI识别位点Sau96I识别位点SbfI识别位点ScaI识别位点ScrFI识别位点SexAI识别位点SfaNI识别位点SfcI识别位点SfiI识别位点SfoI识别位点SgrAI识别位点SmaI识别位点SmlI识别位点SnaBI识别位点SpeI识别位点SphI识别位点SspI识别位点StuI识别位点StyD4I识别位点StyI识别位点SwaI识别位点TaqαI识别位点TfiI识别位点TseI识别位点Tsp45I识别位点Tsp509I识别位点TspMI识别位点TspRI识别位点Tth111I识别位点XbaI识别位点XcmI识别位点XhoI识别位点XmaI识别位点XmnI识别位点ZraI识别位点。
限制性内切酶酶切位点汇总
Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点BbvCI识别位点BbvI识别位点BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点BsiEI识别位点BsiHKAI识别位点BsiWI识别位点BslI识别位点BsmAI识别位点BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点BstXI识别位点BstYI识别位点BstZ17I识别位点Bsu36I识别位点BtgI识别位点BtgZI识别位点BtsCI识别位点BtsI识别位点Cac8I识别位点ClaI识别位点CspCI识别位点CviAII识别位点CviKI-1识别位点CviQI识别位点DdeI识别位点DpnI识别位点DpnII识别位点DraI识别位点DraIII识别位点DrdI识别位点EaeI识别位点EaeI识别位点EagI识别位点EarI识别位点EciI识别位点EcoNI识别位点EcoO109I识别位点EcoP15I识别位点EcoRI识别位点EcoRV识别位点FatI识别位点FauI识别位点Fnu4HI识别位点FokI识别位点FseI识别位点FspI识别位点HaeII识别位点HaeIIIHgaI识别位点HhaI识别位点HincII识别位点HindIII识别位点HinfI识别位点HinP1I识别位点HpaI识别位点HpaII识别位点HphI识别位点Hpy188I识别位点Hpy188III识别位点Hpy99I识别位点HpyAV识别位点HpyCH4III识别位点HpyCH4IV HpyCH4V识别位点KasI识别位点KpnI识别位点MboI识别位点MboII识别位点MfeI识别位点MluI识别位点MlyI识别位点MmeI识别位点MnlI识别位点MscI识别位点MseI识别位点MslI识别位点MspA1I识别位点MspI识别位点MwoI识别位点NaeI识别位点NarI识别位点NciI识别位点NdeI识别位点NgoMIV识别位点NheI识别位点NlaIII识别位点NlaIV识别位点NmeAIII识别位点NotI识别位点NruI识别位点NsiI识别位点NspI识别位点PacI识别位点PaeR7I识别位点PciI识别位点PflFI识别位点PflMI识别位点PhoI识别位点PleI识别位点PmeI识别位点PmlI识别位点PpuMI识别位点PshAI识别位点PsiI识别位点PspGI识别位点PspOMI识别位点PspXI识别位点PstI识别位点PvuI识别位点PvuII识别位点RsrII识别位点SacI识别位点SacII识别位点SalI识别位点SapI识别位点Sau3AI识别位点Sau96I识别位点SbfI识别位点ScaI识别位点ScrFI识别位点SexAI识别位点SfaNI识别位点SfcI识别位点SfiI识别位点SfoI识别位点SgrAI识别位点SmaI识别位点SmlI识别位点SnaBI识别位点SpeI识别位点SphI识别位点SspI识别位点StuI识别位点StyD4I识别位点StyI识别位点SwaI识别位点TaqαI识别位点TfiI识别位点TseI识别位点Tsp45I识别位点Tsp509I识别位点TspMI识别位点TspRI识别位点Tth111I识别位点XbaI识别位点XcmI识别位点XhoI识别位点XmaI识别位点XmnI识别位点ZraI识别位点与大家共享（非原创）。
限制性内切酶酶切位点保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A
260
核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别
, 反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl
2
5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
酶切位点保护碱基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，E coRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，N siI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，S peI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A2 60单位的寡核苷酸。
限制性内切酶酶切的常见问题及解决...
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法（The common problems and solutions of restriction endonuclease digestion）The common problems and solutions of restriction endonuclease digestionRestriction enzyme digestion of the common problems and solutions, personally feel very well summed up, specially posted for you to share.Enzyme digestion problems, see enzyme instructions, the corresponding reagent company directory. The enzymes produced by different companies, the source of strains, the preparation process, purity, viability and enzymatic activity may be optimized differently,.Can be found in the above definition, unit of enzyme preservation conditions, enzyme system of [buffer and other enzymes such as buffer, double cut enzyme reaction temperature [some enzymes in 50, 55 or 30 temperature reaction, whether methylation affects the enzyme activity and whether there is an asterisk, asterisk may appear live factors and protective base, isocaudarner, isoschizomer1. enzymes can not be cut or incompleteThe 1.1 plasmid is the most common or poorly expressed inhibitor. The presence of miscellaneous proteins can affect enzyme digestion, showing A260/A280 below 1.8; inhibitors are common in phenols, salts, and ethanol; [re DNA, using reliable kits or reliable manual extraction reagents,1.2 enzyme problems: make sure the enzyme is effective [although many enzymes have expired time, but expired as long as the enzyme can be effectively cut, available. Make sure the enzyme is not effective. Mark it and replace it.[note] topic: by endonucleaseA. endonuclease, if no special requirement, keep -20~-30 degrees. Is not as low as possible, the enzyme is usually preserved in 50% glycerol buffer, when the temperature is too low, will freeze (enzyme transport process exception, because the enzyme requires low temperature transport, so the convenient situation is the use of dry ice, the enzyme will freeze, but the freezing times is limited, is a relatively better choice), if is often used, the enzyme will be repeated freezing and thawing, thereby reducing the activity. Of course, if the temperature is too high, ha ha, you want to go.B. enzyme should be used in ice box for enzyme extraction. It's clear to everyone, but it's no harm putting too much emphasis on it. Some of the students because the lab is put out, the enzyme in the ice box, but there are two ignored: when taking the enzyme, the hand does not hold the upper end of the pipe, and the grip at the bottom, equivalent to hand in to the enzyme by heating; some enzymes are placed in the ice box, but the absorption of the enzyme when will the enzyme take out. Once or twice a day, it can affect enzyme activity.C. enzyme should be tightened as soon as possible after the lid. Sometimes we can find that even if -20~-30 degrees are placed,the enzyme will freeze. That is because of personal reasons may be cut in the configuration when the enzyme reaction, enzyme tube lid open for a long time, glycerol will absorb moisture in the air, for large packaging commonly used enzyme sometimes arise freezing phenomenon. In addition, sometimes, because of careless operation, some of the broken ice congealed on the ice box fell into the enzyme tubes. (I appeared two times myself. SweatD. uptake of enzymes by tips. We used to take the enzyme tips is the smallest of the kind, suitable for 2ul and 10ul guns, but tips usually has two kinds, one is the most commonly used short tips, with it next to the enzyme, tips enzyme, the gun is almost to be inserted into the pipe, sometimes stained with enzyme in the gun body. Therefore, it may cause pollution. Then, we need to pay great attention to the action, or change to another long tips, specially for the enzyme solution.1.3 buffer problem. Some enzymes cut buffer, adding a number of easier to precipitate or dissolved components [ligase buffer is more like this], and sometimes when the enzyme buffer is not completely melted, the concentration of buffer is heterogeneous. The new buffer melts first, and the salt ion concentration is high. After a period of time, the concentration of the ions in the melt decreases. Normally, this has little effect, but problems arise if you use some enzymes that are sensitive to the concentration of ions.1.4 double enzyme buffer selection: make sure the correct buffer and reaction temperature are used [refer specifically to the enzyme buffer cut from the manufacturer and double enzymecut buffer, where NEB is availableHttp://www.neb-china.COM / CN /技术/重/ double_digests.htm1.5酶切位点的甲基化影响：有时甲基化会影响酶切，常见的有Xba I、Bcl I等。
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酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶
发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次
本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，
为什么要添加保护碱基？
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
5‘端，就
（红的5’端加上
（黑，相同如果
3‘端加保
就在酶3’端加上相．切割率：正。
加保护碱基。