吸光光度法分析条件的选择
吸光光度分析中选择测定波长的原则
吸光光度分析中选择测定波长的原则
在分光光度分析中选择测定波长，是分光光度法成功实施的关键。
测试波长的选择取决于待测物质和测试干扰物质之间的特异性和敏感性，以及待测物质吸收率随波长的变化情况。
一般来说，选择测定波长时应考虑以下原则：
第一，检测波长的敏感性高是最好的，应尽量选择植物的特征吸
收特性最强的波长。
第二，波长的选取应对物质的吸收普遍性更强，选择的范围更宽，尽可能多选择植物的多种分子与同一波长的特殊表面吸收关系。
第三，波长应尽量避开干扰物质在该波长上的吸收特征，尽可能
选择该波长不受物质吸收影响最小的波长。
第四，综合考虑植物有效成分吸收特性，在待测物质与干扰物质
之间找到足够能分辨的波长，估算试验所需要的波长，同时，选择的测
定波长应能充分体现物质的吸收特性。
总之，选择测定波长的原则主要有：选择植物吸收特性最强的波长，选择物质普遍性强的波长，避开物质吸收影响的波长，以及能够综
合考虑植物有效成分吸收特性的选择波长，等等。
只有结合上述所有原则，才能选出最合适的测定波长，才有利于成功操作。
吸光光度法显色反应及显色条件的选择
吸光光度法 / 显色反应及显色条件的选择
• 干扰的消除 • 共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物， 都将干扰测定。 • 消除共存离子的干扰的方法： • 加人配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子生成无色 配合物或无色离子。
吸光光度法 / 显色反应及显色条件的选择
• 选择适当的显色条件以避免干扰 • 利用酸效应，控制显色剂离解平衡，降低[ R ] ，使干扰 离子不与显色剂作用
• 此类化合物在一定的条件下就能与某些金属离子作用，改 变生色团的电子云结构，使颜色发生明显的变化。
吸光光度法 / 显色剂
• • • • • • 偶氮类显色剂特点 性质稳定 显色反应灵敏度高 选择性好 对比度大 是目前应用最广泛的一类显色剂。其中以偶氮胂III 等最为 突出。偶氮胂III的结构式为
吸光光度法 / 吸光光度法的应用
• 吸收光谱重叠 • 找出两个波长，在该波长下，二组分的吸光度差值 △ A 较大
吸光光度法 / 吸光光度法的应用
• 在波长为λ1和λ2时测定吸光度 A1和 A 2 ，由吸光度值的 加和性得联立方程：
吸光光度法 / 吸光光度法的应用
吸光光度法 / 吸光光度法的应用
吸光光度法 / /显色反应及显色条件的选择 •进行光度分析时，首先要把待测组分转变成有色化合物， 然后测定吸光度或吸收曲线 •将待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应 •与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂
吸光光度法 / 显色反应及显色条件的选择 显色反应的分类 •配位反应----最主要的显色反应 •氧化还原反应 显色反应的选择 •灵敏度高 摩尔吸收系数 K 的大小是显色反应灵敏度高低的重要标志 应当选择生成的有色物质的‘较大的显色反应
吸光光度法 / 显色剂
吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
简述吸光光度法测量条件
简述吸光光度法测量条件光度分析中，为使测得的吸光度有较高的灵敏度和准确度，还必须选择合适的测量条件。
1. 入射光波长的选择一般以λmax作为入射光波长。
如有干扰，则根据干扰最小而吸光度尽可能大的原则选择入射光波长。
2. 参比溶液的选择参比溶液主要是用来消除由于吸收皿壁及试剂或溶剂等对入射光的反射和吸收带来的误差。
应视具体情况，分别选用纯溶剂空白、试剂空白、试液空白作参比溶液。
3. 吸光度读数范围的选择吸光光度分析所用的仪器为分光光度计，测量误差不仅与仪器质量有关，还与被测溶液的吸光度大小有关。
由下式可计算在不同吸光度或透光度读数范围引起的浓度的相对误差。
若分光光度计的读数误差DT 为5%, 当T = 65-20%，（或 A =0.19-0.70），则测量误差。
通常应控制溶液吸光度A在0.2-0.7之间，此范围是最适读数范围。
通过调节溶液的浓度或比色皿的厚度可以将吸光度调节到最适范围内。
当T%=36.8或A=0.434时，由于读数误差引起的浓度测量相对误差最小。
在吸光度法中，影响显色反应的主要因素有哪些？⒈确定适宜的条件的原因：在可见光分光光度法的测定中，通常是将被测物与显色剂反应，使之生成有色物质，然后测其吸光度，进而求得被测物质的含量。
因此，显色条件的完全程度和吸光度的测量条件都会影响到测量结果的准确性。
为了使测定有较高的灵敏度和准确性，必须选择适宜的显色反应条件和仪器测量条件。
通常所研究的显色反应条件有显色温度和时间，显色剂用量，显色液酸度，干扰物质的影响因素及消除等，但主要是测量波长和参比溶液的选择。
对显色剂用量和测量波长的选择是该实验的内容。
⒉如何确定适宜的条件：条件试验的一般步骤为改变其中一个因素，暂时固定其他因素，显色后测量相应溶液吸光度，通过吸光度与变化因素的曲线来确定适宜的条件⒈确定适宜的条件的原因：在可见光分光光度法的测定中，通常是将被测物与显色剂反应，使之生成有色物质，然后测其吸光度，进而求得被测物质的含量。
第9章 吸光光度法(2)
M + nR = MRn OHH+
(1) 影响显色剂的平衡浓度和颜色→不能过高；
(2) 影响被测金属离子的存在状态→不能过低； (3) 影响有色化合物的组成。
例：磺基水杨酸 – Fe 3+ pH = 2 ~ 3 pH = 4 ~ 7 pH = 8 ~ 10 FeR FeR2 FeR3 紫红色 橙色 黄色
四、标准曲线的绘制
由 A=abc 或 A=εbc 可知： 吸光度A与物质的浓度成正比，以A对c作图，应得一直线， 该直线称为工作曲线.( Standard curve） 在相同条件下测的试液的吸光度， 从工作曲线上就可查到试液的浓 度, 该方法称为工作曲线法。 注意什么？
a. 标准溶液浓度必须在线性范围内，即符合A= bc
2.有机显色剂 有机显色剂分子中含有某些含不饱和键的基 团如偶氮基、对醌基和羰基等生色团（ chromophoric group）和含孤对电子的基团如氨 基 、 羟 基 和 卤 代 基 等 助 色 团 （ auxochrome group）。
生色团：－N＝N－，－N＝O，
O O
C=S,－N
：
（共轭双键）πe
二、参比溶液的选择 为什么要使用参比溶液？ 目的：扣除非待测组分（吸收池和各种试剂）对光的吸收， 使测得的的吸光度真正反映待测物对光的吸收。 测定时，采用两个材质、厚度相同的比色皿进行测量，其中 一个作为参比池，装入参比溶液，调节仪器使透过参比池的吸光 度为零。则测得待测溶液的吸光度为：
A=lgI0/I=lgI参比/I试液
Co2+ Fe2+,Sn4+
c. 利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态 d. 用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。 e. 选择适当的波长 f. 当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加 显色剂的用量来消除干扰。 g. 采用预先分离的方法。
【分析】第八篇吸光光度法
【关键字】分析第八章吸光光度法基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法。
包括比色法、看来及紫外分光光度法等。
本章主要讨论看来光区的吸光光度法。
利用看来光进行分光光度法分析时，通常将被测组分通过化学反应转变成有色化合物，然后进行吸光度的测量。
例如：测量钢样中Mn的含量，在酸性溶液中将Mn 氧化为MnO4-，然后进行吸光度的测量。
与化学分析法比较它具有如下特点：（一）灵敏度高分光光度法常用于测定试样中1－0.001%的微量组分。
对固体试样一般可测至10-4%。
（二）分析微量组分的准确度高例如：含铁量为0.001%的试样，如果用滴定法测定，称量试样，仅含铁0.01mg，无法用滴定分析法测定。
如果用显色剂1，10-邻二氮杂菲与铁生成橙红色的1，10-邻二氮杂菲亚铁配合物就可用吸光光度法来测定。
Fe2+ + 3(1,10-phen) → [ Fe(1,10-phen)3] 2+（三）操作简便，测定快速（四）应用广泛几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可直接或间接地用分光光度法测定。
可用来研究化学反应的机理、溶液中配合物的组成、测定一些酸碱的离解常数等。
§8-1 吸光光度法基本原理一、物质对光的选择吸收当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生了反射、散射、吸收或透射（p241, 图9-1）。
若被照射的是均匀的溶液，则光在溶液中的散射损失可以忽略。
当一束由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色的光复合而成的白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过。
当透射光波长在400-700nm范围时，人眼可觉察到颜色的存在，这部分光被称为看来光。
透射光和吸收光呈互补色，即物质呈现的颜色是与其吸收光呈互补色的透射光的颜色。
例如：CuSO4溶液由于吸收了580-600 nm的黄色光，呈现的是与黄色呈互补色的蓝色。
不同波长的光具有不同的颜色，见P294,表9-1。
物质吸收了光子的能量由基态跃迁到较高能态（激发态），这个过程叫做物质对光的吸收。
第九章 吸光光度法
发生相互作用。 假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。 当溶液浓度c >10 －2 mol/L 时，吸光质点间可能发 生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的 形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化 ，影响吸光度。
度的乘积成正比。 朗伯——比耳定律不仅适用于有色溶液，也适 用于其它均匀、非散射的吸光物质(包括液体、气 体和固体)，是各类吸光光度法的定量依据。
A bc
式中，A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol· －１； L
无线电波 11000m
光谱名称 波长范围 X射线 0.1—10nm 远紫外光 10—200nm
跃迁类型
辐射源
分ห้องสมุดไป่ตู้方法 X射线光谱法
真空紫外光 度法
K和L层电子 X射线管 中层电子 氢灯 氢灯 钨灯
碳化硅热棒
近紫外光 200—400nm 价电子 可见光 400—750nm 价电子
近红外光 0.75—2.5μ m 分子振动 中红外光 2.5— 分子振动 5.0μ m
A总 lg(I01 I02 ) /(I01 10
1bc
I02 10
2bc
)
讨论: A总 lg(I0 I0 ) /(I0 10
1 2 1
1bc
I02 10
2bc
)
(1) 1= 2 = 则： A总 ＝lg（Ｉo/Ｉt）＝ bc
(2) 若 2≠ 1 ；A与C则不成直线关系。 2与 1
I0 A lg I t A Kbc
吸光光度法
显示装置
6.2
光度分析法的设计
1 显色反应（color reaction）
待测物质本身有较深的颜色，直接测 定；待测物质是无色或很浅的颜色，需 要选适当的试剂与被测离子反应生成有 色化合物再进行测定，此反应称为显色 反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent）。
6.2
光度分析法的设计
苯 (254nm) A 甲苯 (262nm)
230
250
270
苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱
6.1 概述
在可见光，KMnO4溶液 对波长525 nm附近绿色光 的吸收最强，而对紫色和 红色的吸收很弱。λmax= 525 nm。浓度不同时， 光吸收曲线形状相同， λmax不变，吸光度不同。
光吸收程度最大处的波 长，称为最大吸收波长， 常用λ最大或λmax表示， 任何可见光区内、溶液 的颜色主要是由这个数值决定的。
6.1 概述
溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm
吸收光
颜色
400-450 450-480
480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
紫 蓝
绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
黄绿 黄
橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
6.1 概述
其实，任何一种溶液．对不同波长的光的吸收
程度是不相等的。如果将某种波长的单色光依 次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各 种单色光的吸收程度，以波长为纵坐标，以吸 光度为纵坐标可以得到一条曲线，叫做吸收光 谱曲线或光吸收曲线。它清楚地描述了溶液对 不同波长的光的吸收情况。
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z 大部分高价金属离子都容易水解，当溶液的酸度 降低时，会产生一系列羟基络离子或多核羟基络离 子。高价金属离子的水解象多元弱酸的电离一样，是 分级进行的。
z 随着水解的进行，同时还发生各种类型的聚合反 应。聚合度随着时间增大，而最终将导致沉淀的生 成。显然，金属离子的水解，对于显色反应的进行是 不利的，故溶液的酸度不能太低。
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
z 在有机化合物分子中，凡是包含有共轭双键的 基团如—N＝N—、—N＝O、—NO2、对醌基、＝C＝ O(羰基)、＝C＝S(硫羰基)等，一般都具有颜色， 原因是这些基团中的л电子被光激发时，只需要较 小的能量，能吸收波长大于200nm的光，因此，称 这些基团为生色团；某些含有未共用电子对的基团 如胺基—NH2，RHN—，R2N—(具有一对未共用电子 对)，羟基-OH(具有两对末共用电子对)，以及卤代 基—F，—Cl，—Br，—I等，它们与生色基团上的不
z(2)有机显色剂
z 许多有机试剂，在一定条件下，能与金属离子 生成有色的金属螯合物(具有环状结构的络合物)。
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
将金属螯合物应用于光度分析中的优点是：
1．大部分金属螯合物都呈现鲜明的颜色，摩 尔吸光系数大于104，因而测定的灵敏度很高；
2．金属螯合物都很稳定，一般离解常数都很 小，而且能抗辐射；
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
z选择显色反应的一般标准 :
z(1) 选择性要好。一种显色剂最好只与一种被测组 分起显色反应，这样干扰就少。或者干扰离子容易 被消除、或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的 有色化合物的吸收峰相隔较远。 z (2)灵敏度要高。由于吸光光度法一般是测定微量 组分的，灵敏度高的显色反应有利于微量组分酌测 定。灵敏度的高低可从摩尔吸光系数值的大小来判 断，κ值大灵敏度高，否则灵敏度低。但应注意， 灵敏度高的显色反应，并不一定选择性就好，对于 高含量的组分不一定要选用灵敏度高的显色反应。 z(3)对比度要大。即如果显色剂有颜色，则有色化合 物与显色剂的最大吸收波长的差别要大，一般要求 在60nm以上。
z
(被测组分) (显色剂) (有色化合物)
z 反应在一定程度上是可逆的。为了减少反应的可
逆性，根据同离子效应，加入过量的显色剂是必要
的，但也不能过量太多，否则会引起副反应，对测定
反而不利。
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
z2.溶液的酸度
z 溶液酸度对显色反应的影响很大，这是由于溶液 的酸度直接影响着金属离子和显色剂的存在形式以及 有色络合物的组成和稳定性。因此，控制溶液适宜的 酸度，是保证光度分析获得良好结果的重要条件之 一。
饱和键互相作用，引起永久性的电荷移动，从而减 小了分子的活化能促使试剂对光的最大吸收“红移”
(向长波方向移动)，使试剂颜色加深，这些基团称 为助色团。
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
z 含有生色基团的有机化合物常常能与许多全 属离子化合生成性质稳定且具有特征颜色的化合 物，且灵敏度和选择性都很高，这就为用光度法 测定这些离子提供了很好的条件。 z 有机显色剂的种类很多，下面仅将应用较广 泛的几种介绍如下： z 1.邻二氮菲 z 2.双硫腙 z 3. 二甲酚橙 z 4. 偶氮胂III z 5．铬天青S
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
z（二）显色反应条件的选择
z 显色反应能否完全满足光度法的要求，除了与显 色剂的性质有主要关系外，控制好显色反应的条件也 是十分重要的，如果显色条件不合适，将会影响分析 结果的准确度。
z1.显色剂的用量
z 显色就是将被测组分转变成有色化合物，表示：
z
M + R = MR
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
z第四节 吸光光度法分析条件的选择
z一、显色反应及其条件的选择
z（一）显色反应和显色剂
z 1.显色反应
z 在分光光度分析中，将试样中被测组分转变成 有色化合物的反应叫显色反应。显色反应可分两大 类，即络合反应和氧化还原反应，而络合反应是最主 要的显色反应。与被测组分化合成有色物质的试剂称 为显色剂。同一组分常可与若干种显色剂反应，生成 若干有色化合物，其原理和灵敏度亦有差别。一种被 测组分究竞应该用哪种显色反应，可根据所需标准加 以选择。
3．专用性强，绝大多数有机整合剂，在一定 条件下，只与少数或其一种金属离子络合，而且同 一种有机螯合剂与不同的金属离子络合时，生成具 有特征颜色的螯合物
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
4．虽然大部分金属螯合物难溶于水， 但可被萃取到有机溶剂中，大大发展了萃取 光度法。
5．在显色分子中，金属所占的比率很 低，提高了测定的灵敏度。因此，有机显色 剂是光度分析中应用最多最广的显色剂，寻 找高选择性、高灵敏度的有机显色剂，是光 度分析发展和研究的重要内容。
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
z (4)有色化合物的组成要恒定,化学性质要稳 定。有色化合物的组成若不确定，测定的再 现性就较差。有色化合物若易受空气的氧 化、日光的照射而分解，就会引入测量误 差。 z (5)显色反应的条件要易于控制。如果条件 要求过于严格，难以控制，测定结果的再现 性就差。
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
z2.显色剂
z(1)无机显色剂
z 许多无机试剂能与金属离子起显色反应，如Cu2+ 与氨水形成深蓝色的络离子Cu(NH4)42+，SCN-与Fe3+ 形成红色的络合物Fe(SCN)2+或Fe(SCN)63-等。但是多 数无机显色剂的灵敏度和选择性都不高，其中性能较 好，目前还有实用价值的有硫氰酸盐、钼酸铵、氨水 和过氧化氢等。
第31讲
第十章 吸光光度法
第2讲
z (2) 酸度对显色剂浓度和颜色的影响
z 光度分析中所用的大部分显色剂都是有
Байду номын сангаас
机弱酸。显色反应进行时，首先是有机弱酸
发生离解，其次才是络阴离子与金属离子络
合。
z
M + HR＝MR + H+
z 从反应式可以看出，溶液的酸度影响着
显色剂的离解,并影响着显色反应的完全程
度。当然，溶液酸度对显色剂离解程度影响 的大小，也与显色剂的离解常数有关，Ka 大时，允许的酸度可大；Ka很小时，允许 的酸度就要小些。