干扰素制备的工艺流程29页PPT
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基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物的应用领域
肿瘤治疗
基因工程药物在肿瘤治疗 中发挥了重要作用，如干 扰素、白细胞介素等免疫 调节，基因工 程药物提供了有效的治疗 手段，如囊性纤维化、血 友病等。
抗病毒治疗
针对某些病毒性疾病，基 因工程药物可以起到抗病 毒和免疫调节的作用，如 艾滋病、肝炎等。
干扰素的临床应用与疗效
干扰素在临床上主要用于治疗病 毒性感染、肿瘤以及一些自身免
疫性疾病。
通过注射或雾化吸入给药，干扰 素可有效抑制病毒复制，缓解疾 病症状，提高患者生存率和生活
质量。
然而，干扰素也存在一些副作用 ，如发热、肌肉酸痛、肝肾功能 异常等，需要在医生的指导下合
理使用。
03
基因工程制备干扰素的流程
目的基因的表达
在培养条件下，目的基因在细胞内表达，产生相应的蛋白质或核酸产物。
干扰素的分离纯化
分离方法
采用离心、过滤、萃取等方法，将目 的产物从细胞培养液中分离出来。
纯化方法
通过凝胶电泳、色谱技术（如离子交 换、亲和、排阻等）、超滤等方法， 将目的产物进行纯化。
04
干扰素的质量控制与安全性评 价
。
免疫学评价
检测干扰素对机体免疫系统的影响 ，如免疫原性、抗体产生情况等， 以评估其免疫安全性。
不良反应监测
对临床使用过程中出现的不良反应 进行监测和记录，及时处理并分析 原因，确保患者用药安全。
干扰素的稳定性研究
温度稳定性
研究干扰素在不同温度下的稳定性， 确定其保存、运输和使用的适宜温度 范围。
极具挑战性。
生产成本高
基因工程药物的生产通常需要昂 贵的设备和精细的工艺控制，这 导致了干扰素的生产成本居高不
下。
干扰素制备的工艺流程
α干扰素又依其结构分为 α1b、α2a、α2b等亚型
其区别在于个别氨基酸 的差异上，早期干扰素是用 病毒诱导人白血球产生的， 产量低、价格昂贵，不能满 足需要，现在可利用基因工 程技术并在大肠杆菌中发酵、 表达来进行生产。
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
❖ ７）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。 如于4℃离心，盐也会了生沉淀。
❖ ８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽， 于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置 相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放 在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
扰素基因的PCR产物
二、目的基因与克隆载体进行体外重组
❖ 1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因
的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接
EcoR I
BamH I
EcoR I
BamH I
2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后（无义突变也行），导入受体细胞，筛选
❖ ５）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而 使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分 再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中， 弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的 原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分
❖ ６）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充 分混匀，于室温放置10分钟。
❖ (2). 温度控制
假单孢杆菌生长最适温度与产物形成
最适温度是不同的。产物合成温度控制在20℃可以有效防止
干扰素制备的工艺流程
DNA分子。
转化与筛选
将重组DNA分子导入受体细 胞，通过选择性培养基筛选 出含有干扰素基因的阳性克
隆。
表达与鉴定
对阳性克隆进行培养，诱导 干扰素基因的表达，并对表 达产物进行生物学活性鉴定 。
细胞培养技术
1 2 3
细胞株选择
选择适宜的细胞株作为干扰素的生产细胞，确保 其能够在体外培养条件下稳定表达干扰素。
量病毒颗粒。
感染与表达
03
将病毒颗粒感染适宜的宿主细胞，诱导干扰素基因的表达，收
集表达产物。
纯化与精制技术
初步纯化
采用沉淀、过滤等方法去除杂质和悬浮颗粒物，初步纯化干扰素。
进一步纯化
利用各种层析技术（如凝胶过滤、离子交换等）对初步纯化产物进 行进一步纯化，提高干扰素的纯度。
精制与制剂
对高纯度的干扰素进行精制和制剂加工，以满足临床应用的需求。
• 未来发展方向：随着生物技术的不断 发展，干扰素的质量控制将更加严格 和全面。未来发展方向包括建立更加 灵敏和准确的检测方法、提高制备工 艺的效率和纯度、加强生产过程中的 监控和管理等方面，以确保干扰素的 安全性和有效性。
05 干扰素制备的工艺优化
基因重组技术的优化
01
基因重组技术是制备干扰素的 关键技术之一，通过优化重组 技术，可以提高干扰素的产量 和纯度。
干扰素的种类
α干扰素
由白细胞和成纤维细胞产生，主要用于治疗 乙型肝炎和丙型肝炎。
β干扰素
由自然杀伤细胞产生，具有广谱抗病毒活性。
γ干扰素
由T淋巴细胞产生，具有免疫调节活性。
02 干扰素制备前的准备
原材料的准备
细胞培养基
选择适合细胞生长的培养基，确保细胞生长旺盛，产量高。
转化与筛选
将重组DNA分子导入受体细 胞，通过选择性培养基筛选 出含有干扰素基因的阳性克
隆。
表达与鉴定
对阳性克隆进行培养，诱导 干扰素基因的表达，并对表 达产物进行生物学活性鉴定 。
细胞培养技术
1 2 3
细胞株选择
选择适宜的细胞株作为干扰素的生产细胞，确保 其能够在体外培养条件下稳定表达干扰素。
量病毒颗粒。
感染与表达
03
将病毒颗粒感染适宜的宿主细胞，诱导干扰素基因的表达，收
集表达产物。
纯化与精制技术
初步纯化
采用沉淀、过滤等方法去除杂质和悬浮颗粒物，初步纯化干扰素。
进一步纯化
利用各种层析技术（如凝胶过滤、离子交换等）对初步纯化产物进 行进一步纯化，提高干扰素的纯度。
精制与制剂
对高纯度的干扰素进行精制和制剂加工，以满足临床应用的需求。
• 未来发展方向：随着生物技术的不断 发展，干扰素的质量控制将更加严格 和全面。未来发展方向包括建立更加 灵敏和准确的检测方法、提高制备工 艺的效率和纯度、加强生产过程中的 监控和管理等方面，以确保干扰素的 安全性和有效性。
05 干扰素制备的工艺优化
基因重组技术的优化
01
基因重组技术是制备干扰素的 关键技术之一，通过优化重组 技术，可以提高干扰素的产量 和纯度。
干扰素的种类
α干扰素
由白细胞和成纤维细胞产生，主要用于治疗 乙型肝炎和丙型肝炎。
β干扰素
由自然杀伤细胞产生，具有广谱抗病毒活性。
γ干扰素
由T淋巴细胞产生，具有免疫调节活性。
02 干扰素制备前的准备
原材料的准备
细胞培养基
选择适合细胞生长的培养基，确保细胞生长旺盛，产量高。
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物之干扰素的制备流程课件•引言•基因工程药物制备基础•干扰素制备流程详解•质量控制与安全性评估目•临床应用与市场前景•总结与展望录干扰素的基因克隆与表达目的基因的获取从人或动物细胞中提取干扰素基因，或通过化学合成方法获得。
基因克隆将目的基因插入到合适的载体中，如质粒、病毒等，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入到宿主细胞中，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等，进行基因表达，产生干扰素蛋白。
通过机械、化学或酶解等方法破碎细胞，释放干扰素蛋白。
细胞破碎初步纯化高度纯化利用离心、过滤、层析等技术对干扰素蛋白进行初步纯化，去除杂质和宿主细胞蛋白。
通过高效液相色谱、凝胶过滤层析等技术对干扰素蛋白进行高度纯化，获得高纯度的干扰素制品。
030201干扰素的分离纯化干扰素的制剂与质量控制制剂工艺将纯化后的干扰素蛋白进行制剂加工，如冻干、分装等，制备成适合临床使用的干扰素制剂。
质量控制对干扰素制剂进行质量检测和控制，包括外观、纯度、活性、安全性等方面的检测，确保产品质量符合规定标准。
基因工程药物是指利用基因工程技术生产的药物，包括基因重组蛋白质、基因治疗剂、基因疫苗等。
具有高效、特异性强、安全性高等优点，已成为现代医药产业的重要组成部分。
基因工程药物概述特点定义干扰素介绍定义干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性的蛋白质，是机体天然免疫的重要组成部分。
分类根据结构和功能不同，干扰素可分为α、β、γ等多种类型，其中α-干扰素是临床上应用最广泛的一种。
制备流程研究背景随着重组DNA技术的不断发展，利用基因工程技术生产干扰素已成为可能。
市场需求干扰素具有广泛的临床应用价值，市场需求量大，因此研究其制备流程具有重要意义。
基因重组通过体外DNA重组技术，将目的基因与载体DNA进行切割、拼接，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入宿主细胞，利用宿主细胞的转录和翻译系统，表达出具有特定生物学活性的蛋白质分子。
重组人干扰素生产工艺课程(PPT 44张)
干扰素生产工艺路线（1）
体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞 1989年：IFNα-n3，批准上市 产量低：1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性
干扰素生产工艺路线（2）
人源转化细胞系培养生产工艺： 1999年：IFN α-n1, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点： 活性低，退出临床应用。
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
免疫调节活性机制
免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞 和NK细胞等均有一定作用。 对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其 抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免 疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。 对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因 素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与 抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后 加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和 CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活 性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫 功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是 抑制B细胞生成IgE。 对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，增强 其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCⅡ 类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ 类分子，发挥抗原递呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强 ，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞（增强免疫系统）。
干扰素制备的工艺流程图课件
干扰素的制备流程
•
PPT学习交流
1
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合
5）用合适转头于4 ℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自
转。如果细 菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后
能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未
成致密沉淀块原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
提取重组质
粒③
4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明
个液相。置冰 上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0 ℃放置后
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
PPT学习交流
6
目的基因与克隆载体进行体 外重组
•
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1
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合
5）用合适转头于4 ℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自
转。如果细 菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后
能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未
成致密沉淀块原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
提取重组质
粒③
4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明
个液相。置冰 上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0 ℃放置后
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
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6
目的基因与克隆载体进行体 外重组
干扰素制备的工艺流程
将已活化的菌种接入装有30L培养基的
种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通
气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入
发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线
检查，控制杂菌
❖ 3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接 种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃， pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至 15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
α干扰素又依其结构分为 α1b、α2a、α2b等亚型
其区别在于个别氨基酸 的差异上，早期干扰素是用 病毒诱导人白血球产生的， 产量低、价格昂贵，不能满 足需要，现在可利用基因工 程技术并在大肠杆菌中发酵、 表达来进行生产。
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
❖ 4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机， 16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、 菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。 菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个 月，检查一次活性。
干扰素发酵过程控制
❖
在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂
七、对重组质粒的检测与目的基因提取
❖ 目的基因获取 ❖ 对获得的质粒进行双酶切，获得目的基因与PBR322质粒片
段，通过琼脂糖凝胶电泳，由于目的基因与PBR322质粒片 段相对分子量不同，在电泳过程中产生不同的条带，通过与 已知基因长度的对比，我们可以选出相应的目的基因，接着 利用Qiagen纯化柱回收纯化DNA。具体：用3倍体积的特殊 高盐溶液于55°融化带有目的基因的DNA片段的琼脂糖凝胶 块，将DNA释放到水溶液中。然后将其通过Qiagen纯化柱， 经过如图结合—洗涤—洗脱步骤，直接得到纯化的DNA样品。 ❖ 利用核酸探针杂交法鉴定目的基因
干扰素制备的工艺流程
系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。
❖ （2）蛋白质含量测定
❖
福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋
白为标准。
❖ （3）比活性
❖
效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。
❖ （4）纯度
❖
电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一
区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。
八、目的基因与表达载体的组合与导入
❖ 表达载体：PBV220,，将PBV220和目的基因用双酶切法处理， 退火后连接，构建重组质粒，利用CaCl2法导入到宿主大肠 杆菌中，构建工程菌，在培养基中培养，利用干扰素性质鉴 定目的工程菌，分离工程菌，扩大培养，提取出质粒，分析 质粒稳定性。
干扰素的发酵工艺过程
❖ （5）相对分子量测定
❖
还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相
对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对
分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比
较，误差不得高于10%。
❖ （6）残余外源性DNA含量测定
❖ ７）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。 如于4℃离心，盐也会了生沉淀。
❖ ８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽， 于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置 相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放 在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
什么是干扰素？
❖ 概念(interferon,IFN)：机体免 疫细胞产生的一类细胞因子，是 机体受到病毒感染时，免疫细胞 通过抗病毒应答反应而产生的一 组结构类似、功能接近的生物调 节蛋白。
❖ 根据分子结构和抗原性的差异分 为α、β、γ、ω等4个类型。
❖ （2）蛋白质含量测定
❖
福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋
白为标准。
❖ （3）比活性
❖
效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。
❖ （4）纯度
❖
电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一
区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。
八、目的基因与表达载体的组合与导入
❖ 表达载体：PBV220,，将PBV220和目的基因用双酶切法处理， 退火后连接，构建重组质粒，利用CaCl2法导入到宿主大肠 杆菌中，构建工程菌，在培养基中培养，利用干扰素性质鉴 定目的工程菌，分离工程菌，扩大培养，提取出质粒，分析 质粒稳定性。
干扰素的发酵工艺过程
❖ （5）相对分子量测定
❖
还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相
对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对
分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比
较，误差不得高于10%。
❖ （6）残余外源性DNA含量测定
❖ ７）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。 如于4℃离心，盐也会了生沉淀。
❖ ８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽， 于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置 相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放 在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
什么是干扰素？
❖ 概念(interferon,IFN)：机体免 疫细胞产生的一类细胞因子，是 机体受到病毒感染时，免疫细胞 通过抗病毒应答反应而产生的一 组结构类似、功能接近的生物调 节蛋白。
❖ 根据分子结构和抗原性的差异分 为α、β、γ、ω等4个类型。