原生质体融合技术
原生质体融合进技术与基因改组技术
（3）温度 ，并作为首轮多亲株融合的直接亲株。
诱变育种的具体操作要根据不同菌种的特性而异。 基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一种菌种选育新技术，首先选择一个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得
融合后的原生质体在加稳定剂的再生培养基上能重 新形成细胞壁，恢复正常的细胞形态，并能生长繁 殖，形成菌落。
影响原生质体再生的因素 （1）菌种本身特性 （2）原生质体制备条件 （3）再生培养基成分 （4）再生培养条件
基因组改组技术
基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础 之上的一种菌种选育新技术，首先选择一个原始亲 株，通过经典的诱变育种方法获得合的直接亲株，然后进行 多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第 一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌 株作为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮 的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选出性 状被提升的目的菌株
Genome shuffling 技术的具体方法
从基因组改组技术的原理来看，进行基因组改组， 首先要运用诱变育种的方法，以获得目的性状得到 改进的正向突变菌株的基因组库，并作为首轮多亲 株融合的直接亲株。诱变育种的具体操作要根据不 同菌种的特性而异。然后进行多亲株的递推式融合 （recursive fusion） 。
（4）亲株的亲缘关系的直接亲株，然后进行多亲株融合，使
其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；
（5）原生质体的活性 影响原生质体制备的因素
影响原生质体制备的因素 融合后的原生质体在加稳定剂的再生培养基上能重新形成细胞壁，恢复正常的细胞形态，并能生长繁殖，形成菌落。
植物原生质体融合技术
要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细 胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效 手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优 化生物反应器，实现融合过程的自动化和连 续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参 数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间 优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中 基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗 病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以 及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通 常在特定的电融合装置中进行，需要 在特定的电场强度和脉冲时间下进行 操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等 诱导原生质体融合，通过调节PEG浓 度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出 具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点
原生质体融合技术简介
(1)渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不 仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶 和底物的结合。渗透压稳定剂多采用Kcl、NaCl等 无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有 机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌 中多用蔗糖，丁二酸钠、NaCl等；在酵母菌中多 用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。 稳定剂的使用浓度一般均在o．3一o．8mol/L之间。
在链霉菌原生质体融合育种方面
邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新留素产生菌 的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产 生原养型重组体的频率为10-4。其中有58% 产生巴龙霉素，并从中获得了产量比原始菌 株(300ug/ml)提高5—6倍的融合子。
杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定 霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株 进行融合，以自身抗生素抗性为标记选择种 间融合子，从而获得了一株正定霉素产量较 亲株提高了2.6倍的融合子。
另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
(1) 菌体的前处理 为了使酶的作用效果更好一些， 可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入 一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的 细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰 甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D—丙氨酸之间的联 结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的 细壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。
原生质体融合技术简介
一 原生质体融合
定义：原生质体融合就是将两个亲株的细 胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在 高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的 球状原生质体。然后将两个亲株的原生质 体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融， 使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发 生两次基因组之间的接触、交换、遗传重 组，在再生细胞中获得重组体。
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合技术是一种准确、灵活和快速的分子育种技术，它可以将一种植物中的遗传物质与另一种植物的遗传物质融合在一起，以获得更有效的育种方法。
下面介绍植物原生质体融合技术的基本概念和其应用：
一、植物原生质体融合技术的基本概念
1、原生质体的定义：原生质体（Protoplast）是指细胞原有的稳定的液体质结构，在植物细胞当中占据重要的分子物质，可以被用来搅拌，冷冻，施主或克隆植物细胞的核酸，蛋白质以及其他的分子物质。
2、破壁法的原理：破壁法是一种用于分离出植物原生质体的方法，它利用酶和/或静电力，这种酶使细胞壁细胞可以被剥离出来，从而形成原生质体。
3、原生质体融合技术：原生质体融合技术就是利用破壁法将不同植物的原生质体融合起来，以获得新的基因组的遗传材料，从而为植物的育种提供了新的思路。
二、植物原生质体融合技术的应用
1、引入新基因：原生质体融合技术可以有效地引入一些新的基因材料到植物细胞，从而改变植物的性状特征，从而获得抗逆性、抗病性、烘焙品质和其他重要特征，使植物更适应环境条件。
2、突变：通过将不同植物原生质体融合起来，可以引发基因突变，从
而获得新的外观形状或性状，更好地提高植物的繁殖力和适应性。
3、抗逆育种：原生质体融合技术可以有效地增强植物细胞体抗病性和抗逆性，从而大大提高植物的耐受性，使一些极端的环境能够更好地适应植物的生长和发育。
总而言之，植物原生质体融合技术旨在将宿主植物中基因携带的遗传改良物质融入受体细胞中，以获得更多优良育种材料，从而提高植物的适应性和抗逆性，从而提升作物的产量。
第二节原生质体融合育种
第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。
受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。
另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。
重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。
遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。
原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。
可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。
16 植物原生质体融合技术
用于细胞核或细胞质失活的方法 ：
物理方法常采用射线处理，如X射线、γ射线等， 它们能使细胞核失活； 化学处理：核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙 酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－ G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧 化磷酸化过程而达到失活作用。
（三）植物体细胞杂交发展历程 1971年，Takebe离体烟草原生质体培养首 次获得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得第一个植物细胞 杂种――粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种。 1974年，Kao采用聚乙二醇诱导融合法诱导 植物细胞融合，建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers首次获得属间细胞杂种 （番茄＋马铃薯 ) 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并 首次提出了电融合概念）体细胞杂交的类型
根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合 可分为两大类： · 对称融合（asymmetric fusion）——即两个 完整的细胞原生质体融合。 · 非对称融合（symmetric fusion）——利用物 理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后 再进行融合。
体细胞杂种的应用潜力
1、 植物育种中的核质替换 2、 细胞质杂种的获得 3、 远缘杂交创造新物种 4、 细胞器的互作研究
体细胞杂交研究的发展趋势
1、 诱导融合及杂种细胞的各种生理、生
化、遗传机理的研究
2、 电融合的程序化控制研究
3、 各种类型原生质体（胞质体、核质体、
细胞器）的制备技术研究 4、 杂种细胞培养技术的程序化研究
电融合中的主要融合参数：包括交流电 压、交变电场的振幅频率、交变电场的 处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、
脉冲次数等。
融合技术要点：
融合液：CaCl2.2H2O 8~10mmol
原生质体融合技术在马铃薯育种中的应用
原生质体融合技术在马铃薯育种中的应用马铃薯作为一种重要的粮食作物，在我国种植面积和产量都有着很大的增长，但是由于其短周期内产生大量的病虫害和环境适应性差等问题，对其进行育种是非常必要的。
在传统的马铃薯育种中，主要采用的是人工杂交和改良选育等方法，但是这些方法存在着繁琐、耗时、成本高等问题。
近年来，原生质体融合技术的应用在马铃薯育种中引起了广泛关注。
原生质体融合技术是指将两个或多个细胞的原生质体融合在一起，使得它们的细胞核融合，形成新的细胞体系。
该技术具有克服杂交障碍、扩大基因来源、提高遗传多样性等优点。
在马铃薯育种中，原生质体融合技术主要应用于以下几个方面。
一、提高抗病性马铃薯是一种容易感染病毒的作物，其中最为严重的是马铃薯Y 病毒。
在传统育种中，提高马铃薯的抗病性是非常困难的。
但是通过原生质体融合技术，可以将具有抗病性的品种与感病性品种进行融合，从而产生具有抗病性的新品种。
例如，将具有良好的抗病性的野生马铃薯与普通马铃薯进行原生质体融合，可以获得具有更强的抗病性的新品种。
二、提高产量和品质通过原生质体融合技术，可以将不同品种的马铃薯进行融合，从而产生具有更高产量和更好品质的新品种。
例如，将产量高、品质好的马铃薯品种与耐病、耐旱的野生马铃薯进行原生质体融合，可以获得具有高产量和优质品质的新品种。
三、提高逆境适应性马铃薯在生长过程中面临着许多逆境，例如干旱、高温、低温等。
通过原生质体融合技术，可以将具有逆境适应性的野生马铃薯与普通马铃薯进行融合，从而产生具有更好逆境适应性的新品种。
例如，在干旱地区，将野生马铃薯的原生质体与普通马铃薯进行融合，可以获得具有更强抗旱能力的新品种。
总之，原生质体融合技术在马铃薯育种中具有广泛的应用前景。
通过该技术，可以克服传统育种的限制，提高马铃薯的产量和品质，提高其逆境适应性和抗病性，从而为马铃薯产业的发展提供更好的支持。
第六章 原生质体融合
例如：
猴和小鼠 牛和大肠杆菌 苹果和番茄 马铃薯和番茄 人和小鼠细胞
二、原ห้องสมุดไป่ตู้质体融合的类型
1.依据所选用亲本原生质体的来源可分为：
①体细胞杂交：
双亲的体细胞原生质体进行融合
②配子－体细胞杂交：
融合亲本一个是体细胞原生质体，另一个为性 细胞原生质体。精卵细胞与体细胞原生质体融 合可获得三倍体杂种。
③融合阶段
原生质桥 扩展，融合完 成，形成球形 的异核体或同 核体。
4 电融合法
Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合
电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极， 一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变 电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一 条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电 击穿，从而导致融合。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
③配子间原生质体融合：
融合亲本为精卵细胞，精卵细胞的体外融合成
功，标志着高等植物受精过程的研究从此可以
置于人工控制的离体条件下进行。
原生质体融合的类型
2.依据所选用亲本原生质体的来源是否相同：
自发融合（仅限同一物种之内）
诱导融合（指应用某种诱变剂导致原 生质体融合的方法）
诱导融合
对称融合：是指两个完整的原生质体融合， 在融合子细胞内含有两个融合亲本全套染色 体和全部的细胞质。
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原生质体融合技术的局限性
植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。
这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。
植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。
它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。
通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。
原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。
在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。
因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。
但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。
为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。
1.技术局限性
植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。
由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。
因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。
其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。
1.1诱导原生质体融合
诱导原生质体融合是体细胞杂交的最基本的技术环节。
融合方法的选择受到很多实验条件的限制。
常用的化学方法有化学方法与电融合方法。
化学方法中用的最多的是聚已二醇（PEG）融合技术。
但是这种方法中PEG与高PH强加于原生质体的非常生理条件，PEG 的相对分子质量、纯度、浓度、处理时间、原生质体的状况和密度等都会影响PEG融合技术，而且其融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用；而影响电融合的因素有电融合技术中交流电的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小电极的材料和间距、直流脉冲的强度、宽幅以及次数等。
而且对于不同的植物材料需要经过多次实验，才能找出这些参数的适当值。
这就制约了原生质体融合技术成为常规育种方法。
1.2杂种细胞的选择
为了将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，一般有以下选择方法：
1.2.1利用或诱导各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来；
互补选择一般要求有相应的突变体。
在体细胞杂交的研究中，虽然人们已经建立和利用了各种各样的突变体，但是在植物中要建立突变细胞系比较困难，如果要使突变细胞系保持再生能力就更难了，因此在实际应用中受到很大的限制。
1.2.2机械选择法
利用荧光素标记分离杂种细胞取得了一定的成效，但是显微镜操作费工费时，选择出异
核体的量很少，而且获得的杂种细胞必须进行单细胞培养，所用实验材料的原生质体必须具有单细胞培养再生植株的能力，因此这种方法具有一定的局限性，要获得大量的杂种植株比较困难；应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞，但是由于仪器比较昂贵，目前采用的人还是不多。
1.2.3组织培养筛选法
人为地造成细胞生长或分化能力的差异进行选择。
但是这三种方法的利用都有一定的局限性，应视不同的情况选择使用。
2.理论局限性
体细胞杂交与有性杂交不一样，除了涉及双亲的细胞核外，还涉及了双亲的细胞质。
它不仅可以使双亲的细胞核发生基因重组，还可以使双亲的细胞质中的叶绿体基因组和线粒体基因组重新组合。
还可以为遗传育种提供新的材料和资源，但同时又带来了较为复杂的关系。
应用体细胞杂交技术可以克服部分远缘组合间的不亲和，但尚不能从根本上解决此问题，虽然可以诱导任何两个物种间的原生质体融合，然而，目前获得的体细胞杂种植株仍限于少数物种。
另外，由于难以控制供体和受体基因组有丝分裂和减数分裂中的重组行为，因此，转移期望基因和形状的概率较小。
这是限制目前体细胞杂交技术在育种实践中应用的一个主要障碍。
在基因重组过程中还有可能整合一些不需要的基因或缺失一些有益基因，从而造成所获得的杂种材料产生较大的遗传变异而难以应用于育种实践。
体细胞杂交在改良作物的育种实践中曾经对它的应用潜力估计过高，实践证明并非像人们想象的那么简单，要获得期望的体细胞杂种植物难度仍然较大。
体细胞杂种难以应用于育种实践中的另一个问题是大多数种间体细胞杂种不育，或育性较低，或花粉活力较低。
除了那些无性繁殖作物之外，不育的体细胞杂种植株很难应用到育种实践中，以为一般体细胞杂种植物是通过回交的办法来逐渐减少供体基因的成分，保留所期望的基因或形状，从而达到改良作物的目的。
体细胞杂交作为一种育种途径，还必须与常规育种技术相结合，才能作为作物遗传改良作出更大的贡献。