Western-Blot显色篇
westernblot详细图解
westernblot详细图解Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
WesternBlot详解（原理、分类、试剂、步骤及问题解答）
WesternBlot详解（原理、分类、试剂、步骤及问题解答）Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
蛋白质印迹显色方法
蛋白质印迹显色方法
蛋白质印迹显色方法，又称为Western blotting，是一种用于检测特定蛋白质在混合蛋白质样品中的存在和数量的方法。
其基本原理是将蛋白质样品在凝胶电泳中分离，然后将其转移至膜上，并通过与特异性抗体结合来检测目标蛋白质。
蛋白质印迹显色的具体步骤包括以下几个方面：
1. 凝胶电泳：将待检测的蛋白质样品通过凝胶电泳分离，这可以将蛋白质按照大小分开。
通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2. 转膜：将分离后的蛋白质转移到硝酸纤维素或聚乙烯醇酸酯等半透膜上，这样可以将蛋白质分离出来的凝胶膜转移到膜上。
3. 阻断：在膜上阻止非特异性结合，通常采用牛血清白蛋白或者非脂类牛奶粉等阻断剂进行处理，这可以避免抗体非特异性结合。
4. 检测：将目标蛋白质进行检测，通常采用与目标蛋白质特异性的抗体进行结合，随后采用辅助抗体进行检测。
5. 显色：通过显色剂将目标蛋白质反应出来，一般采用酶标记剂如HRP和AP 等，通过产生化学反应使显色剂发色。
总的来说，蛋白质印迹显色方法是一种精确可靠的蛋白质检测方法，广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫学等领域，可以用于检测蛋白质的相对分子量、表达水平、修饰状态等。
Western blot详细操作过程
Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。
实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。
2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。
使用终浓度为1 mmol/L 。
【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。
PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。
Western Blot原理、显色分类及操作步骤
Western Blot原理、显色分类及操作步骤(2008-08-14 23:07:59)标签：western blot显色教育一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
二、操作步骤：(一) 配胶1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)培训讲学
W e s t e r n b l o t步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全)(1)Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2014年6月第一部分细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程 (碧云天试剂盒)一、原理在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。
分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。
约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。
抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。
本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。
最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。
本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。
二、注意事项1.需自备PMSF。
PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。
可以抽提的组织样品数通常不足100个。
4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。
Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)
Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2014年6月第一部分细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒)一、原理在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。
分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。
约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。
抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。
本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。
最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。
本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。
二、注意事项1.需自备PMSF。
PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。
可以抽提的组织样品数通常不足100个。
4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。
但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
westernblot详细图解
（2）弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心0 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
四、SDS－PAGE电泳
1. 清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
（7）加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3. 电泳
电泳时间一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
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Western Blot显色篇WB蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要的——各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果WB产品。
讲完了Western Blotting的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下WB的检测系统。
一般的WB检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。
我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。
你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者Protein A或G等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急，生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个WB高手。
另外如果实验室有已经建立的固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助——这也就达到我们的目的了。
与蛋白质组学一线专家面对面，赶快报名参加第二期蛋白质组学技术与应用高级培训班！封闭和一抗的选择没有太多的选择余地——封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于WB的就OK。
如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。
如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。
除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。
还听说有用荧光标记的一抗直接检测而降低背景和非特异结合，不过由于少了二抗的级联放大信号扩增，信号也会比较弱，所以需要选择荧光信号特别明亮的标记（Invitrogen收购了著名的Molecular Probes后有推出Alexa Fluor的抗体标记试剂盒，生物通这里有详细而精彩的介绍，我们就不罗嗦了。
毕竟不是WB的主流方法。
）一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做2—3个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。
二级试剂的作用是信号扩增，选择是根据一抗的标记形式而决定的，对于无标记的一抗，可以选择对应一抗来源种属的标记二抗，或者更便宜的标记蛋白A（来自金黄葡萄球菌Protein A可以高度亲和来自人，兔，豚鼠的IgG，但对大鼠、山羊和鸡的IgG亲和力弱）。
不过，二抗是更可靠的选择——除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你准备采用的检测方法选择合适的标记。
酶促反应比同位素安全且快速，已经成为Western Blot的主流检测方法。
酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。
最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP （Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶β-Galactosidase。
. HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。
HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类。
对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性——比如底物可溶性高使用就比较方便；对于WB来说产物不可溶有助于信号在原位的积累和结果的稳定（产物可溶的底物更适合于Elisa）。
HRP的生色底物显色有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。
最熟悉的底物应该是3'3'二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。
DAB的选择有一点小小的技巧——3'3'二氨基联苯胺4盐酸盐的纯品分子量为360.1，通常是深棕色粉末，不太好溶于水，容易得到有色颗粒的溶液而导致膜上的背景，而且价格还被炒得贵；但是如果选择2水合3'3'二氨基联苯胺4盐酸盐（分子量396.14）就是白色粉末状晶体，易溶，溶液无色均匀，量大价格还便宜。
DAB还有溶剂形式的，便于使用。
由于DAB显色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有的厂家还推出了DAB+4-CN混合底物，结合了DAB灵敏度高和4-CN背景低，易成像的优点，能获得很好的黑色沉淀成像。
用金属离子增强信号的DBA显色试剂灵敏度可以高达20pg。
TMB的signal-to-noise信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数；ACE各方面性质与DAB相似，但灵敏度要比DAB差一点。
HRP化学发光反应底物经过多个著名厂家的不断研究开发而有了更显著的改进。
Luminol是经典的HRP化学发光底物。
化学发光底物主要考虑的是：发光信号强弱——发光信号当然越强越好，强发光信号持续的时间——也是越长越好，还有就是背景低灵敏度高。
化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应般形成不溶的产物于膜上累积，所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。
目前最高检测灵敏度已经达到低飞克（Femto）级别而成为安全且灵敏度最高的WB检测方法。
随着Cooled-CCD 技术的发展，成像系统成本越来越低，因而在现在的实验室里这些设备越来越普遍。
Cooled-CCD照相机与X胶片相比具有瞬时影像处理、立即输出、不需要胶片处理装置及暗室等成本花费、可用软件半定量分析等优点，然而，这项技术应用于WB化学发光法显影还要求底物能产生高强度、长持续时间的信号，以被照相机捕获到。
经过各大厂家的不断开发，现在的化学发光检测试剂从以前的发光时间持续几十分钟，到现在多数试剂可持续长达几个小时到一天，新的化学发光检测试剂盒很多兼容CCD成像检测，如果是实验室有CCD成像设备的不妨留意试剂盒是否有这种说明。
发光时间的延长即使对于X底片的用户也是好消息——因为压片显影后如果发现压片结果不理想，还可以多次重复压片而不需要重新反应。
化学发光的常见问题主要是抗体浓度过高——所以抗体用量要比规定的稀释倍数放大许多，确保HRP不会过量导致底物过快消耗完而引起结果不稳定。
GE Healthcare（原安玛西亚）的ECL堪称是经典，ECL在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词，有时竟然是高品质文章的保证之一，可见其经典。
后来推出的ECL Plus和ECL Advance不单将检测灵敏度提高了10—20倍，发光时间也长达24小时以上，兼容CCD成像系统的检测，使得ECL系统继续领导潮流。
前不久GE Healthcare公司在生物通上发布了ECL全系列的65折特价优惠，价格相当吸引，对于ECL的忠实粉丝们实在不该错过。
虽然延长信号持续时间让研究人员能充分利用成像系统的所有特点，但低极限的灵敏度才是研究者期望的终极目标。
除了拥有王牌产品ECL的GE公司，化学发光底物方面不得不提到Pierce公司。
Pierce形象广告十分有趣鲜明：用不同色彩的手掌印来表示Pierce 真的很有一手:）。
这家已经有半个世纪历史、在蛋白质化学领域声誉卓著的的公司6年前与HyClone合并，拥有世界上最优秀的HRP化学发光底物生产技术——世界上许多知名的化学发光底物试剂盒厂商都采用PIERCE提供的化学发光底物作为生产原料。
其中最耀眼的璀璨之星是SuperSignal系列，就像印证上面我们提到的选择显色系统的标准一样，SuperSignal灵敏度高（有10-12g级，10-14g级，10-15g 级选择），发光持久（6-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏6个月，4℃至少是12个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数是同类产品的10倍以上，这对于宝贵一抗来说十分重要）。
让人几乎无法从中挑出毛病来，如果说有的话，当然就是希望便宜一点，再便宜一点罗。
另外需要提醒的是抗体一定要比底物显色法中稀释更多倍数，不然过于灵敏（背景高）可不能怪Supersignal哦，还有记得不能拿叠氮钠来当防腐剂――因为叠氮钠会抑制HRP的作用。
除此之外也要注意Pierce提供的溶液要用棕色瓶避光保存。
Pierce的很有一手不仅仅于此，还有更好玩的东西——不用转膜直接在PAGE胶上做Western Blot的好东西！且看生物通后面慢慢介绍。
Western Blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是AP——碱性磷酸酶。
碱性磷酸酶很早就被用于检测系统——包括固定化抗原（WB）检测和核酸检测。
但是做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，所以就WesternBlot本身来说偏爱HRP的要比AP多——分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高。
所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。
一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略。
AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，成像性好容易拍照。
早些年前，AP检测的灵敏度比HRP高，但是背景也偏高，整个显色过程更有“技术性”，有许多个人技巧在里面，让人取舍两难。
如今由于HRP系的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上HRP和AP不相上下，但是生色反应来说，AP显色的灵敏度还是比一般的HRP 显色底物要高。