酵母表面展示技术ppt课件
细菌与酵母表面展示技术课件
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细菌与酵母表面展示技术
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细菌与酵母表面展示技术
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酵母菌表面展示操作步骤之酵母菌表面展示及分析
酵母菌表面展示操作步骤之酵母菌表面展示及分析酵母菌表面展示是一种常用的技术手段，用于展示特定蛋白质或多肽在酵母菌表面的表达情况。
这种技术可以用于基因工程、疫苗研究、抗体产生等领域。
酵母菌表面展示的操作步骤如下：1. 获得目标基因首先，需要获得目标基因的DNA序列。
这可以通过多种方法获得，如人工合成、提取已有菌株的DNA等。
确保DNA序列准确无误。
2. 克隆目标基因将目标基因克隆到酵母菌表面展示载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，并与表达载体连接，然后将连接产物转化到酵母菌中。
3. 酵母菌的培养和诱导表达将克隆了目标基因的酵母菌进行培养，可以使用液体培养基或固体培养基。
在适当的培养条件下，如适宜的温度、氧气含量和pH值下，培养酵母菌。
当酵母菌达到适当生长阶段时，加入适宜的诱导剂，促使目标基因的表达。
4. 毛细管电泳检测经过一段时间的诱导表达后，可以进行毛细管电泳检测。
这是一种常用的酵母菌表面展示分析方法，可用于定量和质量分析。
5. 通过Western blot检测表达蛋白将经过毛细管电泳分离的样本进行Western blot分析。
这是一种常见的蛋白质检测方法，可用于检测目标基因在酵母菌表面的展示情况。
6. 电镜观察使用透射电子显微镜观察酵母菌表面展示的情况。
通过电镜观察，可以直接看到目标基因在酵母菌表面的定位和分布情况。
7. 流式细胞术分析使用流式细胞仪对酵母菌表面展示样品进行分析。
流式细胞仪可用于检测和计数表面展示目标基因的酵母菌的数量和质量。
8. 结果分析和解释根据以上步骤获得的数据和结果，进行数据分析和结果解释。
根据需要，可以进行进一步的实验和验证。
总之，酵母菌表面展示操作步骤包括获取目标基因、克隆目标基因、酵母菌的培养和诱导表达、毛细管电泳检测、Western blot检测、电镜观察、流式细胞术分析以及结果分析和解释。
这些步骤是酵母菌表面展示研究中的关键环节，可以帮助研究人员获得目标基因在酵母菌表面的表达情况。
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Schreuder等未来自瓜儿豆
胶的α-半乳糖苷酶的基因插入
到酿酒酵母转化酶分泌信号和
α-凝集素C端部分编码序列之间
。α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶
-α-凝集素〔α-Gal-ACI〕交融蛋
与α-凝集素类似的衔接锚定在细胞壁上。与α-凝集
素不同，α-凝集素由两个亚单位的糖蛋白பைடு நூலகம்成。
•
酵母外表展现系统运用在酿酒酵母的α-凝集
素将外源蛋白质展现与细胞外表。α-凝集素由中心亚
单位(Agalp)和结合亚单位(Aga2p)两个亚单位组成，
Agalp
•
共725个氨基酸，合成后被分泌到细胞外，与酵母
谢谢欣赏
1.目的蛋白-α-凝集素外表展现系统
• 此系统将目的蛋白作为N端，与α-凝集素C端部分交融， 目的蛋白经α-凝集素展现酵母细胞外表。α-凝集素共价衔 接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨 基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的 O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发扬 作用。
• 酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进展挑 选和分别，这就使得基于特异定量亲和力改动的 的突变体分别成为能够。由于酵母展现的蛋白质 是严密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取， 同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具 有很好的运用前景。
• 前景：
• 外表展现技术日新月异，酵母展现系统在不断的完善和改 良，在多个领域得到广泛运用。由于其是真核细胞展现系统， 对于哺乳动物蛋白质，尤其是人的蛋白质的展现具有独特的 优越性，置信随着此技术的不断完善，在蛋白质分子的研讨 方面发扬越来越重要的作用。
酵母菌表面展示操作步骤之酵母细胞转化与筛选
酵母菌表面展示操作步骤之酵母细胞转化与筛选酵母菌表面展示是一种常用的生物技术方法，通过将目标蛋白质展示在酵母菌表面，可以方便地筛选和分析目标蛋白的性质和功能。
本篇回复将介绍酵母细胞转化和筛选的操作步骤。
1. 酵母细胞培养首先，准备酵母菌的培养基，可选择含有适当营养物质的液体培养基或固体培养基。
将培养基加热至适温（通常为30°C）后，将酵母菌培养基中接种适量的酵母细胞。
培养室环境应保持洁净，避免杂菌的污染。
2. 酵母细胞转化酵母细胞转化是将外源DNA导入酵母细胞的过程。
常用的方法有化学法、电穿孔法和冷冻转化法等。
化学法是最常用的方法之一。
首先，将目标DNA与载体质粒进行连接。
然后，将该DNA与酵母细胞混合，加入聚乙二醇和锂盐缓冲液，并进行热胁迫。
此时酵母细胞的细胞壁会变薄，使DNA能够进入细胞。
最后，将转化混合物分别进行热立体电转，温度变化会让酵母细胞摆脱聚乙二醇，转化DNA进入细胞内。
电穿孔法在酵母细胞转化中也被广泛使用。
该方法通过施加高压电脉冲来使细胞膜通透，从而使DNA能够进入细胞内。
冷冻转化法则通过将酵母细胞与DNA混合后迅速冷冻来实现DNA导入。
冷冻对酵母细胞膜的完整性要求较高，因此通常需要较高的转化效率。
3. 筛选转化酵母细胞筛选转化酵母细胞是为了找出具有目标蛋白质表面展示的细胞株。
常见的筛选方法包括基于细胞生长特性的选择筛选和基于蛋白质表达的筛选。
基于细胞生长特性的选择筛选方法利用某些基因的突变导致细胞对特定抗生素的敏感或抗药性来筛选细胞。
例如，将转化酵母细胞接种在含有某种抗生素的培养基上，只有表达了目标蛋白的细胞才能生长。
基于蛋白质表达的筛选方法则通过蛋白质表达水平的检测来筛选细胞。
常用的方法包括免疫检测、荧光标记和酶活检测等。
例如，可以利用特异性抗体来检测目标蛋白的表达情况，或者利用荧光蛋白标记来可视化表达目标蛋白的细胞。
4. 确认目标蛋白质表面展示在筛选出合适的酵母细胞株后，需要进行确认，确保目标蛋白质确实表达在酵母菌的表面。
酵母细胞表面展示
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Hahnenberger和Kurtz 建立了酵母展示的系统来筛选钾离子通道、 质子通道和钠/氢离子通道的抑制剂。其中，流行性感冒质子通道 蛋白M2的表达能导致酵母生长缺陷，因此，理论上那些能使酵母 恢复生长的化合物就是M2的抑制剂。据此，他们筛选得到了一个 流行性感冒质子通道蛋白的抑制剂。此外，在利用生长抑制的方法 进行抑制剂筛选实验中，由于那些具细胞毒性的化合物虽然不是离 子通道抑制剂，也能阻碍酵母生长。为此，Hahnenberger和Kurtz设 计了微生理测量计，能检测出反映离子通道功能的pH变化，为假 阳性的剔除提供了一个快速的二次检验方法。
• 絮凝结构域锚定系统是利用 FLo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮 凝功能结构域识别酵母细胞 壁中的甘露聚糖链并非共价 作用诱导细胞粘附、聚集成 可逆性絮状物。
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酵母表面展示技术的特点
特点
表达偏差 小
筛选、纯 化、活性 测定方便
融合蛋白 相对分子 质量范围
酵母细胞表面展示技术及其在高通 量筛选中的应用
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目录
• 酵母细胞表面展示技术的概述 • 酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的应用
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酵母细胞表面展示技术的概述
酵母细胞表面展示技术概念 酵母细胞表面展示技术基本原理 酵母细胞表面展示技术常见系统 酵母细胞表面展示技术的特点
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酵母细胞表面展示技术的概述
• 酵母细胞表面展示技术(Surface Display)是一种真核蛋白表达系统。
它是一类筛选蛋白质突变体库的高通量 筛选方法，在抗体蛋白的研究中应用尤 其广泛，具有高效、灵敏等特点，在医 药、食品、生物燃料等多个工业领域都 有广泛的应用前景。
制备酵母菌表面展示样品
制备酵母菌表面展示样品酵母菌表面展示样品的制备方法可以通过以下步骤进行实施：步骤一：酵母菌培养和预处理1.1选择适当的酵母菌菌株，如Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）或Pichia pastoris（牧酒酵母）。
1.2在适当选择的培养基中培养酵母菌，以期获得高密度的酵母细胞。
此步骤中需要注意培养时间和培养基条件的选择。
1.3在合适的菌液浓度下收获酵母细胞，可通过离心或过滤等方式进行。
步骤二：选择目标蛋白和构建表达载体2.1根据需求选择适当的目标蛋白，并确定其表达所需的信号肽和连接序列。
2.2将目标蛋白的编码序列克隆到表达载体中，并进行双酶切鉴定以确保正确的插入。
步骤三：转化表达载体到酵母菌细胞并进行选择筛选3.1将构建好的表达载体转化到酵母细胞中，可以使用化学法、电转法或基因枪等方法进行。
3.2将转化后的酵母菌细胞接种在选择性培养基中进行培养，筛选出成功表达目标蛋白的阳性克隆。
3.3通过PCR、Western blot等技术进行阳性克隆的鉴定。
步骤四：酵母菌表面展示样品的净化和纯化4.1收获酵母菌细胞并洗涤，去除培养基和其它杂质。
4.2使用适当的方法（如裂解酵母细胞壁、溶解酵母细胞膜）将蛋白释放到溶液中。
4.3将溶液进行离心或过滤等操作，去除残留的细胞壁、细胞膜等。
4.4使用适当的纯化方法（如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等）纯化目标蛋白。
步骤五：酵母菌表面展示样品的检测和鉴定5.1使用SDS-PAGE或其它方法检测纯化后的蛋白样品。
5.2通过Western blot、ELISA等技术鉴定纯化后的蛋白样品的免疫活性。
5.3可以使用荧光显微镜或流式细胞仪等技术检测酵母细胞表面展示的蛋白。
步骤六：酵母菌表面展示样品的应用6.1根据需求可以将制备好的酵母菌表面展示样品应用于不同的研究领域，如抗体筛选、抗原呈递、酶学研究等。
6.2可以使用表面展示的酵母菌细胞作为疫苗载体进行疫苗研究。
酵母表面展示技术及其应用
根据4段重复序列的位置不同,利用Flo1 蛋白C端含有GPI锚定附着信号的区域 , 建立了6个锚定长度不同的GPI展示系统。 根据目的蛋白的特性和展示目的选用锚 定长度不同的GPI展示系统,将目的蛋白 的C端融合到锚定序列上。
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二、酵母展示系统类型
絮凝结构域锚定系统
cell-surface
应用 Application
受体 Receptor
筛选特异配体 、研究抗体结合位点
Protein recognition
抗原 Antigen
未知功能的目的基因产物 Unknown functional
product of target gene 特定病理过程相关蛋白 Protein related to specific pathological process
三、酵母表面展示技术优点
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a-凝集素系统中外源蛋白通过二硫键与细胞壁相连, 因此可用还原 剂将二硫键打断,使目的蛋白从细胞表面解离，分离纯化方便。
05 对展示在细胞表面的单个克隆的突变特性、酶的活性无需进行蛋 白质的水溶性表达和纯化,可以直接在全细胞基础上测定，活性测 定方便。
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四、酵母表面展示技术应用
α-凝集素 (Agα)系统
α-凝集素由Ag α1基因编码, 仅有1个核心亚基。其C端的320个氨 基酸残基 (富含丝氨酸和苏氨酸的支持区及GPI锚定蛋白附着信号 区 )与细胞壁葡聚糖共价结合,使其锚定在细胞壁上。目的蛋白的C 端与α-凝集素的N端融合,实现目的蛋白的细胞表面展示。
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二、酵母展示系统类型
展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多；研究发现相
02 对分子质量在0.93×106 Da 和136×106 Da之间的分子均可展示 于酵母菌表面,且每个酵母表面可展示104～105 个分子。
酵母细胞表面展示
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最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达
是将外源基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列(含GPI锚 定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游,融合蛋白 诱导表达后,信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌, 由于融 合蛋白C-末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列 ,可 将蛋白锚定在酵母细胞壁中,从而将蛋白分子展示表达在 酵母细胞表面。
随之发展起来的基于靶点的药物筛选至今已有大量成 功先例。
选择的靶点基本上可分为四种类型： 离子通道、核受体、G 蛋白偶联受体(GPCRs)和酶。
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离子通道
直接活性筛选 可通过酵母系统直接进行化合物活性筛选，这主要源于两种情况: (1)在离子转运缺陷的酵母菌株中重建人的离子通道，会产生补充 生长的表型； (2)在酵母中表达离子通道蛋白可导致酵母生长缺陷。 在筛选离子通道抑制剂时，前种情况可筛选那些导致酵母生长 受抑的化合物，而后种情况下则可筛选那些能使酵母细胞恢复生长 的化合物。
大
融合蛋白 分子数量
多
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酵母表面展示系统的应用
酒精发酵
酵母表面展示
生物吸附 高通量筛选
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乙醇发酵
为了简化纤维素乙醇生产工艺，实现纤维素利用与乙醇发酵的同步 进行，莫春玲等通过酵母细胞表面展示技术，以酿酒酵母菌株 Saccharomyces cerevisiae Y5 为受体，通过絮凝素 (Flo1p) 锚定方式，将 来自丝状真菌里氏木霉 Trichoderma reesei 的内切葡聚糖酶Ⅱ(EGII)、纤 维二糖水解酶Ⅱ(CBHII)以及来自棘孢曲霉 Aspergillusaculeatus 的 β-葡糖 苷酶Ⅰ(BGLI) 展示在细胞表面，构建同时表达 3 种纤维素酶的酵母菌群 系统。
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酵母表面展示系统与新药筛选
将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关 能的基 因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质， 有助于对未知基因功能的研究，并能发现一些药 物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新药先导 化合物 。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵 母双杂交技术相结合，将抗体的单链（scFv） 片断连接到转录因子VP16 的激活结构域( AD) 上， 将抗原连接到酵母LexA的结合结构域( DB) 上，以His3 和LacZ 为报告基因， 建立抗原抗 体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相互 作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达， 可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从 scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异 的抗体，为疫苗及抗体类药物的研制提供良好的 平台。
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酵母表面展示系统的类型
最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集 素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编 码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列) 连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合蛋 白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞 外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定 信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵 母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵 母细胞表面。
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絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源 蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表 面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统 和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用 絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源 蛋白，此系统与凝集素展示相似; 絮凝结构 域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识 别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以非共价作
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酵母表面展示系统基本组成
宿主细胞
酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物（GRAS）而广泛 应用于食品工业和医药工业，也是目前常见的用于酵母 表面展示的宿主细胞。除酿酒酵母外，近年来酵母展示 平台已被拓展至某些能利用甲醇作为单一碳源和能量来 源的细胞株，如巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母。与酿酒酵 母相比，嗜甲醇酵母细胞株具有更优越的发酵特性，如 能够在廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度，这些 特性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势，例如展 示异源酶作为全细胞催化剂。另外，毕赤酵母对外源蛋 白的 O-糖基化程度更高，因而对展示的外源酶具有更好 的稳定效果。
用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
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酵母表面展示系统的应用
酵母表面展示与酒精发酵 传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原
料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然 纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人 们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种 潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有 着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵 具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维 素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构 建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞 生物催化剂。
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酵母细胞表面展示与生物吸附
环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附 为基础的，例如微生物对重金属的吸附就包括两 种途径: ( 1) 与细胞表面复合物结合，( 2) 逐 渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消化降 解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨 越细胞膜这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可 重复利用。利用表面展示技术能较好地解决这一 问题，吸附蛋白直接展示在细胞表面，不仅使吸 附过程快捷高效还可以利用回复剂如EDTA 对其 进行处理使之不断重复利用。
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原理
酵母是单细胞真核生物,根据交配型的差 异分为两种单倍体:MATα和MATa,其细胞 表面分别表达α-凝集素和a-凝集素,它 们可以介导细胞之间的交配融合。酵母 表面展示系统应用的是酿酒酵母的a-凝 集素,外源蛋白借助它在细胞表面得到展 示。a-凝集素由核心亚单位(Aga1)和结 合亚单位(Aga2)两部分组成,Aga1共有 725个氨基酸,它与酵母细胞壁的β-葡聚 糖共价连接。Aga2共有69个氨基酸,它通 过两个二硫键与Aga1结合,表达于酵母细 胞表面。Aga2的N端部分参与二硫键的形 成,外源蛋白通过与Aga2的C端融合可展 示于酵母细胞表面。
酵母表面展示技术
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细胞表面是细胞内外的功能界面。一些表面蛋白 横穿过质膜，另一些以共价或非共价结构与细胞 表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面 蛋白，并且能将其限制在细胞表面的特定区域。 在生物技术中，细胞表面通常用于研究蛋白跨膜 的机理。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较 快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外 源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列 融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞 表面，在医药、食品、生物燃料等多个工业领域 都有广泛的应用前景。
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载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘露 糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价方式 松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提；另一类 蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消化细 胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚定区 域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如Cwp1p， Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族蛋白，外源蛋 白与它们融合后可被共价锚定于细胞表面，这些 蛋白是常用的酵母表面展示载体蛋白。