Real-Time PCR详细介绍
realtimepcr的名词解释
realtimepcr的名词解释Real-time PCR的名词解释Real-time PCR，即实时定量聚合酶链反应，是一种在生物分子研究领域被广泛应用的技术。
它能够在短时间内检测和定量分析DNA或RNA的含量，因此在基因表达研究、微生物检测、病原体诊断等领域具有重要的意义。
首先，我们来了解PCR的基本原理。
聚合酶链反应（PCR）是一种能够在体外扩增DNA分子的技术。
它利用DNA聚合酶酶活性，在一系列变温反应过程中，通过酶催化，把待测DNA片段的特定区域进行放大，从而获得足够数量的目标DNA。
这种技术的应用使得我们能够快速、准确地研究和分析DNA的相关信息。
与传统PCR不同，Real-time PCR在PCR过程中实时监测反应体系中的荧光信号，以实现对DNA量的定量和计量。
这主要通过添加合成的DNA探针或荧光标记的引物，以及具有对应荧光信号的探针来实现。
在PCR反应进行过程中，荧光信号将与DNA量成正比。
PCR结束后，计算机软件会分析和显示实时荧光信号的扩增曲线，从而确定样品中目标DNA的起始量。
Real-time PCR的优势在于其高灵敏度、高选择性和高分辨率。
相对于传统PCR，Real-time PCR不需要后续的电泳分析，节省了实验时间，减少了实验操作和处理的复杂性。
此外，由于实时监测PCR反应过程中的信号变化，Real-time PCR能够提供更精确的计量和定量结果。
Real-time PCR有多种应用，其中包括基因表达研究。
通过实时监测特定基因的表达水平，我们可以了解基因在不同条件下的转录变化情况，从而理解其在生物过程中的功能和调控机制。
此外，Real-time PCR还可以用于微生物检测。
通过设计特异性的引物，可以快速、精确地检测病原微生物的存在与否，为临床诊断和疾病防控提供帮助。
除了这些应用外，Real-time PCR还在病原体诊断和检测方面发挥着重要作用。
传统的病原体检测方法往往需要培养和鉴定，周期较长，诊断结果需要等待数天甚至更长时间。
标准终点RTPCR
标准终点RTPCR实时荧光定量PCR（real-time PCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、遗传疾病诊断等领域。
在实时荧光定量PCR技术中，终点PCR是一种常用的PCR方法，它可以通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。
本文将介绍标准终点RTPCR的原理、方法和应用。
1. 原理。
标准终点RTPCR是一种半定量PCR技术，其原理是利用DNA或RNA模板，在PCR反应体系中进行多轮扩增，通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。
在PCR反应中，每一轮循环都会产生指数级增加的DNA或RNA产物，同时伴随着荧光信号的累积。
当PCR反应达到饱和时，荧光信号会呈指数级增加，最终趋于平稳。
通过检测PCR反应终点的荧光信号强度，可以确定起始模板的含量，从而实现对目标DNA或RNA的定量分析。
2. 方法。
标准终点RTPCR的方法包括PCR反应体系的准备、PCR程序的设置、荧光信号的检测和数据分析等步骤。
首先，需要准备PCR反应体系，包括模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶等。
然后，设置PCR程序，包括预变性、PCR扩增和荧光信号采集等步骤。
在PCR扩增过程中，荧光信号会随着PCR产物的累积而增加，直至达到饱和。
最后，通过荧光检测仪器采集PCR反应终点的荧光信号，并进行数据分析，得出目标DNA或RNA的定量结果。
3. 应用。
标准终点RTPCR技术在科学研究和临床诊断中具有广泛的应用价值。
在基因表达分析中，可以利用标准终点RTPCR技术对特定基因的表达水平进行定量分析，从而揭示基因调控网络和信号转导通路。
在病原微生物检测中，可以利用标准终点RTPCR技术对病原微生物的核酸进行定量检测，实现对病原微生物的快速、准确的诊断。
在遗传疾病诊断中，可以利用标准终点RTPCR技术对患者的遗传物质进行定量分析，为临床诊断和治疗提供依据。
Real-Time PCR 简介
平台期
Cycle number
1
2
平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初 始量越多，平台出现得越早。
平台效应产生的因素：
引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消
耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争
等
PCR 常见问题及分析
1、扩增失败
UNG酶的好处
有效地防止污染������
UNG酶能切断所有含dU的双链或单链DNA
含U的DNA是PCR产物，其气溶胶造成实验室污染
商用PCR试剂盒均以dUTP取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的 DNA链。在定量PCR开始前增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将已 有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染。
不再随循环次数的增加而呈指数增长
技术服务部
靶序列
靶序列
Cycle 1
5' 3'
1
3' 5'
2
5' 3'
3' 5'
Denaturation: 94 – 96°C
5'
3'
5'
3' 5'
5'
3'
3'
Annealing: 50 – 65°C
5' 3'
1
5' 3'
3
5'
4 2
Elongation: 70 – 75°C
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少 影响反应产量
四、脱氧核苷三磷酸（dNTP）
dATP、dCTP、dGTP、dTTP(dUTP)的混合物 ,
real-time pcr原理
实时聚合酶链式反应（Real-time PCR）是一种分子生物学技术，用于定量测量DNA或RNA的含量。
它可以用于检测、量化和分析特定基因的表达水平，也可以用于检测病原体、基因突变和许多其他应用。
下面是实时PCR的基本原理：1. **选择性扩增目标DNA/RNA**：实时PCR的第一步是选择性扩增目标DNA或RNA片段。
这通常涉及到设计一对特异性引物（引导片段）来诱导DNA合成。
引物是两个短的DNA片段，它们会结合到目标序列的两端。
2. **荧光探针**：为了实时检测PCR反应的进展，一种叫做荧光探针的特殊DNA分子被引入反应混合物中。
荧光探针是一个含有荧光染料的短链DNA片段，它的一端与一个荧光染料分子紧密相连，另一端与一个荧光阻尼器分子相连。
在初始PCR反应中，这两个分子紧密靠在一起，从而抑制了荧光的发射。
3. **PCR反应**：PCR反应开始后，DNA引物将目标序列进行扩增。
如果目标序列存在，PCR会不断复制它，导致DNA量指数级增加。
4. **荧光信号检测**：在每个PCR循环的末尾，荧光探针靠近的情况会改变。
当PCR过程中荧光探针结合到目标序列时，它被降解，荧光染料与阻尼器分离，导致荧光信号的释放。
荧光信号的强度与PCR反应中目标序列的数量成正比。
5. **实时监测**：荧光信号会在PCR过程中实时检测和记录。
这种监测可以通过特殊的仪器完成，该仪器测量荧光信号的强度并将其显示在一个图表中。
荧光信号的强度与PCR反应中目标序列的初始数量成比例。
因此，通过比较样本中的荧光信号与标准曲线或对照样本，可以定量测量目标DNA或RNA的含量。
总的来说，实时PCR允许科学家在PCR反应进行的同时实时监测和记录DNA或RNA的数量，因此它是一种非常有用的技术，用于定量和检测基因表达、基因变异、病原体等多种生物学研究和诊断应用中。
Real-Time_PCR技术
TaqMan法优缺点
优 点
对目标序列的高特异性 ---阴性结果确定 设计相对简单 ---与目标序列某一区域 互补 重复性比较好
缺 点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
2：SYBR Green I 法（荧光染料法）
在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green荧光染料，SYBR Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号， 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号， 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
Real-TimePCR技术
许培祥
2013-10-24
主要内容
• Real-timePCR概述 • Real-timePCR的方法 • Real-time PCR定量方法
Real-timePCR概述
1.Real-time PCR
实时荧光定量PCR （Real-time quantitative
PCR ）是在PCR反应体系中加入荧光基团，
Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信
号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数.
C(t) value
Ct值与模板起始浓度的关系
• 模板起始浓度越高，Ct值越小
• 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达
• 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达
Ct值的特点
Ct值的特点： 同一个样品重复96次PCR的扩增曲线，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性
RT-PCR定量的方法 • 标准曲线法的绝对定量 • 相对定量： 比较Ct法---最常用 双标准曲线法 比较定量法
1：标准曲线的绝对定量
通过已知起始拷贝数的标准品可作出 标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中 所含的模板量
real-time
real-time pcr---杂交探针4．杂交探针：是⼀种新型的荧光探针，由两条探针组成，⼀条在 5’端标记荧光（3’端被封闭，以防⽌退⽕后的延伸），⼀条在3’端标记荧光，其中⼀个为受体荧光基团，另⼀个为供体荧光基团，供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱，⾃由状态时只能检测到供体荧光基团发出的荧光。
退⽕时两条探针与⽬的基因特异性结合，形成⾸尾连接，两个荧光基团互相靠近，供体基团发出的能量激发受体基团发出荧光，检测时只检测受体基团发出的荧光。
只有当两条探针均与⽬的基因特异性结合时，才能检测到受体基团发出的荧光，因此检测的特异性⼤⼤增加。
⼆：杂交探针法FRET技术原理：罗⽒专利的FRET探针⼜称为双杂交探针，或者LightCycle探针。
FRET探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成（距离1—5bp），上游探针的3`端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5`端标记Red 640受体荧光基团。
当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受体基团紧密相邻（距离1—5bp），激发供体产⽣的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光。
当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波长的荧光。
FRET探针检测的信号是退⽕时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，⾮累积信号，可以⽤于做Tm曲线和SNP检测。
常⽤的受体荧光基团除了LC-Red640还有LC-Red705。
两个单标记探针的长短不影响信号的传递，⽽探针间的距离通常为1-5bp（虽然越短越好，还是要留点空间避免相互之间的反应）。
我们前⾯提到，Taqman⽔解探针法中，⼀但报告基团⽔解离开淬灭基团，就⼀直游离于反应体系中可被检测，所以检测的是累积荧光，是不可逆的。
杂交探针不同，是复性时两条特异探针杂交到模板上，相互靠近⽽产⽣检测信号，到升温变性探针远离模版就没有信号，所以检测的是实时信号，是可逆的，所以可以进⾏熔解曲线的分析，还可以⽤于进⾏突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别。
real time PCR
Real Time PCR 用途
定性分析
病毒和病原菌检测 生物品种鉴定
绝对定量
病毒和病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析
相对定量
差异显示结果验证 基因芯片结果验证 siRNA效果确认 mRNA表达量分析
SNP解析
全基因组单核苷酸序列多态（SNP）
GMO定量检测
基因修饰物质
（GMO）
操作简单，无需电泳，检测快速，降低污染几率， 适用于大量样品检测，检测灵敏度高； 可以在宽广范围内进行准确定量。
Real Time PCR 原理
Real Time PCR
使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物幵进行分析的方法。
发 射 激 光 发 光
Hale Waihona Puke Ct值real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质， 使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线。
Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-primer
PCR R-primer
RT Primer的选择
Random
5’
F
Real Time PCR 原理
同一个样品重复96次PCR的扩增曲线
Ct值
Real Time PCR 原理
阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上 设定的荧光检出界限。
Ct值概念
Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信 号达到设定的阈值时所经历的循环数。 ( C-代表Cycle，t-代表threshold）
real-time pcr名词解释
real-time pcr名词解释
外文名【Real-time Quantitative polymerase chain reaction】
中文名【实时荧光定量多聚核苷酸链式反应】
中文简称【实时荧光定量PCR】
外文简称【RT PCR】
【实时荧光定量PCR技术】，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
·
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
【技术原理】
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
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荧光定量PCR实验指南来源：易生物实验浏览次数：901网友评论0 条荧光定量PCR实验指南关键词：荧光实验指南第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“openentrezsequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“adda ll”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。
有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。
然后，点击“save”保存即可。
分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。
2、引物和探针设计2.1引物设计细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。
理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。
设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。
下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：²序列选取应在基因的保守区段；²扩增片段长度根据技术的不同有所分别：sybr green I技术对片段长度没有特殊要求；Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；²避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；²避免引物自身形成环状发卡结构；²典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm 值在55－65℃，GC含量在40%－60%；²引物之间的TM相差避免超过2℃；²引物的3’端避免使用碱基A；²引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。
²为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
2.2 Taqman 探针设计一般设计原则：²探针位置尽可能地靠近上游引物；²探针长度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。
²探针的5’端应避免使用碱基G。
²整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。
²为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
(www.nc /BLAST)2.3TaqmanMGB探针设计介绍MGB探针的优点：²MGB探针较短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。
²短片段探针(14-20bp)加上MGB 后，Tm值将提高10℃，更容易达到荧光探针Tm值的要求。
²MGB探针的设计原则²探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
²用primerexpress软件评价Tm值，Tm值应为65-67℃。
²尽量缩短TaqmanMGB探针，但探针长度不少于13bp。
²尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
²原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB 探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。
因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即TaqmanMGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。
注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP 检测。
反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。
若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。
有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。
另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。
2.4 实时多重PCR探针的选择：多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用不同的染料标记探针，在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物。
另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的目的片段，反应中加入SYBRN染料，最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。
多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：如同时为Taqman 探针、或同时为MGB探针、或同时为Beacon 探针。
在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析:设计好各对引物和探针后，重新在用DNAstar软件中的Primerselect软件，打开保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后，在“report”菜单下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。
弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。
3、影响PCR及荧光PCR的其他因素引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其重要。
可以说，不合理的设计意味着绝对的失败。
但是，好的设计并不等于好的实验结果，影响PCR和荧光PCR的因素非常多，下面择其重要进行介绍。
3.1引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。
Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
大部分计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
所有oligo软件会自动计算引物的Tm 值。
在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
3.2引物浓度引物的浓度会影响特异性。
最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。
较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。
为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。
然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。
微摩消光系数可以使用公式2计算。
与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。
这是因为引物较短，碱基组成差异很大。
在oligo软件上可以计算出引物的的消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。
一般商业合成的引物以O.D.值表示量的多少，在一般情况下，20个碱基长的引物，1个O.D.加100ul水后引物浓度为50pmol/ul （50μM）。
也可以用OLIGO软件，根据引物的的消光系数（OD/μmol），计算出一定的工作浓度下，引物的加水量。
浓度(μM)＝A260（OD/ml）×稀释系数×消光系数的倒数（nmol/OD）举例：计算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀释100倍（加入990μl）水中。
在A260处测吸光度为0.2。
计算消光系数的倒数为4.8nmol/OD，代入得：浓度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM3.3 引物、探针的纯度和稳定性定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。
部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。
这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。
这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。
在任何一个循环都可能失败。
较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。
定制引物以干粉形式运输。
最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。
也可以用双蒸水溶解。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。
以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。