流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等应用
流式细胞仪分选原理
流式细胞仪分选原理流式细胞仪是一种高效、快速、准确的细胞分析工具，它能够实现对细胞的快速分类、计数和分选。
其分选原理主要基于光散射和荧光信号的检测与分析。
本文将详细介绍流式细胞仪的分选原理及其应用。
一、光散射的检测与分析流式细胞仪通过激光束照射样品细胞，细胞与光发生相互作用后会发生光散射。
光散射分为前向散射、侧向散射和后向散射三种。
前向散射主要与细胞的大小和形状有关，可用来区分不同类型的细胞。
侧向散射则与细胞的复杂度和颗粒物含量相关，可用来评估细胞的复杂度和颗粒物含量。
后向散射则与细胞的内部结构有关，可用来评估细胞的核质比。
二、荧光信号的检测与分析流式细胞仪通过荧光染料标记的抗体或荧光染料直接标记的细胞，可以检测到细胞表面或内部相关蛋白、DNA或RNA的荧光信号。
这些信号可以用于检测细胞的免疫表型、细胞周期和细胞凋亡等生物学特性。
通过检测细胞的荧光信号，可以实现对不同类型细胞的快速分类和分析。
三、细胞的分选在细胞检测和分析的基础上，流式细胞仪还可以实现对特定类型细胞的分选。
分选是通过细胞仪中的细胞排序系统实现的，通常采用静电分选或压力分选的方式。
静电分选是通过根据细胞的光信号特征将其分为阳性和阴性细胞，然后通过高压电极将细胞引导到相应的收集器中。
压力分选则是通过调整细胞流速和压力差，使目标细胞以一定方式排列并被分选。
四、流式细胞仪在生命科学中的应用流式细胞仪在生命科学研究中具有广泛的应用。
首先，它可以用于免疫表型分析，通过检测细胞表面标记物的荧光信号，可以对细胞的免疫表型进行精确的鉴定。
其次，流式细胞仪可以用于细胞周期分析，通过检测DNA荧光信号的强度，可以确定细胞所处的不同周期阶段。
此外，流式细胞仪还可以用于细胞凋亡分析、细胞功能研究以及肿瘤细胞的分选等。
总结：流式细胞仪的分选原理主要基于光散射和荧光信号的检测与分析。
通过光散射可以评估细胞的大小、形状、复杂度和颗粒物含量等特征，而荧光信号则可以用于检测细胞的免疫表型、细胞周期和细胞凋亡等生物学特性。
流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)
流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis) 本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。
基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入EDTA以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。
由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。
由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。
另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。
Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。
它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。
所需试剂：1、PI染液：用于检测细胞周期的PI配制如下：方法一：10×PI配制方法,用时用PBS稀释至工作液：5mg-----PI0.1ml---Triton X-1003.7mg--EDTA10ml----PBS2、RNaseA——2mg方法二,直接配制PI工作液：PI -----5mgRNaseA——2mg1.0%Trition X-100——0.25ml枸椽酸钠——100mg生理盐水——65ml调pH值至7.2-7.5加蒸馏水至100ml, 棕色瓶分装，保存在4℃操作步骤1.细胞培养铺细胞至6孔板或者35mm培养皿，约4－5*10e5 cells/well, 如果要加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS 流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，可用于分析细胞数量、形态、存活率、细胞周期等多个参数。
下面将详细介绍如何利用流式细胞仪来分析细胞存活率、细胞周期和ROS （Reactive Oxygen Species）。
一、分析细胞存活率细胞存活率是研究细胞毒性或细胞凋亡过程中的重要参数。
在流式细胞仪中，常用细胞染色剂PI（Propidium Iodide）来评估细胞的存活率。
PI是一种能够穿透破损细胞膜并结合DNA的染色剂，可以通过荧光检测器来测量。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.加入适量的PI染色剂到细胞悬浮液中，一般终浓度为1-10μg/mL。
4.在黑暗条件下，在4°C冷藏室中孵育15-30分钟，避免光照和温度升高。
5.使用流式细胞仪进行测量。
设置PI染色剂的激发波长和检测通道，根据实验需要选择适当的过滤器。
6. 将细胞悬浮液转移到流式细胞仪的样本管中，进行数据采集和分析。
可以设置门控（gating）策略以排除细胞碎片和颗粒物。
通过分析样本中PI染色的细胞数量，可以计算出细胞的存活率。
二、分析细胞周期细胞周期分析是研究细胞增殖和凋亡机制的一项重要实验。
在流式细胞仪中，通过DNA染色剂染色和分析可以了解细胞的周期分布情况。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.用酒精或细胞固定液固定细胞，一般在-20°C的环境中固定20-30分钟。
流式荧光指数-概述说明以及解释
流式荧光指数-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述流式荧光指数是一种用于表征细胞或颗粒物的荧光强度的标准化指标。
在细胞生物学和免疫学领域，流式荧光指数广泛应用于细胞分析、蛋白质定量和荧光探针的评价等方面。
随着流式细胞术的快速发展，研究人员需要能够对复杂的细胞样品进行高通量的分析，并获得准确、可靠的数据。
然而，由于荧光信号的强度受到许多因素的影响，例如细胞数量、荧光染料浓度和仪器参数等，直接比较不同样品的荧光强度是困难的。
为了解决这个问题，流式荧光指数被引入。
它是通过将感兴趣的荧光信号与一个参考信号进行比较来计算得出的。
这个参考信号可以是内标，如细胞或颗粒物中存在的共表达荧光标记物，也可以是人工添加到样品中的标准物质。
通过使用流式荧光指数，研究人员可以消除实验条件和仪器参数的影响，从而得到更加准确和可比较的结果。
这对于比较不同样品之间的荧光信号强度，或者用于定量分析和更深入的数据挖掘是至关重要的。
流式荧光指数的应用领域非常广泛。
在免疫学研究中，它被用于表征细胞亚群的分布和活性，从而对免疫应答进行深入研究。
此外，在药物筛选、疾病诊断和检测等领域，流式荧光指数也发挥着关键的作用。
然而，流式荧光指数也存在一些局限性。
首先，选择适当的参考信号对结果的准确性至关重要。
错误的选择可能会导致结果的误差。
其次，流式荧光指数对实验设计和数据分析的严格要求，需要研究人员具备一定的专业知识和技能。
在未来，流式荧光指数将继续发展和完善。
新的计算方法和算法将被引入，以更精确地表征荧光信号强度和亮度。
同时，更多的应用领域将受益于流式荧光指数的应用，推动科学研究和临床诊断的进一步进展。
文章结构是指文章的组织和布局方式，它决定了文章内容的呈现方式和逻辑顺序。
本文将按照以下结构进行论述：1. 引言：- 1.1 概述：介绍流式荧光指数的背景和意义，引出本文的研究对象。
- 1.2 文章结构：说明本文的组织结构和各章节内容安排。
- 1.3 目的：明确本文的目标和写作意图，阐述对流式荧光指数的研究意义。
实验九流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相
发光源，激发波长为488nm，测定数据输入计算机，用Multicycle软件分析细 胞DNA含量。
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五、实验结果
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五、实验结果
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五、实验结果
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二、实验原理（continued）
● 流式细胞术（FCM，Flow Cytometry）：是对单个 细胞或其他生物微粒进行快速定性, 定量分析与分选 的一门技术。
● FCM是利用流式细胞仪(Flow Cytometer)分析在高压 高速下通过样品孔径的单个细胞, 在激光束的照射下 的发出的散射光和与细胞表面结合的荧光标记的单抗 的荧光信号。
实验九 流式细胞术分析细胞凋亡和 细胞周期时相
杭州师范大学 刘姬艳
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一、实验目的
1、了解流式细胞术（FCM，Flow 了解流式细胞术分析细胞凋亡的检测方法。 3、了解流式细胞术分析细胞群体DNA含量分布
的基本方法。
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二、实验原理
● 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性 的自杀现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细 胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。由于 这种死亡方式是由基因调控的死亡过程，因此又称之 为程序性细胞死亡(Programmed Cell Death)。
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二、实验原理（continued）
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二、实验原理（continued）
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二、实验原理（continued）
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二、实验原理（continued）
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二、实验原理（continued）
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流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用1. 引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学研究和临床诊断的技术。
通过使用流式细胞仪，可以对生物细胞进行快速、精准的多参数分析，为科学家和医生提供了大量的有关细胞的信息。
流式细胞术已成为生物学领域的重要工具，被广泛应用于细胞分析、免疫表型分析、药物筛选等领域。
2. 原理流式细胞术基于细胞在封闭流动系统中单个通过的原理。
其基本流程包括样本制备、细胞标记、细胞检测和数据分析。
2.1 样本制备样本制备是流式细胞术的第一步，它需要将待检测的细胞样本制备成单细胞悬浮液。
这可以通过细胞培养、组织切片或体液等方式获得细胞样本。
重点是要避免细胞凝聚和聚集，以确保细胞在流式细胞仪中单个通过。
2.2 细胞标记细胞标记是流式细胞术的关键步骤之一。
它使用荧光染料或抗体等标记物与目标细胞发生特异性反应。
荧光染料可以通过不同的通道发出不同波长的荧光信号，从而实现多参数分析。
细胞表面标记的抗体通常与荧光素共价结合，以产生可检测的荧光信号。
同时，可以利用染料进行细胞内部器官或分子的标记，以更详细地研究细胞的功能和结构。
2.3 细胞检测细胞检测是流式细胞术中最关键的步骤之一。
它通过流式细胞仪将标记后的细胞悬浮液以单个细胞的形式通过单个检测区域。
这些细胞在流式细胞仪中被激活并产生荧光信号。
光电传感器将捕获和记录这些荧光信号，并将其转化为数字信号，供数据分析使用。
2.4 数据分析数据分析是流式细胞术的最后一步。
通过对获得的荧光信号的数字化处理，可以获得有关细胞的详细信息，包括细胞表面标记物的表达水平、细胞数量统计、细胞大小等信息。
数据分析可以使用专业的流式细胞仪软件完成，也可以使用其他数据分析软件进行更复杂的数据处理。
3. 应用流式细胞术作为一种全面、高通量的细胞分析技术，广泛应用于各个领域。
3.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中得到了广泛应用。
通过对免疫细胞的表面标记物进行检测，可以评估免疫细胞亚群的数量、功能和表达水平。
流式细胞仪检测凋亡
流式细胞仪检测凋亡细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。
由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。
因此，具有其它方法无可比拟的优越性。
本文主要结合我室的一些实际经验，力图简单明了的介绍流式在检测凋亡方面的应用。
下面是一幅凋亡过程图。
在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。
在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经检测过的方法包括：1线粒体功能2DNA Cycle3 Caspases4Annexin V Assay6DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。
其检测主要采用阳离子型荧光染料。
原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。
可以在荧光显微镜下，或流式检测。
采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。
整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。
Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。
即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。
在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。
Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。
流式细胞仪常用的几种检测方法
流式细胞仪常用的几种检测方法1.细胞计数和生存率检测：流式细胞仪可以通过测定细胞的大小、形状和胞内染色物来实现细胞计数和生存率的检测。
通过自动聚焦和自动获取图像的功能，可以对大量的细胞进行计数和分析，并得出生存率数据。
2.表面标记检测：流式细胞仪可以利用荧光染料或荧光标记抗体对细胞表面的蛋白质、糖类或其他生物分子进行检测。
这种检测方法主要用于检测细胞表面标记的数量和分布情况，例如测定细胞表面特定抗原的表达水平。
3.细胞周期分析：流式细胞仪可以通过染色剂或荧光标记抗体对细胞进行染色，然后分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。
这种检测方法可以用于研究细胞的增殖能力、细胞周期调控机制以及细胞周期与疾病发展的关系。
4.细胞凋亡检测：流式细胞仪可以利用染色剂或荧光标记抗体对细胞凋亡的标志物进行检测。
凋亡是细胞死亡的一种形式，通过测定凋亡细胞的数量和凋亡标志物的表达水平，可以研究细胞凋亡的调控机制以及细胞凋亡与疾病的关系。
5.细胞功能检测：流式细胞仪可以通过检测细胞内Ca2+浓度、ROS （活性氧物种）水平、蛋白质磷酸化等细胞功能指标来研究细胞的信号转导和功能活性。
例如，利用荧光染料可以测定细胞内钙离子的浓度变化，以研究细胞响应外界刺激的机制。
此外，流式细胞仪还可以进行细胞分选、多色细胞分析和细胞细胞间相互作用的研究。
细胞分选功能可以根据细胞标记物的表达水平将细胞分离出来，用于研究特定功能细胞的特性。
多色细胞分析可以用于同时检测多种标记物的表达水平，以揭示不同细胞类型的分子特征。
细胞间相互作用的研究可以通过检测细胞间的共聚或共表达标记物来研究细胞间的相互作用和相互影响。
总的来说，流式细胞仪是一种功能强大的实验室设备，常用于细胞生物学和疾病研究。
通过不同的检测方法，可以在细胞水平上研究细胞的数量、表面标记、周期、凋亡、功能以及细胞间相互作用等方面的特征。
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Flow Cytometry
什么是流式细胞仪
●流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
一、 概述
1. 发展历史 1934 Moldavan 1973 Steinkamp
2. 定义：对在高速流动的鞘液包括下对特异荧 光标记的细胞、粒子进行分析和分选的技术.
基本结构
流动室和液流系统； 激光源和光学系统； 光电管和检测系统； 计算机和分析系统。
三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数 非荧光信号
颗粒度
细胞大小
= 前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积 = 侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的
相对复杂性
血液涂片
外周全血细胞散射光双参数点图
凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降 解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处 理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解 的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量 减少，成为亚2倍体。
二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究
1. 肿瘤诊断
DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志 细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物
流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等 应用
DNA细胞周期分析
G2 M
G0
G1
细
s
胞 数
量
细胞周期
DNA分析
G0G1
s G2M
2N
200
400
4N DNA含量
600
800
1000
肿瘤组织中的各种DNA倍体
2倍体
异倍体
4倍体
含量与凋亡关系
DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有 亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。
二、流式细胞仪的工作原理和基本结构
待测细胞以单个细胞的悬液，经特 异性荧光染料染色，放入样品管， 吸入流动室。
流动室充满鞘液，作用：约束样品 在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔 壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷 嘴中心喷出，形成细胞液柱。
液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。
……
一） 细胞DNA含量检测
细胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙啶）， 染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度 与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍 体以及凋亡的检测。
单参数直方图
图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表 S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图
3. 特点 测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个 细胞 可进行多参数测量 在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，即分选技术。
4. 应用范围
凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细 胞仪检测。
前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光 源激发
在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机 多用的仪器。
106 7 10.08 816 .8 6 468 .8 9 529 1 49.98 19.57 4.41 397 5 37.55 418 .8 0 9.87
图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死
流式细胞仪数据分析
点图分析
流式细胞仪数据分析
直方图分析
图中100～101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞
Annexin V Assay
R1
Fi le : 4
Acq ui si ti on Date: 0 6-Ma r-03
Quad UL UR LL LR
Eve nts % Ga te d X Mean Y Mean 254 2.40 37.47 461 .3 6
学特征 利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA
倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病 变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。
肿瘤组织中的各种DNA倍体
2倍体
异倍体
4倍体
2. 凋亡研究
在 G0/G1 峰 前 出 现 一 个亚二倍体峰，即凋 亡峰。
检测调亡，可进行抗 肿瘤药物研究和某些 因素对细胞的损伤机 理的研究。
量有关，在正态分布时一般用该值。 Geo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞
为偏态分布时一般用该值。
散点图
密度图
二维等高图
直方图
图 报告中常见的几种流式细胞图
R1
Fi le : 4
Acq ui si ti on Date: 0 6-Ma r-03
Quad UL UR LL LR
Eve nts % Ga te d X Mean Y Mean 254 2.40 37.47 461 .3 6
荧光信号
荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的 荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。 有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳） 高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）
一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出 三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个 或三个激光光源（488nm、633nm和325nm），可测出6个 FL。
荧光信号与细胞特性
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色
荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
光信号收集
光信号分离，导向 各探测通道接收并转化为电信号。
激光束
侧向散射 光，荧光
二色镜
1
2
3
细胞Βιβλιοθήκη 前向 散射 光收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
三 数据处理及流式报告
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
对数 线性
电信号
线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换 （面积，峰高，宽度）
记录数据，显示结果
流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方
图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点
图和直方图。
几个概念： %Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中
阳性细胞的数量。 Mean：平均荧光强度，与被检测物质的表达
五、 流式细胞术的应用
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞
周期 RNA含量 蛋白质含量
……
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗 原
• 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位