基因检测技术在肺癌精准治疗中的应用-靶向捕获测序与ddPCR比较
【肺癌篇】精准医疗到底精准了啥看看在肺癌治疗中的进展
【肺癌篇】精准医疗到底精准了啥？看看在肺癌治疗中的进展肺癌是临床精准医疗研究较为成熟的一种疾病，目前已找到一系列相关的疾病驱动基因，如EGFR、ALK、ROS1等，并开发出了相应的靶向药物，如吉非替尼、西妥昔单抗等。
虽然靶向药物治疗比传统化疗效果更好，但只有携带特定透分子遗传标记的人群才可从中受益，且在使用过程中容易产生耐药性，这些都极大影响了靶向药物的临床应用。
下文主要探讨精准医疗在肺癌研究中的进展。
肺癌分子特异性差异显著测序技术的发展为肿瘤发生机制的探索带来了新的契机，研究发现肺癌患者体内可以改变正常蛋白表达的基因突变高达150种，比其他的恶性肿瘤高出30-60倍，这可能是肺癌发生率偏高的原因之一。
目前临床已经完成对肺腺癌、肺鳞癌及小细胞肺癌（SCLS）样本的全基因组测序，结果收录在美国癌症和肿瘤基因组数据库（TCGA）中。
这些测序结果揭示了肺癌患者中的基因突变（突变或拷贝数变化）模式，如图1所示。
图1 不同组织类型肺癌基因突变分子模式测序结果显示无论哪种类型的肺癌患者，TP53都是突变频率最高的基因（肺腺癌中为46%，小细胞肺癌中为86%），但3种组织类型的基因突变图谱差异显著：肺腺癌中除了TP53以透外的另4种突变频率最高的基因为KRAS、CDKN2A、MLL3和STK11，鳞癌则为PIK3CA、SOX2、CDKN2A和TP63，而小细胞肺癌则是RB1、EP300、MLL2和SMO。
虽然这些突变都可能改变关键蛋白的表达水平或蛋白构象，导致正常生理功能发生改变，从而促进癌症的发生发展（如KARS基因突变后其产物构象发生变化，激活了下游信号通路，诱导癌变发生），但目前临床开发的靶向药物还非常少，只有有限的几种靶向药物，如靶向EGFR的药物如吉非替尼、埃罗替尼及阿法替尼及靶向ALK、ROS1和MET的克里唑替尼等。
肺癌治疗之EGFR靶向治疗表皮生长因子受体（EGFR）是肺癌的主要驱动基因，也是目前临床应用比较成熟的靶向治疗基因，该突变在3种肺癌中都能检测到，肺腺癌患者中最高，常见于女性或非吸烟患者。
DDPCR技术单细胞级别健康基因常态分布研究的新里程碑
DDPCR技术单细胞级别健康基因常态分布研究的新里程碑在过去的几十年中，基因研究领域取得了巨大的突破，从而使我们对基因如何影响健康和疾病的理解更加深入。
其中，单细胞级别的研究对于揭示人类基因表达的整体模式以及疾病发展的分子机制至关重要。
最近，一个名为数字式PCR（Digital Droplet PCR，简称DDPCR）的新技术在单细胞级别健康基因常态分布研究方面取得了重要进展，这标志着这一领域的一个新的里程碑。
DDPCR技术是PCR技术的一种改进型，它具有高度分辨率和灵敏度的特点，可以在单细胞水平上精确测量基因表达。
与传统PCR技术相比，DDPCR技术通过将样本分成大量的微小液滴，每个液滴中仅含有一个细胞和一份DNA模板，从而避免了PCR反应中的扩增偏差。
通过实时监测每个液滴中的反应结果，DDPCR技术可以准确测量出单个细胞中每个基因的表达水平。
最近，科学家们利用DDPCR技术在单细胞级别对健康基因的常态分布进行了详细研究，并取得了一系列有意义的发现。
首先，在健康人群中，研究人员发现了大量基因表达的变异性，这些变异性反映了不同个体之间的基因表达模式的差异。
通过对多个器官和组织的单细胞样本进行分析，科学家们可以绘制出健康人群中基因表达的整体模式图，从而深入了解基因在不同细胞类型和组织中的表达差异。
更重要的是，这项研究还揭示了许多基因的表达在细胞之间存在明显的异质性。
在单细胞级别，同一种细胞类型中的不同个体之间存在着基因表达的差异，这提示了基因在细胞分化和分裂过程中的动态变化。
此外，研究人员还发现了一些基因的表达在特定细胞类型中呈现出明显的“噪声”特征，这可能与基因调控网络的复杂性以及个体差异有关。
通过DDPCR技术的应用，研究人员还得以对健康基因表达的异常情况进行深入研究。
他们在癌症患者的单细胞样本中发现了许多异常基因表达的模式，这些模式可能与癌细胞的发展和转移有关。
此外，研究人员还发现了一些潜在的健康基因变异，这些变异可能会增加患者患上某些疾病的风险。
基因检测技术在肺癌精准治疗中的应用靶向捕获测序与ddpcr比较
EGFR L858
通过等位基因突变频率在结合样本病理评估中的肿瘤细胞占比，我们能够对肿瘤内 部带有不同驱动基因的肿瘤细胞亚克隆有一个大致的比例上的了解。对了解肿瘤异 质性有帮助。
NGS和ddPCR都可分辨分子顺式/分子反式
基因检测技术在肺癌精准治疗中的 应用靶向捕获测序与ddpcr比较
测序技术的发展带来靶向治疗的纵深研究
Li TH, et al. J Clin Oncol 31:1039-1049
PCR技术也经历了3代的进化
对NSCLC驱动基因的认知随着分子检测技术 的进步在不断深入
Ashley J. Vargas et al，Nature Reviews Cancer 16, 525–537 (2016)
NGS与ddPCR在肺癌8基因检测对比
NGS组织
NGS血液
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
可以
难
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
ddPCR组织 已知 已知 已知 已知 很好 已知 已知 已知
约3/4 ALK融合为经典的EML4-ALK融合， 但有1/4为与其他基因的融合，包括：
• STRN-ALK • CATSPERB-ALK • ACVR1-ALK • CLIP1-ALK • DPH6-AS1-ALK • KIF5B-ALK • RP11-320M2.1-ALK • UGP2-ALK
基因检测+ 靶向药物:一把钥匙打开一把锁
基因检测+ 靶向药物:一把钥匙打开一把锁作者：史美琪、赵怡卓来源：《祝您健康》 2019年第5期【受访专家】史美祺江苏省肿瘤医院肿瘤内科主任医师赵怡卓上海交通大学医学院附属胸科医院呼吸内科主任医师〇肿瘤患者的希望:靶向药物2019 年4 月1 日,陈先生(化名)为患肺癌的母亲取靶向药吉非替尼。
拿到收费单,陈先生的脸上露出了惊喜的笑容,药价从每盒1580 元降到了498 元,每个月的经济负担减少了2/3。
自今天起,治疗晚期肺癌的国产靶向药伊瑞可(吉非替尼片)的药品价格大幅下降,江苏率先实施新价格,陈先生的母亲幸运地成为首批受惠患者。
据江苏省肿瘤医院肿瘤内科史美祺主任介绍,肺癌的发病率和死亡率在我国都是第一位。
我国每年近80 万的肺癌新发患者,至少20 余万人有EGFR 基因突变,加上很多已经在接受EGFR TKI 治疗的老患者,总计百万以上的患者目前都在使用这类靶向药物。
吉非替尼药物价格调整后,这些家庭都将可能从中受益。
何为靶向药物?靶向药物是随着当代分子生物学、细胞生物学的发展产生的高科技药物,它通过与癌症发生、肿瘤生长所必需的特定分子靶点的作用来阻止癌细胞的生长。
史主任介绍,我国肺癌大多为中晚期,在没有靶向药的时代,晚期患者的中位生存期能有一年就很不容易了。
而靶向药物的出现给有基因突变的晚期肺癌患者带来了生机。
早年美国的《自然》杂志曾这样报道,“神奇的小药丸,每日一粒,就可把病控制住”。
吉非替尼片对亚裔患者疗效尤为显著,因此被誉为“上帝送给亚裔患者的礼物”,成为肺癌患者心中的明星抗癌药。
国内很多晚期肺癌患者的生存期从不到1 年,到现在超过2 年,甚至8 年、10 年或更长时间都有可能,他们的命运就此改变。
尽管靶向药物疗效很好,但对绝大多数癌症患者来说,却是可望而不可即。
2018 年7 月,一部火爆全国,名为《我不是药神》的电影,就讲述了肿瘤患者因无法承受抗癌药物的高昂价格,想尽办法、历尽艰辛求药的故事。
靶向PCRCTC检测技术帮助临床医生更全面地评估肺癌
Lung Cancer in Solid Tumor in China
？
=
液态活检
通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基 因组信息来评估肿瘤
病理活检
通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤
CTC ctDNA
mircoRNA LNC RNA
Others
传统的组织细胞学检测
W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007
CTC富集技术
CTC检测技术
CTC 检测方法
=
✓ 密度与大小
✓ 免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集)
+
✓ 靶向PCR ✓ 免疫荧光
✓ 普通PCR
✓ 微流体
负向富集
优势：回收率100% 劣势：纯度略低
正向富集
优势：纯度高 劣势：回收率低（漏掉CTC）
检测原理
FR阳性靶标
负向富集
靶向PCR
•肺癌细胞FR(叶酸受体）高 度表达 •CTC：FR=1:50万 •EMT转化不影响FR丰度 •其他血细胞不表达FR
•CTC回收率接近100% •磁珠富集易操作和自动化
•灵敏度超高，负向富集可满足 检测要求 •信号二次放大，1个CTC信号 放大10^12倍 •无需人工经验判读，结果客观 准确 •可实现CTC的定量
称之为DTC（disseminated Tumor Cell）， 只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微 转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿 瘤远处转移2
肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少， 可间接反应肿瘤发生发展的功能状态
1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015
ngs肺癌临床应用PPT课件
4
测序成本迅速下降，超过了摩尔定律 Cost is Decreasing Exponentially, Beating Moore’s Law
单人全基因组测序成本（美金）：
HGP: $3 Billion
2004: $30,000,000
2008: $100,000
2010: $10,000
2011: $4,000 2014: $1,000
Sequencing Gets Cheaper and Faster
???:
$100
5
目前高通量测序大量应用于国内外临床癌症研究
2013年NEJM发表的临床文献，43%运用高通量技术
6
21世纪的癌症分型需要病理和分子联合进行
– ASCO 2014, Chicago, Dr. M Stratton ( 英国首相医学顾问）
结论：
• •OIVS多期因PI素3K分异析常：肺考鳞虑癌到患年者龄的、生性存别较、差KPS因素后，仍然显示PI3K与生存期短相关
• 脑转移在PI3K异常的患者中更常见，且仅出现在PI3K异常的患者中 - • HPRI3K=通3.路3，活(9化5具%C有I:1不.5同-7的, p生=物0.0学3特) 点，以该通路为靶点的治疗方法可能是伴脑转移的肺鳞
VHL1 1.4% PTPN11 GNAS
0.7% 0.7%
MLH1 4.9%
PIK3CA 14.1%
EGFR 43%
KRAS 17.6%
140例日本肺腺癌
与欧美人群不同，EGFR依然是亚裔腺癌最常见的驱动基因
Koh Y, et al. 2013 ASCO Abstract 7572. Wu YL, et al. 2011.
微滴度PCR(ddPCR)的原理和最新应用
+
Throughput Cost
++++ + + +
+++
Low High Very High High Moderate
Abs. Quant
+ NA NA ++ ++++
ddPCR尤其适合：
基因相对表达变化差异较小（<2倍）的研究
低丰度基因或单细胞的表达分析，以及RNA编辑、等位基因差异 表达等研究
（by 澳大利亚国家计量院）
（DNA定量分析、绝对定量）
ddPCR的技术特征（二） ：优秀的准确度、精密度和重复性
（肿瘤相关microRNA定量分析、方法学对比）
ddPCR的技术特征（三）：对PCR抑制剂的容忍度更高
背景：验证抑制剂对ddPCR反应结果的影响 方法：采用经验证的CMV qPCR体系对UL123 和UL55进行扩增，并加入SDS、EDTA和肝素 作为抑制剂
案例2：单细胞基因表达分析
热休克蛋白在环境胁迫响应中的作用，及其与神经紊乱的关联
来自精神分裂症（SZ）患者 的神经前体细胞（NPC）， 在面对环境刺激（酒精、甲 基汞）时，HSP70的表达量 会上升
单细胞ddPCR 定量HSP70 mRNA
( Yale University School of Medicine)
案例2：肝癌患者体内乙肝病毒HBV 的拷贝数检测
实验结论： 1、ddPCR的灵敏度和准确度比real-time PCR更高——131个待测样
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用发布时间:2014-07-19 来源:毕业论文网随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。
与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。
从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序 (next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。
其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。
2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因 PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。
同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。
此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。
2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。
近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。
同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。
目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。
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EGFR L858
通过等位基因突变频率在结合样本病理评估中的肿瘤细胞占比，我们能够对肿瘤内 部带有不同驱动基因的肿瘤细胞亚克隆有一个大致的比例上的了解。对了解肿瘤异 质性有帮助。
NGS和ddPCR都可分辨分子顺式/分子反式
约3/4 ALK融合为经典的EML4-ALK融合， 但有1/4为与其他基因的融合，包括：
• STRN-ALK • CATSPERB-ALK • ACVR1-ALK • CLIP1-ALK • DPH6-AS1-ALK • KIF5B-ALK • RP11-320M2.1-ALK • UGP2-ALK
• 1987年，KRAS基因突变在当时50%的肺腺癌患者中被发现。 • 2004年，EGFR突变作为新的肺腺癌驱动基因被发现。 • 2014年，随着TCGA计划的完成，肺腺癌的基因突变图谱被进一步完善。
NGS在肿瘤临床领域的应用
组织
遗传易感性 伴随诊断用药指导
良恶性判断 复发与疾病进展监控
早期筛查
ddPCR血液 已知
难（已知） 已知 已知 好 已知
难（已知） 已知
NGS能够覆盖传统方法和ddPCR无法检测的突变种类
• MET 14 exon skipping，HER2 20 exon insertion等情况复杂的突变 • EGFR等热点基因的非热点突变位点 • ALK等热点基因的非常见融合方式 • 罕见的EGFR-19Del 可能会造成PCR方法假阴性
NGS与ddPCR在肺癌8基因检测对比
NGS组织
NGS血液
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
可以
难
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
ddPCR组织 已知 已知 已知 已知 很好 已知 已知 已知
NGS能够发现新的耐药机制
发现AZD9291获得性耐药机制---C797S突变
15例患者一代TKI进展， T790M+，应用
AZD9291后耐药，经检 测发现三种类型：
6例出现C797S 5例仍保持T790M，无 C797S T790M消失
Thress KS et al, Nat Med.2015 Jun;21
有研究发现T790M和C797S突变分子顺式/分子反式信息影响EGFR TKI治疗疗效； NGS和ddPCR都能够提供EGFR突变的in cis/in tran信息，具有重要的临床意义， 传统PCR检测则会遗漏这一信息；
K.S. Thress, et al. Nat Med, 2015. 21(6): p. 560-562.
与EGFR不同ALK-TKI的耐药机制更加复杂
• NGS检测EGFR和ALK的 耐药位点都没有问题。
• ddPCR只能做T790M这 种比较集中出现的耐药位 点检测。
随着建库技术和生物信息分析策略的进步NGS液体 活检敏感性已经远超ddPCR
NGS检测能够帮助分析肿瘤克隆的进化
评论：相比反复活检 在临床面临的巨大挑 战，ctDNA动态随访 是对肿瘤克隆进化监 控的最佳方式
血液
NGS在肺癌临床领域的应用
非小细胞肺癌
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ遗传易感性
伴随诊断用药指导 良恶性或分子分型
NG + ddPC
S
R
复发与疾病进展监控 早期筛查
NG + ddPC
S
R
NG S
肿瘤的异质性对传统分子组织诊断提出了挑战
NGS和ddPCR都能够报告等位基因突变频率， 反映不同亚克隆的比例关系
NGS和ddPCR都是通过计算，看检测出多少带有突变的DNA（突变型），和 检测到的所有的DNA（野生型+突变型）的比值来确定等位基因突变频率 （AF）。
测序技术的发展带来靶向治疗的纵深研究
Li TH, et al. J Clin Oncol 31:1039-1049
PCR技术也经历了3代的进化
对NSCLC驱动基因的认知随着分子检测技术 的进步在不断深入
Ashley J. Vargas et al，Nature Reviews Cancer 16, 525–537 (2016)
N. Rizvi et al, Science, vol 348, 2015
基于NGS的血液DNA甲基化检测能够满足肺癌 早诊的需求
Delpu et al. Int. J. Mol. Sci. (2013) PNAS
感谢聆听
基于靶向捕获的NGS能够同时检测已知突变 和未知突变
ddPCR
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Capture NGS
检测基因
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NCCN指南建议初诊患者进行多靶点平行检测
针对非小细胞肺癌的8个基因NGS可以完全覆盖
检测基因型 EGFR突变 ALK融合 HER2突变 BRAF突变 MET扩增 MET14外显子跳读 ROS1融合 KRAS突变
在肿瘤克隆进化的过程 中，劳拉替尼耐药相关 亚克隆L1198F重拾对克 唑替尼的敏感性
Shaw AT et al, N Engl J Med. 2016;374(1):54-61. Bordi P et al, N Engl J Med. 2016;374(18):1790.
全外显子测序结果有助于评估接受免疫治疗的患者预后