实验生物学_细胞基因操作
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
高中生物基因重组实验教案
高中生物基因重组实验教案
实验目的：通过本实验，学生可以了解基因重组技术的原理和应用，掌握基因工程的基本操作技能。
实验材料：
1. 大肠杆菌菌种
2. 质粒DNA
3. 荧光素底物
实验步骤：
1. 将质粒DNA和大肠杆菌菌种分别取出，让其回温至室温。
2. 在洁净的实验台上，取出一个无菌平板，将大肠杆菌菌种均匀涂抹在平板上。
3. 利用移液枪或其他合适的工具，向大肠杆菌菌种中转染质粒DNA。
4. 将转染后的大肠杆菌平板进行培养，并在适当的温度下放置一段时间。
5. 观察培养后的大肠杆菌菌落，通过照射荧光素底物，观察是否有发光现象。
6. 如有发光现象，则说明成功实现了基因重组。
实验注意事项：
1. 实验中所有操作都需在洁净环境下进行，避免外部杂质的干扰。
2. 质粒DNA和大肠杆菌菌种皆需在合适的保存条件下保存，避免受到污染或损坏。
3. 实验中使用的荧光素底物需遵循生物安全规范使用，避免对环境和个人造成伤害。
拓展实验：
1. 可以尝试使用不同种类的质粒DNA和大肠杆菌菌种进行实验，观察不同基因组合的结果。
2. 可以了解基因重组技术在医学、农业等领域的应用，深入探讨基因工程的潜力及争议。
实验总结：
通过本实验，学生可以了解基因重组技术的基本原理和操作方法，培养实验操作能力和科学思维。
同时，也能够拓展对基因工程技术的认识，为未来的学习和研究奠定基础。
医学细胞生物学实验
细胞凋亡诱导与检测
细胞凋亡检测
细胞凋亡诱导
自噬诱导
通过饥饿、药物刺激等手段诱导细胞自噬，以研究自噬的生物学意义和作用机制。
自噬检测
采用荧光染色、电镜观察、蛋白质印迹等方法检测自噬体的形成、数量和相关蛋白的表达。
自噬诱导与检测
03
02
01
实验原理
实验设计
根据实验目的和原理，设计具体的实验方案和操作流程。
实验操作
按照实验方案进行实验操作，包括细胞培养、显微观察、分子生物学检测等步骤。
数据收集与分析
收集实验数据，进行统计分析，得出实验结果。
结果汇报与讨论
将实验结果以书面形式汇报，并进行讨论和总结。
实验步骤
02
细胞培养
CHAPTER
利用免疫荧光染色、荧光共振能量转移等技术，可以检测和定位细胞内特定信号分子的分布和动态变化，进而揭示其在信号转导中的作用机制。
详细描述
总结词
信号转导抑制剂的应用
总结词：信号转导抑制剂是一类能够干扰细胞信号转导过程的化合物，具有潜在的治疗作用。
07
细胞凋亡与自噬研究
CHAPTER
通过使用化学物质、射线、病毒等手段诱导细胞凋亡，以研究其发生机制和生物学意义。
电子显微镜
利用电子束代替可见光，观察细胞超微结构。
显微镜观察
通过显微镜或细胞计数板，统计细胞数量。
细胞计数
利用染色剂或荧光染料，检测细胞活性，如MTT法、染色排除法等。
细胞活力检测
细胞计数与活力检测
利用染色剂对细胞进行染色，以便观察细胞形态和结构。
染色技术
《生物学实验操作手册》
生物学实验操作手册1. 实验介绍在本操作手册中，将为您提供一系列生物学实验的操作指南。
这些实验涵盖了从基础的生物学概念到高级的实验技术。
通过遵循本手册中的步骤，您将能够掌握各种生物学实验的基本操作和技能。
2. 实验分类2.1 细胞生物学实验•环境对细胞形态的影响：包括温度、pH值、离子浓度等因素对细胞形态和功能的影响。
•染色体核型分析：使用显微镜观察染色体，并进行核型分析。
•细胞培养与维护：培养和繁殖不同类型的细胞系。
2.2 分子生物学实验•蛋白质表达与纯化：利用细菌或其他表达系统表达目标蛋白，并进行纯化。
•DNA/RNA提取和纯化：从生物样品中提取DNA/RNA，并进行纯化。
•PCR扩增：使用聚合酶链反应（PCR）方法扩增目标DNA片段。
2.3 遗传学实验•杂交与基因组分析：通过杂交实验和基因组分析确定遗传物质的传递方式。
•基因突变分析：利用不同突变体进行基因功能鉴定。
•遗传连锁和基因定位：通过遗传连锁和基因定位方法确定基因的位置。
3. 实验步骤示例3.1 细胞生物学实验中的步骤示例实验名称：观察温度对细胞形态的影响1.准备培养细胞所需的培养基及培养器具。
2.将细胞接种到已经预先消毒并加入培养基的培养皿中。
3.设立不同温度条件下的实验组，将培养皿置于恒温箱中。
4.观察细胞在不同温度条件下的形态变化，并记录相应数据。
5.结束实验后，根据数据结果进行统计和分析。
3.2 分子生物学实验中的步骤示例实验名称：DNA提取与纯化1.准备待提取DNA的生物样本，如血液或植物组织等。
2.使用特定试剂对样本进行细胞破碎和溶解。
3.添加相关酶和缓冲液，促使DNA释放并与其他细胞组分分离。
4.经过离心等步骤，收集纯化后的DNA溶液。
5.使用吸光光度计或凝胶电泳等方法检测DNA提取纯度和浓度。
3.3 遗传学实验中的步骤示例实验名称：杂交实验确定基因型1.准备不同基因型的个体进行交叉杂交。
2.收集得到的杂种后代，并对其表型进行观察和记录。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述............................................................................. 错误!未定义书签。
一、聚合酶链式反应(PCR) ............................................................. 错误!未定义书签。
二、质粒概述................................................................................... 错误!未定义书签。
三、凝胶电泳................................................................................... 错误!未定义书签。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化....................................... 错误!未定义书签。
五、重组质粒的连接....................................................................... 错误!未定义书签。
六、限制性内切酶消化................................................................... 错误!未定义书签。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳........................................................... 错误!未定义书签。
第二节材料、设备及试剂..................................................................... 错误!未定义书签。
细胞生物学的实验方法与技巧
细胞生物学的实验方法与技巧细胞生物学是研究细胞结构和功能的科学领域。
在细胞生物学中，实验方法和技巧是非常关键的。
细胞生物学的实验技术涉及到多种技术和方法，包括细胞培养、细胞分离、荧光显微镜、分子生物学等等。
在本文中，我们将会详细讨论细胞生物学中的实验方法和技巧。
一、细胞培养技术细胞培养技术是研究细胞生长、增殖、衰老等生理状态的一种重要的实验技术。
细胞培养技术通常需要使用一个适宜的培养基，该培养基还需要添加适当的营养物质和培养物质。
在培养细胞时，需要注意适宜的温度、湿度、和二氧化碳含量等因素，这些因素可以影响细胞的状态和生命活动。
另外，在细胞培养中，不可避免地会遇到一些问题，例如细胞的寿命、细胞的死亡、菌污染等问题。
为避免这些问题，需要在实验中采取一些必要的预防措施。
例如，可以使用无菌操作技术，采用CDMF等杀菌剂消毒培养器、培养器中的培养物料，这样可以有效防止细胞因菌污染而死亡。
二、细胞分离技术细胞分离技术是研究细胞的单个特性、形态和功能的一种技术。
在实验中需要利用细胞分离技术来获得一定数量的单个细胞。
细胞分离技术有多种方法，包括分离器分离、离心分离、胶体分离和酶消化等，每种方法都有其优缺点。
其中，酶消化是一种比较常见的细胞分离方法，通过加入一定量的酶，将组织内的胶原纤维、纤维素及其他基质物质消化掉，从而获得单个细胞。
在酶消化实验中，需要根据不同细胞类型、不同组织、不同生长状态等因素进行调整，以获得最佳效果。
三、荧光显微镜技术荧光显微镜技术是一种广泛用于生物学和生命科学中的高级显微镜技术。
在细胞生物学研究中，荧光显微镜技术是最常用的技术之一，因为它可以用来标记和检测细胞内的各种生物大分子，如蛋白质、核酸、酶等。
在荧光显微镜实验中，使用的荧光探针要与待检测的细胞相匹配，例如，使用荧光染料DPH来探测细胞内外膜分子的相互作用。
同时，还需注意荧光显微镜的光源选择、荧光图像的采集和分析等问题，以获得高质量的研究数据。
基因操作上下游技术大实验
基因操作上下游技术大实验Gene Manipulation Technology Experiment in up & downstream 一、课程基本信息学时: 60学分: 2.0考核方式：考查(实验中的平时成绩占30%,实验报告成绩占70%)中文简介：广义的基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是外源基因重组、克隆、表达的设计与构建，下游技术则涉及含有重组基因的生物细胞（生物工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。
上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想，而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现与保证。
基因工程技术的核心内容之一基因操作技术，基因操作技术的关键环节包括目的基因的DNA片断与载体的连接（也称为重组DNA 分子），重组载体转化到宿主细胞中，载体在宿主细胞内大量繁殖，同时重组体DNA拷贝也转移到子细胞中，随着载体进一步复制，重组体所携带的目的基因就被克隆了。
由于分子生物学和基因工程技术的快速发展，对基因工程技术的理论和实践在各个层面上均产生了巨大的推进和影响作用。
本实验课程是与基因工程、基因工程下游技术专业课的理论课程相关的实验操作内容，该课程作为一门独立开设的必修课，需要以基因克隆技术的理论内容为基础，其教学目的是为培养学生分析问题和解决问题的能力，提高学生在基因操作方面的动手能力，通过实验，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，掌握植物DNA提取方法和质粒DNA的提取DNA酶切、片段回收及重组连接、感受态细胞制备、重组基因转化的关键技术。
该课程在的教授对象是生物科学专业（生物安全与检验检疫）本科生，本专业是一个多学科交叉、宽口径设置的新专业。
该课程在该专业的人才培养体系中占有很重要的地位，为了培养学生具备扎实的动植物检验检疫专业基础理论，具有分析检测技术和综合执法政策水平，具备动植物检验检疫工作实际技术操作和执法水平的能力。
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验
1.基因克隆：通过PCR扩增目标基因或外源基因，将其克隆到载体中，如质粒、病毒等，使其能够在宿主细胞中表达。
2. PCR：聚合酶链式反应，是一种可在体外扩增DNA序列的技术，适用于从少量DNA样品中扩增特定区域的DNA片段。
3. 蛋白质表达与纯化：通过基因克隆，将目标蛋白质表达于宿主细胞中，并通过蛋白质纯化技术将其纯化出来。
4. DNA测序：通过测序仪对DNA序列进行测定，可以用于基因组测序、基因突变分析等。
5. RNA干扰：通过RNA干扰技术，将RNA分子导入到细胞中，靶向特定的基因，从而抑制基因表达。
6. 细胞培养：将细胞放入培养皿中，提供合适的营养物，使其在体外生长并繁殖，可用于体外实验研究。
以上是分子生物学实验室常见实验，这些实验技术广泛应用于生命科学领域的基础研究和应用研究，为疾病诊断和治疗等方面提供了重要的科学支持。
- 1 -。
高中生物基因育种实验教案
高中生物基因育种实验教案实验目的：通过观察不同基因型的果蝇在不同环境条件下的表现，了解基因的遗传规律，培养学生的实验操作能力和科学思维能力。
实验材料：果蝇（Drosophila melanogaster）、不同基因型的果蝇（例如红眼果蝇和白眼果蝇）、不同环境条件（温度、光照等）的实验箱、显微镜、实验记录表等。
实验步骤：1. 将实验箱分为两组，分别放置不同基因型的果蝇。
观察果蝇在不同基因型的情况下的外观特征差异。
2. 给果蝇提供不同的环境条件，比如一组果蝇放置在高温环境下，一组果蝇放置在低温环境下。
观察果蝇在不同环境条件下的表现变化。
3. 使用显微镜观察果蝇的遗传特征，比如眼睛颜色、翅膀形状等。
记录果蝇的观察结果。
4. 根据观察结果，让学生分析基因型对果蝇表现的影响，讨论基因的遗传规律。
5. 让学生总结实验结果，探讨基因育种在农业、畜牧业等方面的应用。
实验注意事项：1. 实验过程中要注意果蝇的数量和饲养条件，确保实验的可靠性和结果的有效性。
2. 实验操作过程中要注意卫生和安全，避免果蝇逃逸或传播疾病。
3. 学生在实验过程中要保持注意力集中，认真记录实验结果，并按照实验规定的步骤进行操作。
实验延伸：1. 可以进一步探究不同基因型的果蝇在不同环境条件下的生长发育速度和繁殖能力。
2. 可以设计其他基因育种实验，比如观察不同基因型的植物在同一环境条件下的生长差异，了解基因在植物种植中的应用。
实验评价：通过本实验，学生能够了解基因的遗传规律，培养实验操作能力和科学思维能力，提高对生物基因育种的认识和理解，从而促进科学教育的发展。
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Gene correction with CRISPR/Cas9
Chapter 2: Genome editing tools
Generation of genome editing tools
◆ Meganuclease ◆ Zinc-finger nuclease (ZFN) ◆ Transcription activator- like effector nuclease (TALEN) ◆ RNA- guided endonuclease (CRISPR-Cas)
Cas3
Mature crRNA Mature crRNA
PAM RuvC
With off-target cleavage Minimal off-target cleavage No immunogenicity May have immunogenicity
DeFrancesco L. Nature Biotechnology 2011, 29(8): 681-684
Cellular genome editing
Jia Chen School of Life Science and Technology, Shanghaiiting is getting hotter and hotter
What can we do with genome editing?
Cascade pre-crRNA
c
Type II
Cas9 RNase III pre-crRNA
d
Type III
Cas6 pre-crRNA
tracrRNA
Cmr/Cas10 Csm/Cas10 crRNA biogenesis
Intermediate crRNA Intermediate crRNA Mature crRNA
geted DNA double-stran genome editing through Subsequently, Carroll a potential of designer nu for efficient, locus-spec Moreover, it was shown ogy repair template that deletion mutations (inde end-joining (NHEJ) repa 2002). These early geno induced HR and NHEJ and precise modification To achieve effective g specific DNA DSBs, fou binding proteins have b derived from microbial 2006), zinc finger (ZF) nu tion factors (Urnov et al. activator-like effectors (Christian et al., 2010; M cou and Bogdanove, 20 DNA endonuclease Cas9 mune system CRISPR (C Meganuclease, ZF, an DNA sequences throug meganucleases integra
TALEN Vs. ZFN
DeFrancesco L. Nature Biotechnology 2011, 29(8): 681-684
Transcription activator- like effector nuclease (TALEN)
Pros ◆ Highly programmable Cons ◆ Hard to make and keep plasmids ◆ High efficiency ◆ Not suitable for high throughput ◆ Minimal off-targeting cleavage screening
Conventional knockout method
Conventional knockout method
Cons ◆ Low efficiency (10-6) ◆ Cell type limitation ◆ Labor consuming ◆ Money consuming ◆ Disappointing ☹ Pros ◆ High precision
Zinc-finger nuclease (ZFN)
Adapted from Urnov et al. 2010
◆ Artificial restriction enzymes generated by fusing a zinc finger DNA-binding domain to a DNA-cleavage domain
Transcription activator- like effector nuclease (TALEN)
Miller et al. Nature Biotechnology, 2011, 29: 143-148.
TALEN Vs. ZFN
ZFNs Recognize a nucleotide triplet Target specific sequence Context dependence TALENs Recognize single nucleotides Target any sequence Context independence
Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/ CRISPR associated protein (Cas)-based RNA-guided DNA endonucleases (CRISPR-Cas)
Discovery of CRISPR/Cas system
Keith Joung, OPEN (Oligomerized Pool Engineering)
Zinc-finger nuclease (ZFN)
Pros ◆ Programmable Cons ◆ Hard to find ZFA
◆ High efficiency
◆ Off-targeting cleavage
Zinc Finger Array (ZFA)
Adapted from Urnov et al. 2010
◆ However, finding efficient Zinc Finger Array (ZFA) is hard!
Patented Vs. Open recourse
Sangamo BioSciences
d
Type III
Cas6 pre-crRNA
Annu Rev Microbiol. 2015 Jul 22. [Epub ahead of print]
Repeat Spacer
Mechanism of CRISPR/Cas system
Leader/promoter cas cas
b
Type I
Meganuclease
María José Marcaida et al. PNAS 2008;105:16888-16893
Meganuclease
Pros ◆ Very high specificity Cons ◆ Recognize limited target sites ◆ Hard to modify the enzyme ◆ Have never been widely used
Bhaya D, et al. Annu. Rev. Genet. 2011. 45:273–97
H11-Marraffini
CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes
ARI 14 July 2015 9:37
Knockout with DNA endonuclease
(Double Strand Break)
(Non-Homologous End Joining)
Indel (Insertion or deletion)
Knockout with DNA endonuclease
Pros ◆ High efficiency (50%) ◆ No cell type limitation ◆ Labor saving ◆ Money saving ◆ Encouraging ☺ Cons ◆ Off-targeting
Why knock in a gene?
Conventional knockin method
Conventional knockin method
Cons ◆ Low efficiency (10-6) ◆ Cell type limitation ◆ Labor consuming ◆ Money consuming Pros ◆ High precision
◆ ◆ ◆
1987: DNA repeat arrays in the intergenic region adjacent to the alkaline phosphatase (iap) gene in Escherichia coli K12. 2002: coining of the CRISPR acronym. 2005: the hypervariable spacers showed sequence homology to viruses or plasmids and hypothesized that CRISPRs and associated proteins could play a role in immunity against transmissible genetic elements.