第三章基因工程工具酶
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
新教材高中生物第3章基因工程 基因工程的基本工具与聚合酶链式反应PCR技术教师用书苏教版选择性必修3
第一节基因工程及其技术第1课时基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术课标内容要求核心素养对接1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用,并能说出它们在基因工程中的应用。
科学思维：掌握PCR技术的过程与原理,并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。
社会责任：通过了解基因工程的发展历程,认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果,并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
↓1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒,同年,科学家发现DNA连接酶。
↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。
史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。
↓1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。
↓1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。
↓接着,科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。
↓1976年,科学家用质粒为载体,将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌,1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。
↓1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列,这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。
二、基因工程的基本工具1．基因工程(1)概念：又称为DNA重组技术,是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA,然后导入受体细胞,并使其在受体细胞中表达,产生人类需要的基因产物的技术。
(2)原理：基因重组。
(3)操作水平：基因(分子)水平。
2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)(1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列,并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
基因工程的工具酶
03
应用领域：基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势：定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向，推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用：作为构建基因电路的关键元件，实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势：更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景：利用工具酶进行药物设计和生产，提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景：利用工具酶进行污染治理和生态修复，保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗：工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学：工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展：工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望：工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
YOUR LOGO
04
应用：基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能：连接 DNA片段，形 成重组DNA
特点：高效、 特异性强、稳 定性好
应用：基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型：T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能：在基因工程中，聚合酶用于切割和连 接DNA，以实现基因的插入、删除和修改
工具酶：基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用：在基因突变的研究中，
实例：例如，使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA，然后使用DNA连
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程的工具酶
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
衔接物：指用化学方法 合成的一段由若干个核 苷酸组成的、具有一个 或数个限制酶识别位点 的寡核苷酸片段
四、重组DNA实验的一般程序
a. 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶
（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性 末端的线性DNA分子 b. 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。 c. 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I） 粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油 作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时， 加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘 油浓度过高，影响酶切反应
⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反 应时一般让酶解过夜
⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到 双链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针
基因工程-工具酶
基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中，实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基， 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶，开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用，用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学，工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具，用于切割、连接和修饰DNA分子，使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列，用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起，构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰，如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列，如聚合酶链反应（PCR）中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用，识别并结合到目标序列上，然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因，使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵，生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制：某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题：基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑：对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管：基因工程面临严格的法律和监管要求。
基因工程常用的工具酶
农作物的产量和质量。
医学领域
基因工程被用于治疗遗传性疾 病、癌症、感染性疾病等，以 及制备疫苗和单克隆抗体。
工业领域
基因工程被用于生产高价值的化 学品、生物燃料和生物材料等， 降低生产成本和提高产品质量。
基础研究
基因工程被用于研究基因的结构 和功能、蛋白质的表达和调控等
常见的限制性核酸内切酶包括EcoRI、BamHI、HindIII等。
DNA聚合酶
DNA聚合酶是催化DNA复制过程中 DNA聚合反应的酶。
常见的DNA聚合酶包括Taq酶和T7噬 菌体DNA聚合酶等。
DNA聚合酶具有合成DNA的功能，可以在 模板DNA的指导下，将脱氧单核苷酸逐个加 到引物RNA的3'-OH末端，形成新的互补链 。
，促进生命科学领域的发展。
02 基因工程常用的工具酶概 述
工具酶的定义与分类
定义
工具酶是指用于基因工程操作的一类 酶，能够催化DNA或RNA的切割、连 接、修饰等反应，是基因工程实验中 必不可少的工具。
分类
根据功能的不同，工具酶可以分为限 制性核酸内切酶、DNA聚合酶、反转 录酶、T4核酸连接酶等。
工具酶在生物制药和农业生产中应用广泛，如基因工程的抗体药物、疫
苗、农作物改良等领域，能够提高产品的产量和质量。
工具酶的来源与生产
来源
工具酶主要来源于微生物、植物和动 物等生物体，其中微生物来源的酶是 最常用的。
生产
工具酶的生产通常采用基因工程技术 ，通过克隆和表达酶的基因来获得相 应的酶蛋白，再经过纯化和复性等步 骤得到高活性的工具酶。
VS
转录激活因子
激活特定基因的表达，实现基因治疗。
基因工程3-3基因操作的工具酶
由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在 质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。 (1) 切除单链粘性末端，产生平末端，再用T4连接酶连接。 (2) 切除cDNA的发夹结构。
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3.3 DNA聚合酶
DNA聚合酶 ：能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到
双链DNA分子引物链的游离3’-OH末端，使核 苷酸发生聚合作用，而不从模板上解离。
反应特点 ：
(1) 以四种三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）为底物 (2) 反应需要模板的指导，加入的核苷酸由模板链
所决定 (3) 聚合反应需要有引物存在，且引物要有3’-OH
Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端（5’延 伸末端）。
13
14
对于限制性核酸内切酶EcoR I切割后形成的5’ 延伸末端可用32PdATP标记：
而BamH I切割后形成的5’延伸末端可用
32PdGTP标记：
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3.3.3 T4 DNA聚合酶 是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一
种特殊的DNA聚合酶。 1. T4 DNA聚合酶也是一种多功能酶：
合成的方向移动——缺口平移（Nick
Translation）。 9
应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的 反应体系是：在25 l总体积中含有1 g纯化的特 定的DNA片段，并加入适量的DNase I、pol I、 32PdNTP和未标记的dNTP。
脱氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一种内切酶， 它能够水解单链或双链DNA，形成带有5’-磷酸 末端的单（寡）核苷酸。
解方向有两种： * 从RNA链 5’末端外切：称5’ 3’外切RNA 酶 * 从RNA链 3’末端外切：称3’ 5’外切RNA 酶
基因工程制药
第三章基因工程制药第一节：基因工程制药基本环节基因工程技术六个基本过程：分离→酶切→连接→转化→筛选→验证。
（一）基因工程中常用的工具酶：ⅰ：核酸限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子上特定核苷酸序列，并进行切割的水解酶，简称内切酶。
主要存在于原核微生物中。
（1）限制和修饰系统：原核微生物中存在限制性内切酶及甲基化酶，它们对DNA底物有相同的识别序列，但有相反的生物功能。
而甲基化酶具有宿主专一性，可识别宿主双链DNA分子的特定序列进行甲基化修饰，而不修饰外源性DNA分子，从而避免了限制酶对宿主DNA的降解。
（2）限制性内切酶的分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。
其中Ⅱ型限制性内切酶识别和切割产物是特异性的。
（3）Ⅱ型核酸限制性内切酶：1．酶切方式有两种：①断裂位置交错，形成粘性末端，又可分为从5′粘性末端和3′粘性末端；②对称轴处断裂形成平头末端。
2．同裂酶：是指来源不同，识别序列相同的酶，其切割位点同，产生平头或粘性末端。
3．同尾酶：来源和识别序列都不同，但切割后产生相同的粘性末端的酶。
4．限制性内切酶产生的末端的连接方式有三种：①匹配粘性末端的连接②平端连接③不匹配粘性末端的连接（有两种：67）5．限制性内切酶反应的影响因素：DNA的纯度、反应速度、反应体系的缓冲液、酶量、体积、时间、DNA甲基化程度、DNA的分子构型等。
ⅱ：DNA连接酶：是指催化两条分别具有5′-磷酰基末端与3′-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶。
目前使用的DNA连接酶:T4噬菌体DNA 连接酶、大肠杆菌（E.coli）DNA连接酶。
特点1．T4-连接酶：能够连接含粘性末端或平头末端连接的DNA片段或双链DNA 的切口。
连接反应中 ATP+作能源辅助因子。
2．大肠杆菌：只能连接粘性末端DNA片段或双链DNA的切口，不能连接平头末端DNA片段。
在连接反应中用NAD+作能源辅助因子。
ⅲ：聚合酶：（68）（二）载体：概念：（1）载体：是指凡来源于质粒或噬菌体的ＤＮＡ分子，可以供插入或克隆目的基因ＤＮＡ并具有运载外源ＤＮＡ导入宿主细胞能力的片段。
基因工程常用工具酶及应用
DNA 连接酶
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DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
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三.RNA酶
主要功能 降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、 皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA 的实验中谨防RNA酶污染。
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四.核酸酶SI
• 降解单链 DNA 或 RNA，形成5’-P的单核苷 酸或寡核苷酸片段
5'粘末端
PstI
3' sticky end
3'粘末端
HpaI
blunt end
平末端
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四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如
EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
某些碱基被甲基化所保护。这种细菌
内部的限制与修饰作用分别由核酸内
切酶和甲基化酶完成，构成了类似免
疫的防御系统。
6
解释 何谓内切酶
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；
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• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
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1.2 限制性内切酶的种类
目前在细菌中已发现600多种限制性内切酶， 根据其性质不同可分为I、II和III等三大类．
* I类和III类限制性内切酶同时具有核酸内切酶 活性和甲基化活性，属于限制-修饰酶．
* II类限制性核酸内切酶与所对应的甲基化酶是 分离的，属于不同的酶分子，而且这类酶的识 别切割位 点比较专一，广泛应用于DNA的重 组，被称为分子手术刀．
3) Bal 31 核酸酶逐步降解法
原理：利用Bal 31外切酶从DNA片段的两端逐个 切割核苷酸，使原切割片段在琼脂糖凝胶电泳 谱上发生有规律的变化，从而确定某种限制酶 在DNA片段上各个切割位点．
2. DNA聚合酶
DNA聚合酶：是一类催化DNA合成的酶类，酶的作 用需要DNA或RNA作为模板，合成DNA链的序列与 模板的序列互补。．
识别序列与出现几率的关系
1.6 多识别序列限制性内切酶
能够识别两种或两种以上核苷酸序列内切酶．
同裂酶：来源不同，但具有相同识别序列的限制酶．
同位酶：具有相同的识别序列，但酶切位点不同的 限制性内切酶．
同尾酶：具有不同识别序列的限制性内切酶，切割 DNA分子后产生相同的粘性末端.
稀切限制性内切酶:由于限制性内切酶识别序列的 特异性，识别位点在DNA分子上出现的几率特 别低．
位点偏爱：DNA分子中的某些识别序列能够迅速 被限制性内切酶切割，而另一些位点则相对不易 被切割的现象．
DNA甲基化：DNA分子中的某些序列能够特异性地 被甲基化酶所修饰的现象．DNA的甲基化不利于限 制性内切酶的酶切作用．
DNA的纯度：DNA样品中混杂的蛋白质，有机溶剂
等会影响限制性内切酶的切割效率．
第三章 基因工程工具酶
一、基因工程工具酶的种类
1. 限制性核酸内切酶 2. 连接酶 3. DNA聚合酶 4. 反转录酶 5. RNA聚合酶 6. 溶菌酶、蛋白酶K等
二、基因工程工具酶的来源
• 多数来自微生物或噬菌体感染的微生物 • 动物 • 病毒
1.限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）: 是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每 条链的一个二磷脂键断裂的内脱氧核糖核苷酸 酶．
平末端：限制性内切酶在二重对称轴的上切割
DNA分子的每一条链，使得双链DNA分子断开，产 生平末端的DNA片段．
1.8 限制性内切酶反应系统
1）底物DNA分子：双链DNA分子的内部结构与限制 性内切酶的反应效率密切相关．
侧面序列：当识别序列两侧的碱基序列达到一 定的长度时，限制性内切酶才能正常切割DNA分子 的现象．
单酶切法：以一种限制性内切酶切割DNA分子， 酶切后获得N（识别位点）个或N+1个DNA片
段．ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
双酶切法：以两种限制性内切酶切割同一DNA分 子．可同时酶切或先后酶切．
部分酶切法：以限制性内切酶对DNA分子进行不 完全切割．
1.11 DNA分子限制性内切酶酶切图谱
DNA分子上各种限制酶识别位点的排列顺序．
1)双酶切法：
用三种以上待定位的限制性内切酶分别单酶切或 双酶切DNA分子，测定各酶切DNA片段的大小，确 定各酶切位点的相对位置．
酶切片段分析
2) 末端标记DNA的部分酶切法
原理：先以P32标记DNA分子的5’端，并以单切点 的限制酶切割DNA分子，获得两个带标记的DNA片 段，再以其它限制酶进行部分酶切，得到一系列 DNA带标记的DNA片段，根据所得结果确定各种限 制酶在DNA分子上的位置．
2.1 DNA聚合酶的种类
1) 几种常见的DNA聚合酶
2.2 几种DNA聚合酶的应用
1) E.coli DNA 聚合酶 I
A）以切口平移的方法标记DNA：在Mg2+的存 在下，用低限量的DNA酶I处理双链DNA，产生的切 口可作为大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）催化DNA合 成的引物．合成过程中，dNTP前体不断掺入到正 在增长的DNA链上，同时利用全酶的5’3’外切核 酸酶活性使切口沿5’3’方向平移．如果提供放射 性dNTP前体，则反应产物是被放射性标记的DNA 链．
1.3 II类限制性内切酶的作用机制
1.4 限制性内切酶的识别序列
二重旋转对称识别序列（二重互补对称）
找出限制酶的识别序列
1.5 限制酶识别序列出现的几率
识别序列越短，则在DNA序列中出现的几率就越 大，识别序列越长，则出现的几率就越小．因此， 在基因克隆中要根据不同的要求选择合适的限制 酶．
1.7 酶切末端
5’ 粘性末端：限制性内切酶在二重对称轴的5’端 切割DNA分子的每一条链，使得双链DNA分子交错 断开，产生带突出的5’粘性末端的DNA片段．
3’粘性末端：限制性内切酶在二重对称轴的3’端切
割DNA分子的每一条链，使得双链DNA分子交错断开， 产生带突出的3’粘性末端的DNA片段．
3) 酶切反应的温度
多数限制性内切酶的反应最适温度为37 ℃，但少数 限制性内切酶的酶切反应温度高于或低于37 ℃．
4) 酶切反应的缓冲液
1.9 限制性内切酶的Star活性
某些限制性内切酶在特定的条件下，切割位点 的识别序列发生变化．形成Star活性的因素包括： 高浓度甘油、低离子强度等．
1.10 DNA分子的片段化
DNA分子的浓度：DNA分子的浓度不能过高，否则 会难于切动DNA分子．
2）限制性内切酶的用量
活性单位：酶在最适反应条件下，60 min内完 全切割1μg DNA的酶活性．容积活性：每1μl酶 液中所含的酶活性单位．
限制性内切酶的用量：不超过酶切反应总体积 的1/10．内切酶储存缓冲液中含有50%的甘油， 酶切反应系统中甘油的浓度高于5%时会影响限制 性内切酶的酶切反应．
1.1 限制性核酸内切酶的命名
微生物的属名的第一个大写字母+种名的前两个 小写字母+菌株（型）代号字母的缩写
* EcoR I ----Escherichia coli 中R型菌株提 取的第一种内切酶（该基因位于Escherichia coli 中抗药性R质粒上）
* Hind III -----Haemophilus influenzae