耐药结核病诊断新技术
XpertMTB_RIF技术在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的应用杨俊勇
Xpert MTB/RIF技术在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的应用杨俊勇发布时间：2023-06-07T08:36:43.698Z 来源：《中国医学人文》2023年5期作者：杨俊勇[导读] 探讨Xpert MTB/RIF技术在结核分枝杆菌（MTB）快速检测及利福平耐药检测在黔东南州16县（市）的应用价值，旨在为后续肺结核的诊断与治疗提供指导。
方法：收集我中心结核病实验室2022年1月至10月共1367份检测样本进行Xpert MTB/RIF检测，分析Xpert MTB/RIF法检测的敏感性和特异性。
将1367份培养阳性样本进行分枝杆菌菌群鉴定和药物敏感性试验，评价Xpert MTB/RIF法检测MTB及其对利福平耐药的敏感性和特异性。
结果：MTB检出1323份，MTB未检出44份，RFP耐药基因检出87份；XpertMTB/RIF耐药位点以Probe E为主。
结论：Xpert MTB/RIF技术可快速检测MTB及其对利福平的耐药性，敏感性和特异性较好，具有较高的临床应用价值。
黔东南州疾病预防控制中心贵州黔东南 556000摘要：目的：探讨Xpert MTB/RIF技术在结核分枝杆菌（MTB）快速检测及利福平耐药检测在黔东南州16县（市）的应用价值，旨在为后续肺结核的诊断与治疗提供指导。
方法：收集我中心结核病实验室2022年1月至10月共1367份检测样本进行Xpert MTB/RIF检测，分析Xpert MTB/RIF法检测的敏感性和特异性。
将1367份培养阳性样本进行分枝杆菌菌群鉴定和药物敏感性试验，评价Xpert MTB/RIF法检测MTB及其对利福平耐药的敏感性和特异性。
结果：MTB检出1323份，MTB未检出44份，RFP耐药基因检出87份；XpertMTB/RIF耐药位点以Probe E为主。
结论：Xpert MTB/RIF技术可快速检测MTB及其对利福平的耐药性，敏感性和特异性较好，具有较高的临床应用价值。
结核病的实验室诊断方法及评价
结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
耐药结核病诊断新技术ppt课件
样品制备仪
杂交仪 激光共焦扫描仪
软件判读
基因芯片仪和试剂获国家 SFDA和欧盟CE认证 12
突变覆盖率 95% 70%-90% 75%-95% 70%-90% 70%-90% 阿米卡星>95%
注射类二线药
rrs 基因 1401、1402、1473、1484 位点以及 eis 基因启动子 区-37、-14、-13、-10 位点
卡那霉素>85% 卷曲霉素 70~80% 紫霉素<10%
基因芯片（原理）
代表试剂
1. 利福平 2. 异烟肼
1. 利福平
结果判读 配套仪器 操作步骤 检测时间
人工 专用 繁琐 6 小时
自动 专用 繁琐 6 小时
自动 专用 简便 2 小时 利福平项目覆盖检 测 rpoB 81bp 耐药 决定区 产品单一。不均一 耐药检出能力弱。
覆盖位点
检测少数热点突 变 需 PCR 后开管操 作，易污染。
根据不同的ΔTm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变
根据不同的ΔTm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变
异烟肼耐药突变检测体系示意图
通过检测 katG315、inhA 启动子和、ahpC 启动子区、inhA94 、密码子的突变 与否确定样品对异烟肼的耐药性。
根据不同的ΔTm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变
此外，在北京胸科医院、广州胸科医院、沈阳胸科医院、乌鲁木齐胸科 医院、山东省胸科医院、河南省CDC、厦门市CDC等单位进行临床应
Xpert MTBRIF对结核菌利福平耐药的诊断价值及rpoB基因突变特点的分析
Xperi MTB/RIF对结核菌利福平耐药的诊断价值及rpoB基因突变特点的分析高春景杨洋阚宗卫成松魏素梅胡凯【摘要】目的分析Xpert MTB/RIL检测对结核分枝杆菌利福平耐药的诊断价值及rpoB基因突变特点。
方法回顾分析2012年、月至2022年2月期间来院就诊患者相同标本，同时进行了结核分枝杆菌培养及药敏试验和Xpert MTB/RIL检测，且任一种方法检出MTB。
结果用Xpert MTB/RIL及培养药敏两种方法检测标本共7659例,Xpert MTB/RIL对MTB的检出率高，且有统计学意义(P<245)。
两种方法同时检出MTB3271例,Xpert MTB/RIL检出利福平耐药262例，培养药敏检出利福平耐药238例;两种方法检测利福平耐药的一致率为99.41%;采用Kappa检验，两种方法的检测结果完全符合。
RR-DB探针突变的频率为E探针63.37%、D探针20.07%、B探针&03%、A探针4.53%、C探针280%、联合探针突变2.88%；以培养药敏结果为利福平耐药的金标准,Xpert无探针突变组利福平耐药的准确性要明显低于有探针突变组;初治和复治病例探针突变频率差异有统计学意义。
结论Xpert MTB/RIL检测可以快速有效的诊断利福平耐药结核，有助于早发现、早治疗。
利福平耐药结核探针突变主要发生在E探针和D探针,C探针突变最少。
【关键词】结核分枝杆菌;Xpert MTB/RIL；耐药;rpod突变Diaanostic value of Xpert MTB/RIF assty t PUmpicin resistancc of Mycybacterinm thbercylosit and analy-sit of rpoB geee mutation chal'actePshctGAO Chun-jing,YANG Yang,KAN Zong-pji,CHENG Song,WEI Su-mni,HU KiDepartmeni of TubeTculosP,Xuzhon Igections Disease Hospitnl,Xuzhon,Jiangsp221004,Chinn【Abstract]Objective To analyze the diayzostic value of Xpert MTB/RIL assay for rdampiciz resistance of Mycodactedum tuUerchlosis and the characteristics of rpoB yeze muta/ou.Methods Retpspective analysis was performed ox the same samples of pa/eots aUmi—eX to the hospimi from January227to Juze2022who were simultane-oasly tested for mycodactePum tuberchlosis cylture and drua seosi—vity test and Xpert MTB/RIF assay.At the sametime, MTB was positiveeither of the two methods.Resultt A total of7659samples were UetectedXpert MTB/ RIB and mycodactePum tuPepylosis cylture.Xpert MTB,/RIB assay hak a high detectiou rate of MTB,and the yetec-tiou rate was smCsCca/u significant(P<4.45).A total of3271cases o f MTB were detectedthe two methods,262cases were rdampiciz resistantXpert MTB/RIF assas,and238rdampiciz resistant cases were detectedcylture drup seosiCvim•The coizcideoce rate of rdampiciz psistazce Uetected b,two methods was99.41%.Kappatest was used,and the test results of the two methods were completely cousisteot.The muta/ou frepueocy of pphe ofRR-DB were:pphe E63.37%,pphe D20.19%,pphe B8.03%,pphe A4.53%,pphe C4.80%,and combiza/ou pphe2.38%.Taking cylture drup seosi—v—y as the-old standard of rdampiciz psistazce ,rdampiciz resistance accrmcy of the Xpert pphe free muta/ou-ppp was signi—caney lower than that of the pphe mutatiou-ppp.There was sm/stica/u significazt diRerezce iz the fpqueocy of pphe muta/ou betweez pPmarg and secondary Weat-meot cases.Conclusion Xpert MTB/RIF assy,is a rapib and effective method for the diayzosis of Pfampiciz resistant tuPemylosis,which is helpful for early U eWcWou and Weatmeo-.The muta/ous of rdampiciz resistazt TB pphesare mainly foavd at pphe E and pphe D,while the muW/ou of pphe C is the least-【Key words]MycodactePum tuPepylosis；Xpert MTB/RIL；drup psistazce；rpoB mutatiou目前，耐多药结核病(Muiedrup-resistadi tuber-cylosis,MDR-DB)和利福平耐药结核病(Rifampicin-dg：17.3979/j.imn.1757-6693.2521.55.517作者单位：221776江苏徐州,徐州市传染病医院结核科通信作者:胡凯,E-mail:5oolrain215@ resistant iuPercymsis,RR-DB)仍然是全球结核病控制工作所面临的严峻问题。
世界卫生组织《应用新一代靶向测序技术检测耐药结核病：快速通告，2023》解读
0技DM术<D!1也H'1被=统!V称5"为#新$一依代据测检序测技策术略"1的DL不?同=D!1D高>9通?'&量1
测序方宏法基主因要组分为靶向测序 以 ?V5"#%
"?9>=D?D% V5"! "8D?9=D1&H0V5"!8V5"#!
?及V全5"基先因通组过测靶序向"捕N;获&:D特=定D1基&8因D后0DM再<D进1H'行1=高!E通5量"测#$
风险$在EF!推荐的快速检测诊断技术中!有的 方案的制定!将会对提高结核病治愈率有立竿见影
技术能迅速检测出利福平耐药!但由于缺乏对应的 的效果!并由此缩短患者排菌时间!减少疾病传播$
技术快速检测细菌是否对异烟肼耐药!因此无法快 "二#?V5"技术检测SCR耐药性具有良好的
速判断患者是否患有耐多药结核病!由此诞生了,利 可靠性
目前主流的分子诊断技术产品主要针对特定药物的 鉴于?V5"技术在靶基因数量和突变类型检测
靶基因进行检测!虽然技术的可靠性已被广泛认可! 方面强大的优势!且用时较短!因此!该技术具有良
但对于尚没有建立相应检测方法的抗结核药物!在 好的应用前景$目前关于?V5"技术临床应用的数
化疗方案中选用这些药物仍具有盲目性&4'$考虑到 据还比较少!但已展现出符合预期的表现!结果可
中图分类号
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Xpert
Xpert摘要】目的应用结核分枝杆菌(MTB)/利福平(RIF)耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF）对肺外结核患者的非呼吸系统标本中的MTB及其RIF耐药性进行检测，探讨该方法在肺外结核病诊断中的应用价值，为临床上的应用提供参考。
方法鸡西市传染病医院感染结核二科2017年12月至2018年12月的肺外结核病临床诊断患者171例采集所有非呼吸系统标本，脓液、穿刺液和尿便标本50份，脑脊液及胸腹水标本121份，脓液、穿刺液和尿便进行涂片镜检、结核菌固体培养，对培养阳性的标本进行传统药敏检测，脑脊液及胸腹水只给予常规生化检测，所有标本进行Xpert MTB/RIF 检测,分析该方法与传统涂片、固体培养在不同标本检测结核菌的阳性率，及在浆膜腔积液、脑脊液中的病原检出率。
结果与传统涂片镜检和固体培养对比, Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌的敏感度显著高于涂片镜检和固体培养，并且该技术检测结核菌及利福平耐药结果报告时间(2 h)比固体培养大大缩短(6～8周)，在穿刺液、脓液、粪便及尿液中Xpert MTB/RIF检测具有明显优势。
结论 Xpert MTB/RIF检测穿刺液、脓液、粪便及尿液中的MTB灵敏度、特异度均较高，而对于浆膜腔积液及脑脊液并不具优势，但其快速、可检测RIF耐药的优点能为临床肺外结核的诊疗提供帮助。
【关键词】肺外结核；结核分枝杆菌／利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Xpert MTB/RIF）；结核病是威胁人类健康的疾病之一，据世界卫生组织估计，2016年全球约167万例死于结核病，其中肺外结核占10％～42％，由于肺外结核临床症状不典型、临床标本不易获得且含菌量较少，使诊断较为困难。
近年来，结核分枝杆菌(MTB)/利福平(RIF)耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF）作为核酸检测的一种，已有大量临床研究。
该技术自应用以来已逐步证实了其对肺结核的诊断价值，显示出了较高的敏感性和特异性。
结核病实验室诊断技术介绍
1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
结核分枝杆菌耐药性检测
二、常用的MTB DST检测方法
（二）探针熔解曲线法
采用多色探针熔解曲线法快速检测MTB对RFP、INH、Sm、EMB和FQs 常见耐药决定区域，简便、快速，闭管检测不会交叉污染或造成实验室 污染，只需1台通用的荧光定量PCR仪，无需繁琐的杂交、显色过程，整 个检测过程只需2～3 h，可较全面地了解耐药基因突变信息，辅助诊断 MDR-TB和pre-XDR-TB（指对FQs或至少1种二线注射类药物耐药）；其 缺点是不报告具体的突变类型。
二、常用的MTB DST检测方法
分子DST方法
该方法是基于MTB对抗结核药物耐药分子机制，采用分子生物学技术检 测MTB的耐药基因型。分子DST已成为DR-TB的确诊方法之一，其建立 在基因扩增基础上，快速（2～48 h）、敏感地从MTB分离株或预处理的 临床标本（包括涂阴、培阴的标本）中检出MTB耐药基因突变；分子 DST只在初始阶段需要有较高的生物安全条件，标本消化处理和DNA提 取后标本的传染风险降低。
绝大多数常用的表型DST需要MTB纯培养物，MTB生长慢的特性决定了 该方法需花费较长时间，而且可能因为生长不良或其他微生物污染而导 致结果的不确定性，但该方法可检测多种抗结核药物的耐药性。
二、常用的MTB DST检测方法
（一）传统的DST方法
1.绝对浓度法（absolute concentration method）：将1 mg/ml菌悬液用生理 盐水倍比稀释至10^-2 mg/ml，吸取0.1 ml菌液分别接种于含高、低浓度药 液培养基和对照培养基上，置37 ℃培养4周，按下列方式报告菌落生长情 况：分枝杆菌培养阴性（－）：斜面无菌落生长；分枝杆菌培养阳性 （+）：菌落生长占斜面面积的1/4；分枝杆菌培养阳性（++）：菌落生 长占斜面面积的1/2；分枝杆菌培养阳性（+++）：菌落生长占斜面面积 的3/4；分枝杆菌培养阳性（++++）：菌落生长布满整个斜面；培养基斜 面上菌落数少于20个时，报告菌落数。
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接受MDR检测、报告和治疗的MDR-TB不足1/3，接受治疗的MDR-TB 治愈成功率只有50%
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2015年全球估计MDR-TB患者数
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结核病快速及时诊断是结核病防控 重要因素
平和异烟肼的传统药敏试验
可能使用层级: 地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）
推荐理由: •在我国获得注册证书； •国内研究显示其敏感性和特异性较好； •民族品牌 •数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；
2020/11/14
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探针熔解曲线技术
2020/11/14
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工作原理
在一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定， 当发生错配时，Tm值下降，下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关。
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根据不同的ΔTm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变
2020/11/14
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异烟肼耐药突变检测体系示意图
通过检测 katG315、inhA 启动子和、ahpC 启动子区、inhA94 、密码子的突变
与2否02确0/1定1/1样4 品对异烟肼的耐药性。
28
根据不同的ΔTm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变
靶序列扩增曲线：
内参扩增曲线：
不同标本的内参扩增结果一致，显示纯化后的DNA溶液对扩增无抑制。
高纯度模板DNA是分子检测可靠性的关键！
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临床试验结果
此外，在北京胸科医院、广州胸科医院、沈阳胸科医院、乌鲁木齐胸科 医院、山东省胸科医院、河南省CDC、厦门市CDC等单位进行临床应 用或验证，均获得满意结果。
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6
对新型耐药检测技术的要求
操作简便 检测时间短
闭管检测
检测位点全面
灵敏准确
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7
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基因芯片技术
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结核病耐药与基因
异烟肼
50-70% kat G基因突变 5-10% inh A基因突变 6-13% ahp C基因启动子区域突 变
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ΔTm
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利福平耐药突变检测体系示意图
❖ 96%利福平耐药突变发生在rpoB507-533共81bp区域内
根2据020靶/11序/1列4 熔点的变化，检测rpoB基因 是否含有突变，获得利福平耐药信息 24
根据不同的ΔTm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变
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阿米卡星>95% 卡那霉素>85% 卷曲霉素 70~80% 紫霉素<10%
2020/11/14
11
基因芯片（原理）
基因芯片方法是基于结核杆菌的利福平和异烟肼耐药 性相关的rpoB/katG/inhA的基因位点发生突变，通过PCR 扩增、和固定于尼龙膜上的寡核苷酸探针进行杂交、扫描 ，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和结核 菌耐药性。
利福平
95% rpo B基因突变
耐药 基因
70% 65% 93% 95%
链霉素
64-68% rps L 基因突变
乙胺丁醇
70% emb B基因突变
多数研究报告提示：耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。总体上是基因一个或几个核苷酸
突变（表现增加、缺失、替代），造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合产
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在国内4个省的4个地市级CDC进行了评估。
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结核病和非结核的诊断
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特点
标本：菌株、涂阳痰标本 时间：约8小时 优点：高通量 灵敏度、特异度高
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国家结核病参比实验室推荐建议
基因芯片可以用于: 可疑耐药结核病患者筛查,它有望代替利福
95% 70%-90% 75%-95%
链霉素
rpsL43, rpsL88, rrs513~517, rrs905~908 位点的突变
70%-90%
氟喹诺酮
gyrA88~94 内任意突变
70%-90%
注射类二线药
rrs 基因 1401、1402、1473、1484 位点以及 eis 基因启动子 区-37、-14、-13、-10 位点
2生02耐0/1药1/14
10
抗结核药物 检测位点
突变覆盖率
利福平 异烟肼 乙胺丁醇
rpoB507~533 之间(81bp)内任意突变 ahpC 启动子区（-44 ~ -30 以及-15 ~ 3 位点）， inh94 密码子， inhA 启动子区（-17 ~ -8 位点）以及 katG315 密码子 embB306,368,378,380,406,497 密码子突变
步骤二
加入1-96个提取样本到 检测管中
步骤三
集成多重PCR和结果自动报告
总耗时约3小时，手工操作时间约15分钟
2020/11/14
32
（一）DNA提取
～40 min
高质量的样本DNA
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33
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（三）PCR过程和自动判读
2020/11/14
35
痰标本纯化DNA qPCR 检测结果
样品制备仪 杂交仪 激光共焦扫描仪 软件判读
基因芯片仪和试剂获国12 家SFDA和欧盟CE认证
2020/11/14
12
基因芯片法
2020/11/14
13
2020/11/14
14
利福平的耐药位点
2020/11/14
15
同时鉴定MTC与21种NTM
2020/11/14
16
非结核分枝杆菌
2020/11/14
耐药结核病诊断新技术
• 主要内容
• 一、概述 • 二、基因芯片技术 • 三、熔解曲线技术
2020/11/14
2
2016年全球结核病报告
全球范围内结核病疫情严重 患病率高： 新发患者1040万/年，其中有120万（11%）HIV患者；
死亡率高：每年死亡人数达140万（13.46%），HIV/TB:死亡人数40万 （33.33%）；
2020/11/14
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根据不同的ΔTm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变
2020/11/14
30
链霉素
乙胺丁醇
氟喹诺酮
每个突变都表现出特有的谱线 对应独特的熔点, 软件可以自动地给出 突变类型,即使发生不均一突变的情况,也可以分辨出来.
2020/11/1431操作流程步一自动提取1-24份样本