细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法可以包括以下步骤：
1. 细胞培养：将待实验的细胞株从冷冻保存中取出，放入无菌培养皿内，并加入适宜的培养基。
设置适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度等。
定期观察细胞生长情况并进行细胞的传代。
2. 细胞传代：当细胞培养达到一定密度时，将细胞通过酶消化方法从培养皿中取出，然后转移到新的培养皿中重新培养。
该方法可以获得更多的细胞数量，以维持细胞培养的供应。
3. 细胞分离：对于某些实验需要用到单独的细胞的情况，可以采用细胞分离的方法，如通过胰蛋白酶消化细胞外基质、抑制细胞黏附等，使细胞单个分散。
4. 细胞检测：使用显微镜观察细胞的形态变化，细胞生长情况和细胞颜色等。
也可以利用荧光显微镜观察细胞内的特定荧光标记物，如细胞核染色剂、蛋白质荧光探针等。
5. 细胞培养基交换：定期更换细胞培养基，以保持细胞的生长状态和代谢活性。
6. 细胞处理：根据实验需要，在培养皿中添加不同浓度或种类的化合物，如药物、抗生素等，对细胞进行处理。
7. 细胞采集：根据实验需求，利用细胞刮刀、吸球等方法将细胞从培养皿中收集起来。
8. 细胞冻存：将细胞保存在液氮中，以便长时间保存和后续使用。
9. 细胞裂解：对于某些实验需要提取细胞内的特定分子或蛋白质，可以使用细胞裂解液将细胞内组分释放出来。
10. 细胞计数：通过显微镜或细胞计数仪等方法，对细胞数量进行计数和测定。
请注意，具体细胞实验的操作方法可能因不同的实验目的和细胞类型而有所差异，上述仅为一般的基本操作方法。
在进行细胞实验时，应严格遵守相关实验室规范和安全操作指南。
细胞培养的四个步骤
细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。
在显微镜下不同的细胞有不同的形态。
利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。
培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。
生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。
不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。
完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。
由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。
②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。
血清的分类最常用的是胎牛血清。
胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。
③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。
细胞培养基本操作技能
细胞培养基本操作技能无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。
操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。
容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。
对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。
操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
实验用品1. 种类︰1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。
细胞培养标准操作程序(SOP)
细胞培养标准操作程序(SOP)1.目的:为了保证培养细胞的正常生长,实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤,特制订实验室细胞培养操作流程。
2.适用范围:适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3.操作规程:3、1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3、1、1 1000ml培养液的配制1、准备用品:培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶(100ml×10个玻璃瓶)、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)溶解,并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌,按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2、0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3、7g等),再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺,因该培养基里已含有。
4、用1M(1mol/L)HCl 调PH至7、0左右(细胞适宜在PH7、2～7、4生长,配制好后PH值会升高0、2～0、3,故配时调PH至7、0左右)。
5、用新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)定容到1000ml。
6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解取0、5ml青霉素与0、4ml链霉素加入到1000ml培养液中,使其终浓度均为100U/ml,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0、22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中,玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放-20℃保存备用。
注意:(1)配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl与(或)NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)配制。
一般于配制当天制备,以保证水的纯度与质量。
(2)准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)的容器均不需高压灭菌,干净即可。
细胞培养的过程及注意事项
3 6 细胞培养的过程及注意事项细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；（1）基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞的培养过程及注意事项根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。
原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。
1、组织块培养法（1）基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。
再用平衡液（PBS）或Hanks 液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h 后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。
2、注意事项1）、组织块接种后的前3 天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。
要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。
3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。
细胞培养基本操作
细胞培养基本操作细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。
细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。
一、实验前准备实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。
取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。
消毒双手和超净台。
取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。
水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。
整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。
注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。
然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。
二、制备细胞悬液吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。
上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。
离心：1000rpm，室温离心3min。
注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。
三、细胞培养离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。
向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。
培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。
24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。
四、注意事项1、解冻速度要快在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞培养操作规范
4.一次将所有的所需要试剂、工具放入工作 台。不要半路走出工作间拿东西，传递东西 进工作室需酒精擦拭灭菌
CO2 培养箱：
1.设定的条件为 37℃ ， 5 ％CO2 。 2.使用 CO2 培养箱应注意的问题： ▫ 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证 通气。 ▫ 保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。
▫ 箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000毫升 ，以保持箱内湿度。
控制水盘内污染的方法： 1、 定期(至少每两周一次)，更换水盘内的无菌 蒸馏水或无菌去离子水。 2、 在水盘内添加适量硫酸铜，预防真菌污染。 配制方法：20g无水硫酸铜＋5ml浓硫酸＋1L 灭菌纯水。 3、 水盘内添加适量抗生素。 4、定期为培养箱（含水盘）进行一次高温灭菌 。
细胞消化时间的控制：
4:细胞冻存： 吸出旧培养液加PBS冲洗两次 胰酶消化 加培养基中止消化，（以上步骤同细胞传代 ） 细胞计数 离心收集细胞，吸弃上清，加入冻存液调整细 胞密度至1×106个/ml
将细胞移入冻存管，写好标签（细胞种类，冻存时间 ）4 ℃15-30分钟，-20 ℃1-2小时，-80 ℃
消毒： 消毒前常用的包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒包 装 高压蒸汽消毒：121℃ ，维持20-30分钟。
三：细胞培养方法
1.细胞复苏方法：
从 液 氮 中 取 出 冷 冻 管 ， 迅 速 投 入 37℃ 水 浴中，甩动冻存管，使其融化（1分钟左右）； 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； 1000转低速离心5分钟； 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
血清： 常用血清种类：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。 使用浓度：5%-20%，一般10% 血清的消毒：过滤除菌 血清解冻步骤：–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一 天，至室温下全溶后再分装，一般用15ml无菌 离心管分装。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复。
细胞复的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
1、贴壁细胞的传代具体操作如下：1.1、传代前准备：1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅预热。
1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。
1.1.6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后能放入超净台。
1.1.7、从培养箱取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞，并做好记录。
1.1.8、细胞培养瓶经用75％酒精擦拭后，再放入超净台。
1.2、胰蛋白酶消化：1.2.1、将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，打开瓶盖，靠近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗2－3次，沿壁（无细胞的一面）缓缓加入适量消化液（胰蛋白酶液），轻轻摇晃。
注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
1.2.2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
1.3、吹打分散细胞：1.3.1、弃去大部分消化液（仅留少量在瓶），并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后加入新鲜的培养液，再用吸管轻轻吹打成细胞悬液（尽可能不要出现泡沫，否则对细胞有损伤〕1.4、分装稀释细胞1.4.1、将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
1.4.2、倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。
最后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等。
1.5、继续培养：1.5.1、用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。
传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。
2、悬浮细胞的传代悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。
当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管，1000～1500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。
然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。
三、细胞的冻存细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞部形成冰晶对细胞造成伤害。
1、具体操作如下：1.1、从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存，但最好选择对数增长期细胞，已长满的细胞冻存复后生存率低。
在冻存前一天最好换一次培养液。
1.2、贴壁细胞经消化、离心（1000～1500rpm，5min）收集，悬浮细胞经离心收集；1.3、大约106个细胞加入1ml冻存液（10％DMSO+90%血清），用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；1.4、加入到冻存管中，每个冻存管加1－1.5ml的细胞悬液；密封；1.5、在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；1.6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒，管置于4℃半小时，然后置于-20℃两小时，再置于-70℃两小时，然后置于液氮上过夜；第二天将细胞置于液氮中；1.7、记下冻存管存放的位置，作好冻存记录（冻存的细胞名称、代数、冻存日期等）。
2、注意事项：2.1、使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。
高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。
在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。
2.2、不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度围过久，低温损伤主要发生在这一温度区，是“危险温区”。
2.3、注意定期检查液氮罐液氮量，及时添加。
2.4、细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的。
但为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期复一次，观察细胞对冻存的适应性。
已建系的细胞最好也每年取一支复一次后，再继续冻存。
四、细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作如下：1、准备工作：取一瓶传代的细胞，按上述二的传代法繁殖细胞，待长成单层后以使用。
2、细胞悬液制备：细胞悬液的制备法：用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测单细胞悬液。
3、细胞计数：2.1、盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.2、制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液（如5滴）到一离心管中，加入等体积台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可省略台盼蓝染色步骤。
2.3、、将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
2.4、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
2.5、计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4) ×2×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 ；而1ml＝1000mm3细胞计数要点：①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；②要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
③取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；④数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
⑤操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
注：4％台盼蓝母液的配制：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。
使用时，用PBS稀释至0.4％。
五、细胞活力的测定1.染料排斥试验：其原理是细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。
而活细胞则能阻止该染料进入细胞。
借此可鉴别死细胞和活细胞。
常用的染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等。
以台盼蓝染色为例。
步骤同上述细胞计数的操作步骤。
注意以下几点:①计数：在3－10min，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞（死细胞被染成淡蓝色，活细胞则拒染）。
②台盼蓝染色时，时间不宜太长，否则活细胞也会着色，从而干扰计数。
③活细胞率（％）＝活细胞总数/(活细胞总数＋死细胞总数)×100％2、MTT比色实验：可测定测药物或病毒的IC50原理：活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中。
用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于酶标仪上测定光吸收值。
紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和功能状态相关。
2.1、将细胞接种于96板上，密度为大约105个/ml，每接种100μl；2.2、培养至对数生长期加入待测样品；2.3、作用一定的时间之后，加入三蒸水配制的5μg/ml的MTT溶液，每20μl；2.4、37℃温育4小时；2.5、取出培养板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀；如果是悬浮细胞则用板离心机离心后除去上清；2.6、每加入100μl的DMSO，摇床上摇动30分钟以使沉淀溶解；2.7、用酶联免疫检测仪（DNA Expert）在595nm（或490nm）波长处检测96平板中每细胞的光密度值（OD值），按下列公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率：细胞存活率（％）＝治疗组OD值/ 对照组OD值×100％2.8、求出各药物（或病毒）浓度下的OD值占对照OD值的百分比，用此百分比对药物（或病毒）浓度作图；在所得的曲线上，百分比值为50时所对应的浓度就是IC50值。
或根据各浓度下细胞的存活率，采用Logit法计算IC50。
六、细胞的运输装运细胞的法有两种：1、冷冻贮存运输即利用特殊盛液氮或干冰冻存，保存效果较好，但较麻烦，且不能长时间运输，多需空运。
2、充液法2.1、选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。