动物线粒体DNA提取的原理和方法
DNA提取原理和方法
核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μ L DNA液中加入 200μ l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条 件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
问题三：DNA提取量少。 原 因
1. 2. 3. 4.
1. 2.
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分
沉淀不完全
洗涤时DNA丢失
对 策
3.
在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的 结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机 会。 同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打 断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随 后经抽提而去除。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
裂解液
酒精沉淀
植物材料
液氮研磨
抽提
DNA的提取的原理和方法
DNA的提取的原理和方法DNA的提取的原理和方法一、实验原理DNA是生物体遗传信息的主要载体，它是一种长链的生物高分子，由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶）按照特定的顺序排列组成。
DNA主要存在于细胞的细胞核中，也有一些存在于线粒体和叶绿体中。
DNA提取的原理主要是利用不同物质在特定溶剂中的溶解度不同，通过控制溶剂的种类和条件，将DNA从细胞中分离出来。
在DNA提取过程中，通常需要使用一些化学物质，如苯酚、氯仿等，来破坏细胞膜和核膜，使DNA释放出来。
同时，还需要使用蛋白酶等酶类物质来消化蛋白质，以便更好地分离DNA。
二、实验方法1.材料准备提取DNA的材料可以是动物组织、植物组织、微生物等。
不同的材料需要采用不同的处理方法，以最大限度地获得高质量的DNA。
例如，对于植物组织，可以使用液氮研磨法或CTAB法等方法进行提取。
2.细胞裂解细胞裂解是DNA提取的关键步骤之一，目的是破坏细胞膜和核膜，使DNA释放出来。
常用的裂解方法有机械法、化学法和酶法。
机械法包括研磨、超声波等；化学法使用化学物质如苯酚、氯仿等；酶法使用蛋白酶等酶类物质来消化蛋白质。
3.蛋白质去除在细胞裂解后，蛋白质也会随着DNA一起释放出来。
为了获得纯净的DNA，需要去除蛋白质。
常用的去除蛋白质的方法有苯酚/氯仿抽提法和盐析法。
苯酚/氯仿抽提法利用苯酚和氯仿的特性，将蛋白质和DNA分离开来；盐析法则是利用高浓度的盐溶液使蛋白质沉淀，而DNA则溶解在上清液中。
4.DNA沉淀去除蛋白质后，需要通过一定的方法将DNA沉淀下来。
常用的沉淀方法有乙醇沉淀法和盐析法。
乙醇沉淀法利用乙醇能够使DNA沉淀的特性，将DNA从溶液中分离出来；盐析法则是利用高浓度的盐溶液使DNA沉淀，然后通过离心等方法将DNA 收集起来。
5.DNA洗涤和溶解DNA沉淀后，需要用70%乙醇洗涤数次以去除杂质，然后用适量的TE缓冲液或去离子水溶解DNA。
TE缓冲液是一种常用的维持DNA稳定的缓冲溶液，含有Tris-HCl和EDTA二钠等成分。
线粒体DNA在物种鉴定中的应用
线粒体DNA在物种鉴定中的应用随着科技的不断发展，分子生物学研究方法渐渐应用于物种鉴定领域。
线粒体DNA作为一种独特的遗传物质，被广泛用于物种鉴定和进化研究中。
本文将探讨线粒体DNA在物种鉴定中的应用，并介绍其优点和局限性。
一、线粒体DNA在物种鉴定中的原理线粒体DNA是细胞内的一种特殊DNA，具有相对较短的长度、高度保守的序列和多拷贝性等特点。
在物种鉴定中，常采用线粒体细胞色素b基因（cytochrome b gene）或线粒体16S rRNA基因（mitochondrial 16S ribosomal RNA gene）的序列进行分析。
通过测定样本中这些基因的序列，可以比较它们与已知物种的基因序列的相似性，从而判断该样本属于哪个物种。
线粒体DNA的高度保守性保证了不同物种在这些基因序列上有较大的差异，使得物种鉴定更加准确可靠。
二、线粒体DNA在物种鉴定中的优点1. 高度保守性：线粒体DNA序列在物种间具有较高的保守性，使得不同物种之间的差异明显，从而有助于物种的区分和鉴定。
2. 多拷贝性：每个细胞中含有多个线粒体，因此线粒体DNA存在于大量拷贝中，提高了物种鉴定的灵敏度。
3. 高变异率：线粒体DNA虽然在物种间的保守性较高，但在物种内部存在着一定的变异，这为进一步研究不同个体之间的亲缘关系提供了可能。
4. 建立数据库方便：由于线粒体DNA序列具有较高的保守性，可以便于建立线粒体DNA数据库，并用于物种鉴定和进化研究。
三、线粒体DNA在物种鉴定中的局限性1. 物种特异性：由于线粒体DNA只能反映母系遗传信息，因此在某些物种中，由于雄性和雌性个体使用不同的线粒体DNA，导致物种鉴定不准确。
2. 样本存放要求严格：线粒体DNA对样本的获取和保存要求较高，容易受到环境中DNA降解和污染的影响，这会对实验结果产生一定的影响。
3. 背景噪音：由于线粒体DNA在物种内存在一定的变异，可能会出现线粒体序列相似度较高的物种，导致物种鉴定结果不准确。
小鼠线粒体的分离与观察
小鼠肝线粒体的分离与观察生科三班2011/5/2实验目的1 了解提取线粒体的基本原理及其过程，掌握差速离心法分离细胞器。
2 通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态。
3 巩固普通染色步骤及注意事项。
实验原理线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时（如电镜和光镜的观察）可采用从组织培养细胞中提取。
本实验是介绍从小鼠肝细胞中提取线粒体并在光镜下观察的方法。
线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，是能量转换的重要细胞器。
细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心。
在一给定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内食物，由于沉降速度不同将停留在不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可一次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程注意使样品保持4℃，避免酶失活。
本实验用的是Ringer缓冲液作为悬浮介质。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法，詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由此吸引堆积在线粒体膜上，线粒体 cell色素氧化酶，使该料保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
cytb分子标记技术在物种鉴定中的应用
cytb分子标记技术在物种鉴定中的应用随着生物多样性研究的不断深入，物种鉴定技术逐渐成为生物学研究领域的重要工具。
而在物种鉴定中，核糖体DNA（cytb）分子标记技术作为一种快速、准确的分子识别技术得到了广泛的应用。
本文将从cytb分子标记技术的原理、应用方法以及在物种鉴定中的应用进行探讨。
首先，我们要了解cytb分子标记技术的原理。
Cytb是线粒体基因组中的一种编码蛋白的基因，其序列具有较高的保守性和变异性，因此可以作为物种鉴定的良好分子标记。
在物种鉴定中，通常会选择cytb基因的特定区域进行PCR扩增，再通过测序技术获得该区域的序列信息。
基于这些序列信息，我们可以进行物种鉴定和进化研究，从而加深对物种关系和演化历史的理解。
其次，cytb分子标记技术的应用方法主要包括PCR扩增、测序和序列分析。
首先，通过提取样本中的线粒体DNA，利用特异引物进行PCR扩增cytb基因的特定区域。
然后，将PCR产物纯化并送测序，利用测序结果进行物种鉴定和进化分析。
此外，还可以利用构建系统发生树等方法进行物种鉴定和分类分析。
这些方法在物种鉴定和生物多样性研究中发挥了重要作用。
最后，cytb分子标记技术在物种鉴定中的应用非常广泛。
以鱼类为例，许多研究利用cytb分子标记技术对鱼类的物种鉴定和系统发生进行了深入研究。
通过分析不同鱼类的cytb基因序列，可以快速准确地鉴定不同的鱼种，揭示它们的遗传关系和演化历史。
此外，cytb分子标记技术也被广泛应用于原生动物、鸟类、爬行动物、兽类等各种动物的鉴定和分类研究中。
除了动物，cytb分子标记技术也在植物的物种鉴定中得到了广泛应用。
通过对植物线粒体DNA的鉴定分析，可以快速准确地识别植物种类，并研究它们的进化关系。
这对于植物分类学和保护生物学具有重要意义。
总的来说，cytb分子标记技术在物种鉴定中的应用极为重要。
其快速、准确、稳定的特点使其成为物种鉴定领域的重要工具。
在今后的生物多样性研究中，cytb分子标记技术有望发挥更大的作用，为我们更深入地了解生物世界的多样性和演化历史提供重要支持。
鱼类线粒体DNA研究新进展
鱼类线粒体DNA研究新进展一、本文概述线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）作为生物体内的一种重要遗传物质，近年来在鱼类研究中逐渐展现出其独特的价值和潜力。
鱼类线粒体DNA研究新进展不仅深化了我们对鱼类遗传多样性的理解，还为鱼类遗传育种、系统发生、种群遗传结构分析等领域提供了有力的工具。
本文旨在综述近年来鱼类线粒体DNA研究的新进展，探讨其在鱼类生物学中的应用前景，以期为鱼类遗传资源保护和可持续利用提供理论支持和实践指导。
本文将首先回顾线粒体DNA的基本结构和特点，然后重点介绍鱼类线粒体DNA的提取方法、测序技术及其在鱼类遗传多样性、系统发生和种群遗传结构分析中的应用。
还将讨论鱼类线粒体DNA在遗传育种和遗传资源保护中的潜在应用价值，并展望未来的研究方向和挑战。
通过本文的综述，希望能够为从事鱼类线粒体DNA研究的学者提供有益的参考和启示，共同推动鱼类线粒体DNA研究的深入发展。
二、鱼类线粒体DNA的结构与功能鱼类线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是一种双链、闭合环状的分子，通常大小为16-20千碱基对（kb），是细胞器中唯一的DNA分子。
鱼类mtDNA的结构主要包括重链（H链）和轻链（L链），其中H链编码了大部分基因，而L链则编码了剩余的少数基因。
这些基因主要编码线粒体氧化磷酸化系统的13个蛋白质亚基，以及2个rRNA和22个tRNA，这些成分共同构成了线粒体的核糖核蛋白体，负责线粒体内蛋白质的合成。
鱼类线粒体DNA的功能主要体现在以下几个方面：mtDNA是鱼类线粒体遗传信息的载体，通过母系遗传的方式传递给后代，因此，在鱼类遗传学和进化生物学研究中，mtDNA被广泛应用为分子标记。
mtDNA编码的蛋白质是线粒体氧化磷酸化系统的重要组成部分，这些蛋白质参与线粒体的能量代谢过程，对鱼类的生命活动起着至关重要的作用。
mtDNA的突变和变异也被广泛用于鱼类种群遗传结构、遗传多样性和系统发育等研究。
线粒体DNA的提取方法
A buffer: 10 mmol/L Tris-HCL ， pH 7.4 ； 500 mmol/L ； 20 mmol/LEDTA；0.2%BSA；0.2%β-mercaptoethanol B buffer: 10 mmol/L Tris-HCL ，pH 7.4；600 mmol/L sucrose; 20 mmol/L EDTA
实验原理
1、4000rpm 离心可以沉淀分离出叶绿体、 细胞核和组织碎片，12, 000 rpm离心才可 沉淀分离线粒体。 2、用蔗糖浓度梯度纯化线粒体，不同浓度 蔗糖的缓冲液因比重不同而分层。
3、SDS可以从植物各样组织类型中释放和 结合的细胞核酸。
仪器设备： Apparatus:
研钵和研杵；冷冻离心机；过滤装置（漏 斗，玻棒） pH 计；移液器；水浴箱； 50mL 离心管；2；1.5 mL离心管。 mortar (cold); Centrifuged; filter; pH meter; water bath boiler; 50mL centrifugal tube; eppendorf tube .
2.线粒体在37℃下裂解4 h后(或60℃下裂解40min)，往裂解液中加 入等体积的酚-氯仿异戊醇，轻轻混匀，静置5 m in。在12 000rpm 4℃下离心 10 min。吸出上清，再用酚 - 氯仿 / 异戊醇抽提，吸取上 清，加入?RNase,在37℃下保温30m in后,加入酚-氯仿/异戊醇抽提， 吸出上清，再用氯仿 /异戊醇抽提。吸出上清 ,加入1/10 体积的乙 酸钠和两倍体积的异丙醇，置- 20 ℃ 2 h 或过夜。 2. The material were lysed in 2% SDS, constantly shaking the mixture. If the tissue coalesces, warm the tubes in a 60℃water bath for 40 min (or in a 37℃water bath for 4h) until the organelles are fully lysed. Shake the mixture intensively for 10min with an equal volume of equilibrated phenol. Centrifuge for 10min at 12,000 rpm. Remove the upper aqueous phase. The RNase treatment was done at 37℃ for 30minutes. Then add phenol∶chloroform∶isoamyl alcohol （ 25∶24∶1 ） . Repeat the procedure. Add chloroform∶isoamyl alcohol （24∶1）. Repeat the procedure. Precipitate the DNA with 1/10 vol of 3M NaAC and 2 vol of isopropanol at -20℃ for 2-3h or overnight.
遗传与进化研究中的线粒体DNA分析
遗传与进化研究中的线粒体DNA分析遗传学是现代生物学中的一个重要分支，可分为分子遗传学、细胞遗传学、进化遗传学等。
进化遗传学研究种群遗传变异和遗传漂变的规律、解释种群演化过程和形成的机制，为了更好地理解种群遗传学问题，肯定要利用现代分子技术对数据进行分析。
其中线粒体DNA分析是一种非常重要的手段，对于研究人类进化、动植物演化等领域，都具有不可替代的作用。
一、线粒体DNA的特点线粒体是一个存在于细胞质内的细胞器，它是自由基的主要来源和细胞的能量生产中心。
线粒体除了含有自己的膜、蛋白、脂肪等物质外，还含有自己的DNA，称为线粒体DNA。
线粒体DNA（mtDNA）与细胞核DNA不同，最显著的一个特点是mtDNA具有高度的变异性，这种变异性可以被利用来分析生物种群的演化和历史。
线粒体DNA的另一个特点是它在每次细胞分裂过程中都被传递给下一代，传递过程是由卵细胞贡献的。
二、线粒体DNA的应用1. 人类进化人类进化过程中，线粒体DNA变异可以作为重要证据来研究人的起源、迁徙和群体发展等方面的问题。
通过对不同地区人群进行线粒体DNA的遗传分析，可以揭示出人群之间的遗传差异、人种分布的演化历程。
例如，1997年荷兰的Paleo-Eskimo人的遗骸被发现，通过对其mtDNA的分析表明，这些古代人被认为是来自东部亚洲，而不是从库页岛（现在的阿拉斯加）迁移到加拿大北极。
2. 动植物演化动植物的mtDNA变异可以作为物种和生态保护研究方面的工具。
线粒体DNA变异可以揭示物种形成和演化的过程，描绘生物群体的时空变化，为环境污染和生物多样性保护提供重要信息。
例如，2019年中国科学家耗时4年之久，利用线粒体DNA数据重建了牦牛的遗传演化树，为揭示牦牛演化历程提供了重要的证据。
此外，线粒体DNA上的变异还被用于鱼类、鸟类、昆虫等生物物种的分类和分类修订中。
三、线粒体DNA分析1. 提取线粒体DNA线粒体DNA提取和细胞核DNA提取有所不同。
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动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。
关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。
它是细胞进行氧化磷酸化的场所。
线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。
线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。
由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。
动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。
进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。
线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。
线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。
线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。
其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。
线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。
锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。
线粒体的主要成分是蛋白质(占干重60~65%)和脂类(占干重35~40%)。
此外还有少量的核酸(主要为D NA 和RNA)、金属离子、阴离子和维生素等。
其中线粒体膜主要成分是蛋白质、脂类和一些酶,基质由各种酶、D N A 、RNA 、金属离子、阴离子和维生素等组成。
mtD N A 不24蚕 学 通 讯Ne wsletter of Sericultural Science 第22卷 第3期2002年 9月X X X 通讯作者国家自然科学基金项目资助(项目编号:30170719)与组蛋白相结合,它们排列紧密,而象细菌体那样形成为环状裸露的双链D N A 。
不同物种的线粒体基因组D N A 大小悬殊。
一般植物的线粒体基因组D N A 较大,其分子大小范围为:186~2400kb;原生动物线粒体基因组D N A 为18.5~55kb;真菌的线粒体基因组D NA 大小在17.6~115kb 之间;动物线粒体基因组D N A 较小,约为15.7~19.5kb 。
线粒体在功能上受核制约,mtD NA 的复制、转录和翻译过程离不开核基因组的指导与调控。
但它有一套自主装置的基本成分,如D NA 聚合酶、RN A 、RN A 聚合酶、tRNA 、核糖体核氨基酸活化酶等,所以mtD NA 不仅能进行自我复制,还能编码合成2种rRNA 、22种tRNA 和13个蛋白质[1]。
正常的动物线粒体寿命一般仅为1周时间。
离体的线粒体在低温下(0~8e )其活性可以保存3~7d,而在常温下(25e )只能保存1~2h[2]。
1.2 线粒体的鉴定Janus Green B 是对线粒体专一的活性染料,具有脂溶性,能跨过细胞膜,有染色能力的基团带正电,结合在负电性的线粒体内膜上,内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态,呈现蓝绿色,而在胞质内,染料被还原成无色。
线粒体浸没在Janus Green B 中能维持活性数小时,可直接观察到生活状态线粒体的外形、分布及运动。
线粒体制品经Janus Green B 特意染色后,光学显微镜下放大100倍镜检能够发现是否有线粒体存在及它的大小、形状、数量、结构[3]。
1.3 线粒体的获得1.3.1 细胞器的游离[6,7]细胞器的游离需要破碎细胞,破碎细胞常用的方法有化学法和机械法。
化学法有渗透压作用、酶水解、自溶、冻融等几种类型。
渗透压作用是利用低表面张力使细胞膜破碎,其作用温和。
自溶法是利用生物自生的活细胞内含有各种大量的消化酶,它们能将细胞膜溶解掉,同时也可能将线粒体膜溶解而使线粒体D N A 释放出来。
冻融法是利用冻结和溶解的双重作用,其作用可能会造成细胞膜和有膜结构的细胞器的破裂,其作用较为剧烈。
机械法有研磨破碎、均质机破碎、超声波破碎和匀浆器破碎。
研磨破碎是利用盘磨研磨剪切破碎,作用中等。
均质机破碎是用电带动刀片进行剪切组织器官,其作用较剧烈,基本能够将组织器官破碎。
超声波破碎是随机地将组织细胞打成各种大小不同的片段,其作用非常剧烈。
匀浆器破碎是一种手动的方法,由于匀浆器容器壁较为粗糙,通过相互的摩擦,基本能将细胞膜磨破,其作用温和。
要获得较为完整而大量的线粒体,通常用S TE 抽提缓冲液浸泡材料并用玻璃匀浆器或研钵研磨破碎[3~6]。
1.3.2 线粒体的粗提由于动物细胞的线粒体较小,而真核细胞及其碎片、蛋白质沉淀物都比较大,所以用差速离心的方法可以将它们分离开来。
差速离心法又叫分级离心法,是当非均一粒子(大小、密度各不相同)的悬浮液被离心时,各种粒子将以各自的沉降速率移至离心管底部,逐步在管底形成沉淀。
为了分出特定组分,需进行一系列离心。
首先选择一个离心速度和离心时间,第一次离心时把大部分不需要的更大粒子沉降去掉。
这时所需要的组分大部分还留在上清液中,又选择第二个离心速度和离心时间,使大部分不需要的更小的粒子留在上清液。
去掉上清液后,添加相同介质把沉淀悬浮起来,重复上述的差速离心,反复几次,直至达到所需要的粒子纯度为止。
253期 夏玉玲等:动物线粒体D N A 提取的原理和方法26蚕学通讯22卷通常用相对离心力(RC F)将粒子沉淀下来。
而相对离心力的大小取决于试样所处的位置至轴心的水平距离即旋转半径R和转速n,其计算公式为:RCF=1.118@10-5n2R(g)n)))转速(r/min)R)))旋转半径(cm)混合液中粒子分离、沉淀所需时间(Ts)的计算公式为:Ts=27.4(logR max-logR mi n)L n2r2(R-Q)R max)))离心试液的底至轴心的水平距离(cm)R min)))离心试液的面至轴心的水平距离(c m)r)))粒子半径(cm)R)))粒子密度(g/cm3)Q)))混合液密度(g/c m3)L)))混合液粘度(p o)以上两个公式就能确定各种差速离心的离心力和离心时间。
一般去细胞碎片及杂质的离心力(500~2000g)和离心时间(5~15min),沉淀线粒体的离心力(12000~20000g)和离心时间(20~40min)。
1.4线粒体D N A的获得1.4.1线粒体D N A的粗制提取线粒体D NA首先需要破碎线粒体膜将其D NA释放出来。
溶液Ò(0.2mol/L NaO H -1%SD S)的1%SD S能够破碎线粒体膜,使线粒体D N A释放出来;0.2mol/L NaO H提供了一个强碱环境,使基因组D NA和线粒体D N A的氢键都发生断裂而变性。
溶液Ó(K Ac-HAc或NaAc-HAc缓冲液)呈酸性,可以中和溶液II的强碱性而使溶液呈中性,便于线粒体D NA复性,而基因组D NA不能复性。
复性的线粒体D N A溶于水溶液中,不能复性的基因组D NA形成沉淀,通过离心可将两者分离开来。
之后用0.6倍体积的异丙醇或2~2.5倍体积的无水乙醇沉淀线粒体D NA。
1.4.2线粒体D N A的纯化[8]要获得较为纯净的线粒体D N A就必须去除蛋白质和脂类、金属离子、阴离子和维生素等其它几种物质。
首先,加RNase(200L g/mL)37e、2~4hr消化RNA。
之后,用酚、酚\氯仿\异戊醇(体积比为25:24:1)、氯仿抽提D N A以去除蛋白质、脂类等其它物质。
1.4.3线粒体D N A的沉淀、溶解与检测纯化后的线粒体D N A量较少,用异丙醇或沉淀缓冲液沉淀。
线粒体D N A溶液加入0.6倍体积异丙醇或沉淀缓冲液,置于-20e下放置30min,进行离心即得纯净的线粒体D NA。
之后,用70%乙醇洗涤两次,于真空中干燥20min或风干。
加入适量的TE溶液(PH8.0)溶解线粒体D N A。
检测线粒体D NA浓度和纯度通常有3种方法,即琼脂糖凝胶电泳(AG E)、限制性内切酶酶切和紫外分光光度计(U V)。
琼脂糖凝胶电泳可以通过泳带颜色的深浅来判断其浓度,通过是否有拖带来确定其纯度,还可以通过分子量标记来确定线粒体D N A的大小。
限制性内切酶酶切可以知道是否为基因组,如果是基因组,则不能酶切出清晰的条带来;如果没有基因组污染,只要该线粒体D NA存在此酶切位点,就会酶切出条带来。
紫外分光光度计可以测得A260和A260/A280,其中A260越大,其D N A的浓度也越大,反之越小。
A260/A280一般介于1.6~2.0之间,如果A260/A280>2.0,则此D N A可能有RN A污染,A260/A280<1.6,则此D N A可能有蛋白质、酚、氯仿或乙醇等的污染。
2常用的几种提取方法及优缺点2.1动物线粒体D N A的提取方法关于动物线粒体D NA的提取方法,主要有:(1)氯化铯密度梯度离心法;(2)柱层析法;(3)D Nase法柱层析法;(4)碱变性法;(5)改良的碱变性法。
2.1.1氯化铯密度梯度离心法[9]密度梯度离心法是把样品粒子在一个密度梯度介质中离心,这个介质由一个合适的小分子及其溶剂组成。
离心时,离轴心越远介质密度越大。
氯化铯密度梯度离心法就是以氯化铯为介质将各组分分离出来。
此方法具有良好的分辨能力,可以同时使样品中几个或全部组分分离,以前常用于线粒体的分离。
2.1.2柱层析法[10]层析分离技术是一种物理的分离方法,它利用混合物中的各组分物理化学性质的差别(如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等),各组分以不同程度分布在两相中,从而使各组分以不同速度移动而达到分离。