高通量测序RNA-seq数据的常规分析
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。
2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。
深度为10-30 Million reads。
）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。
大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。
我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。
这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。
首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。
接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。
然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。
再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。
对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。
这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。
也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。
因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。
rnaseq流程步骤
rnaseq流程步骤RNA测序（RNA-Seq）是一种高通量测序技术，用于研究RNA样本中的转录组。
它可以提供关于基因表达水平和转录本结构的全面信息。
RNA测序流程包括实验设计、样本准备、RNA提取、测序、数据处理和分析等步骤。
一、实验设计实验设计是RNA测序流程的第一步，它决定了研究的目的、样本的选择和处理方式。
在实验设计中，需要确定研究的组织或细胞类型、处理组和对照组、样本数量以及测序的深度等重要参数。
二、样本准备样本准备是RNA测序流程的关键步骤之一。
在样本准备中，需要对样本进行处理，以保证提取到高质量的RNA。
常见的样本处理方法包括组织冻存、细胞裂解和RNA的稳定化等。
同时，为了减少样本间的差异，还需要进行样本的随机排列和复制。
三、RNA提取RNA提取是RNA测序流程的核心步骤之一。
在RNA提取中，需要使用RNA提取试剂盒或其他方法从细胞或组织中提取RNA。
提取到的RNA需要经过DNase处理，以去除DNA污染。
同时，为了获得高质量的RNA，还需要进行RNA的浓缩和纯化。
四、测序测序是RNA测序流程的关键步骤之一。
RNA测序可以使用不同的测序平台，如Illumina、Ion Torrent和PacBio等。
在测序之前，需要对RNA样本进行建库，包括RNA的反转录、cDNA合成、文库构建和PCR扩增等步骤。
然后，将建好的文库进行高通量测序，生成原始的测序数据。
五、数据处理数据处理是RNA测序流程中的重要步骤之一。
在数据处理中，需要对原始的测序数据进行质量控制和过滤，去除低质量的reads和污染序列。
然后，将过滤后的reads进行比对到参考基因组或转录组，以确定每个reads的来源。
最后，根据比对结果进行基因表达水平的计算和统计分析。
六、数据分析数据分析是RNA测序流程中的最后一步。
在数据分析中，需要对基因表达水平进行差异分析和聚类分析，以找到差异表达的基因和样本间的相似性。
同时，还可以进行基因富集分析、调控网络分析和转录本组装等进一步的分析。
RNA测序数据分析的常用方法与步骤
RNA测序数据分析的常用方法与步骤RNA测序是一种高通量技术，用于测量细胞或组织中RNA的转录活动。
它能提供生物体内基因表达的全局视角，并帮助科学家们理解基因表达调控机制、发现新的转录产物以及识别基因表达的变异。
然而，对于初学者来说，RNA测序数据的处理和分析可能是一个复杂的任务。
因此，本文将介绍RNA测序数据分析的常用方法和步骤，帮助读者系统地了解和实施这一过程。
首先，在进行RNA测序实验之前，我们需要准备样本。
这包括RNA提取、RNA质量检测和构建文库。
RNA提取可以使用商业试剂盒或基于酚/氯仿提取方法，以获得高质量的总RNA。
在提取后，使用比色法（如NanoDrop）或生物分析仪（如Agilent Bioanalyzer）测量RNA的浓度和完整性。
然后，将RNA转录成cDNA，并在此过程中引入序列标签。
此外，还需要对样本进行文库构建，选择适当的方法（如PolyA选择）来富集mRNA。
接下来，对于测序数据的分析，第一步是数据质量控制。
这是确保数据质量和准确性的关键步骤。
可以使用FastQC等工具来评估测序数据的质量。
它提供了关于序列质量、碱基含量、GC含量以及存在的污染或接头序列的信息。
如果数据质量不佳，则可能需要进行数据修剪或过滤，以去除低质量的序列。
这可以使用工具如Trimmomatic或Cutadapt来完成。
在质量控制之后，接下来的步骤是对测序数据进行比对。
这意味着将测序数据与参考基因组进行比对，以确定每个测序读段的原始来源。
对于人类和其他较为研究的模型生物来说，通常使用基因组上的注释信息（如GTF文件）进行比对。
常用的比对工具包括Bowtie、Tophat、HISAT2和STAR。
比对的结果是一个BAM文件，其中包含每个读段的比对位置和其他相关信息。
一旦测序数据完成比对，接下来的步骤是定量表达和差异表达分析。
定量表达分析用于确定每个基因或转录本的表达水平。
这可以使用工具如HTSeq、featureCounts和Salmon来完成。
rna-seq研究内容
rna-seq研究内容
RNA-seq是一种高通量测序技术，用于研究细胞内的RNA组成
和表达水平。
它能够帮助科研人员了解基因的转录活动、可变剪接、单核苷酸多态性和基因表达调控等方面的信息。
在RNA-seq研究中，首先需要从样本中提取RNA，并通过反转
录生成cDNA。
然后对cDNA进行测序，得到数百万条短序列。
这些
序列被比对到基因组上，从而确定它们的来源基因以及相对丰度。
通过比较不同条件下的样本，可以发现哪些基因在不同条件下的表
达水平发生变化，从而揭示基因调控网络和生物学过程。
RNA-seq研究内容包括但不限于以下几个方面：
1. 基因表达水平分析，通过RNA-seq技术可以测定不同细胞状态或组织中基因的表达水平，从而找出在不同条件下表达水平显著
变化的基因，为研究细胞功能和生物学过程提供重要线索。
2. 可变剪接分析，RNA-seq可以检测同一基因的不同可变剪接
形式，帮助科研人员理解基因调控的复杂性和多样性。
3. 基因组的注释和功能研究，通过RNA-seq可以发现新的转录本、非编码RNA等，有助于对基因组的注释和功能研究。
4. 转录组的差异表达分析，通过RNA-seq可以比较不同样本之间的转录组差异，发现在不同条件下表达显著变化的基因，从而揭示调控网络和生物学过程中的关键因子。
总之，RNA-seq技术在基因表达调控、疾病机制研究、新基因和新转录本的发现等方面具有广泛的应用前景，为生命科学领域的研究提供了强大的工具和支持。
高通量测序技术的数据分析方法教程
高通量测序技术的数据分析方法教程随着生物技术的发展，高通量测序技术（high-throughput sequencing technology）已成为生物学、医学和生物信息学研究中的重要工具。
高通量测序技术可以快速而准确地测定DNA或RNA序列，透过大量的数据来揭示生物体的基因组、转录组以及其他生物学过程中的变化。
然而，正确且高效地分析测序数据是高通量测序技术应用的关键一步。
本文将介绍高通量测序技术的数据分析方法教程。
首先，分析高通量测序数据前，我们需要了解常见的测序平台和数据格式。
当前常用的高通量测序平台包括Illumina、ABI SOLiD、Ion Torrent等，而测序数据通常以FASTQ、SAM/BAM和VCF等格式存储。
FASTQ格式用于存储原始测序数据，其中包含了每个测序读段的序列信息及其对应的质量分数。
而SAM/BAM格式则是将测序读段比对到参考基因组之后的结果，其中SAM是比对结果的文本格式，而BAM则是对应的二进制格式。
VCF（Variant Call Format）格式则用于存储基因型变异信息。
接下来，我们将介绍高通量测序数据的基本分析流程。
通常，测序数据分析可以分为质控、比对、变异检测和功能注释几个主要步骤。
在质控步骤中，我们需要对测序数据进行质量评估和过滤。
质量评估可以通过查看测序数据的质量分数、GC含量、碱基分布和测序错误率等指标来判断测序数据的质量。
使用质量评估工具如FastQC和NGS QC Toolkit可以帮助我们快速准确地评估测序数据的质量，并进行相应的过滤工作，去除低质量的测序读段。
接下来，我们需要将测序读段比对到参考基因组上。
比对工作可以通过软件如Bowtie、BWA和HISAT等进行。
比对结果通常以SAM格式存储，然后可以进行排序、去重和索引等处理，生成最终的BAM格式文件。
在变异检测步骤中，我们需要从比对后的BAM文件中检测样本中存在的变异信息。
变异检测可以通过多种工具来实现，如GATK、Samtools和VarScan等。
新一代高通量RNA测序数据的处理与分析
RNA-seq 为基因组学的研究带来了高分辨率的 海量数据，如何有效处理和分析这些海量数据成为 这一新技术能否带来新的科学发现的关键，一些生 物信息学方法与软件也应运而生．本文针对当前 RNA-seq 应用的现实情况，尝试以 Illumina/Solexa 测序平台产生的 mRNA-seq 数据为例，对 RNA 测 序数据的产生过程及数据处理和分析的基本流程、 关键方法和现有软件进行较全面的介绍，并讨论 RNA-seq 数据分析中存在的挑战．
关键词 高通量 RNA 测序，转录组，基因表达，数据处理与分析，生物信息学
学科分类号 Q5，Q6，Q7
DOI: 10.3724/SP.J.1206.2010.00151
近年来，新一代高通量测序技术得到了突飞猛 进 的 发 展 ， 在 此 基 础 上 ， 高 通 量 RNA 测 序 即 RNA-seq [1－5]也 迅 速 发 展 ． 与 基 因 芯 片 技 术 相 比 ， RNA-seq 无需设计探针，能在全基因组范围内以单 碱基分辨率检测和量化转录片段，并能应用于基因 组图谱尚未完成的物种[6]，具有信噪比高、分辨率 高、应用范围广等优势，正成为研究基因表达和转 录组的重要实验手段．
rnaseq数据分析流程
rnaseq数据分析流程RNA-seq数据分析流程。
RNA测序（RNA-seq）是一种用于研究转录组的高通量测序技术，它可以帮助科研人员了解基因表达和转录本结构。
在本文中，我们将介绍RNA-seq数据分析的一般流程，包括数据预处理、基因表达分析和功能注释等步骤。
1. 数据预处理。
首先，我们需要对原始的RNA-seq数据进行质量控制（QC）。
这包括使用软件如FastQC来评估测序数据的质量，检测是否存在低质量的碱基或测序错误。
接下来，我们需要对数据进行去除接头（adapter trimming）和过滤低质量读（quality filtering）。
这些步骤可以使用工具如Trimmomatic或Cutadapt来完成。
最后，我们需要对清洗后的数据进行比对到参考基因组（alignment），这可以使用软件如HISAT2或STAR来完成。
2. 基因表达分析。
一旦我们获得了比对到参考基因组的数据，我们就可以开始进行基因表达分析。
首先，我们需要对比对结果进行计数，这可以使用软件如featureCounts或HTSeq来完成。
然后，我们需要对表达数据进行标准化，例如使用DESeq2或edgeR来进行基因表达的差异分析。
最后，我们可以使用一些可视化工具如ggplot2或heatmap 来展示基因表达的模式和差异。
3. 功能注释。
最后，我们可以对不同表达的基因进行功能注释。
这包括对差异表达基因进行富集分析（enrichment analysis），例如富集在特定的通路（pathway）或生物学过程（biological process）中。
这可以使用工具如DAVID或Enrichr来完成。
此外，我们还可以对差异表达基因进行蛋白质-蛋白质相互作用分析（protein-protein interaction analysis），例如使用STRING数据库来预测蛋白质之间的相互作用网络。
总结。
综上所述，RNA-seq数据分析是一个复杂的过程，涉及到数据预处理、基因表达分析和功能注释等多个步骤。
高通量测序数据分析解释
高通量测序数据分析解释高通量测序是一种用于研究DNA或RNA序列的技术，其产生的数据量较大、速度较快，是现代生物学研究中的重要工具。
数据分析是对高通量测序数据进行处理和解释的过程，目的是从海量数据中提取有意义的信息和结论。
以下将详细介绍高通量测序数据分析的流程和应用。
首先，数据质控是保证数据质量的重要步骤。
通过对测序数据进行质量评估和过滤，可以排除测序中的技术误差和杂质，提高数据的准确性和可靠性。
其次，数据预处理是对原始数据进行预处理，包括去除接头序列、低质量序列和PCR重复序列等。
这可以减少数据量，提高后续分析的效率。
然后，序列比对是将测序数据与参考基因组进行比对，以确定测序数据在基因组中的位置和相似性。
对于DNA测序数据，常用的比对算法有Bowtie、BWA等；对于RNA测序数据，常用的算法有TopHat、HISAT等。
比对结果可以用于进一步的变异检测、差异表达分析等。
接下来，变异检测是对测序数据中的变异进行鉴定和注释。
这些变异可以是单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（InDel）以及染色质结构变异等。
通过与参考基因组的比对结果，可以鉴定测序样本与参考基因组之间的差异，并进行注释，了解变异对基因功能的影响。
最后，功能注释是对已鉴定的变异进行进一步的生物学意义解释。
通过将变异与已知基因、蛋白质、途径等进行关联，可以帮助研究人员理解变异的功能和潜在生物学意义。
高通量测序数据分析在生物学研究中有广泛应用。
其中，基因组测序可用于研究宿主基因组的基因变异、复杂疾病的遗传基础以及生物进化过程等。
转录组测序可用于研究基因的表达模式、差异表达基因的鉴定、剪接变异等。
表观基因组测序可用于研究DNA甲基化、组蛋白修饰等生物学过程的调控机制。
此外，基因组测序还可应用于微生物群落分析、肿瘤突变检测等领域。
总之，高通量测序数据分析是一项重要的技术，可以帮助研究人员从大量的测序数据中提取有意义的信息和结论。
通过对数据的质控、预处理、序列比对、变异检测和功能注释等过程，可以更全面地了解基因组结构和功能，并揭示生物学过程中的变异和调控机制。
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案例一
虽然RNA-seq早已被大家所熟知，特别是在高通量测序越来越便宜的今天，但是RNA-seq数据的分析仍令多数小菜抓狂。
多个软件的使用，参数设置，参考基因组准备，输出结果的解读等等，都让很多初次接触测序数据或者非生物信息专业的人头疼不已。
哈哈，不用怕，有云生信，这都不是事儿！今天我就向大家简单介绍一下如何用云生信做RNA-seq数据的常规分析。
不过在此之前，我要稍稍啰嗦一下RNA-seq的常规分析流程，请不要拍砖头。
图1是RNA-seq数据从产生到分析的常规分析流程：根据实验设计，提取细胞RNA，并将RNA提交给测序公司，就可以坐等测序数据了。
测序公司会根据客户提供的RNA进行建库，上机测序。
拿到测序数据后，就到了我们大显身手的时候了。
首先，我们要对测序结果做个简单的质量评估，剔除低质量的数据。
然后，根据基因组数据（这里我们讲的是基因组数据已知的物种，基因组未知的有套独立的流程，这里不讲），将测序数据组装。
根据组装结果，计算基因或转录本的表达量。
最后，同芯片数据一样，我们可以根据表达量数据做很多分析，如差异表达分析，网络分析（包括蛋白互作网络，共表达网络等），也可以结合临床数据做分析（如预后，亚型分类、关联，药效等）。
图 1. RNA-seq常规分析流程
叨叨完毕，进入正题。
进入尔云后，打开“测序数据处理”模块，我们会看到图2的结果。
在这一模块，我们可以完成RNA-seq数据分析的前两步：1、数据质控和过滤低质量数据；2、基因组组装，计算基因表达量。
对于上面两部，尔云又根据是双端测序还是单端测序，分了两块。
以edgeR 为例，输出的DEGs.txt就是根据我们设定的参数得到的差异表达基因的列表，有geneSymbol, logCPM, PVlue信息。
图 2. 测序数据处理模块
质控结束后，尔云会给出全部的质控结果。
图3是以demo数据为例的双端测序的质控结果，好多好多呀，可以下了慢慢看。
建议主要关注一下xxx_qc_TABLE，该表格是对质控前后的数据统计，反应了测序的好坏。
Clean_xxx.fq是质控后的干净的fastq数据，是第2步组装的输入文件。
图 3.质控结果
组装完成后，会返回一个expression.txt的表达矩阵文件，该文件是下一步差异表达分析的输入分析。
得到表达矩阵后，我们就可以进入到第3步差异表达数据分析。
进入尔云的“差异分析”模块（如下图所示），它针对芯片和测序两种检测技术提供了不同的分析方案。
对于RNA-seq
数据，有DESeq，edgeR和NOISeq三中差异表达分析方法。
小白们只需要输入按照要求输入文件，设置参数，点保存即可。
图 4.差异表达分析模块
在差异分析的基础上，尔云还可以做功能富集分析，KEGG通路展示（作图工具-KEGG 通路做图-pathview），网络分析，同时也可结合临床生存数据做预后分析（作图工具-生存曲线分析）,见图5.
图 5. 后续分析模块
图6是KEGG pathview的示例结果，差异表达的基因用高亮的颜色标注，红色高表达，绿色低表达。
清晰的展示了差异基因在通路中的分布，以及差异表达情况。
图 6. pathview结果
图7是PPI分析结果的一个例子，给出了网络图，以及边的边的列表。
如果用户想自己展示，调整网络，可以表达边的列表输入cytoscape中。
图7. PPI 网络构建
经过上面的几个步骤，我们就完成了RNA-Seq的基本分析流程。
整个过程，我们需要做的只是输入文件，设置参数，点击保存、运行。
So easy,老板再也不用担心我做不了RNA-seq 数据分析了。
参考文献
1.Huber-Keener K J, Liu X, Wang Z, et al. Differential gene expression in tamoxifen-resistant
breast cancer cells revealed by a new analytical model of RNA-Seq data[J]. PLoS One, 2012, 7(7): e41333.
2.Beane J, Vick J, Schembri F, et al. Characterizing the impact of smoking and lung cancer on
the airway transcriptome using RNA-Seq[J]. Cancer prevention research, 2011, 4(6):
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