第五章-荧光分析法
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荧光分析法实验版
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O C COO
荧光物质（荧光素）
菲荧光物质（酚酞）
取代基团
温度 溶剂 pH值
荧光熄灭 由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用，引起荧光强度显著下降的 现象叫做荧光熄灭（quenching ）或猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭 剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化
光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发
光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，
就可得到该荧光物质的激发光谱。
激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长
就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。 物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同 的是纵坐标。
2. 荧光光谱 荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波
由光源发出的光，通过激发单色器后变成单色光，而后照
在荧光池中的被测样品上，由此激发出的荧光被发射单色器收
集后。经单色器分散成单色光而照射在光电倍增管上转换成相
应的电信号，经放大器放大反馈入A/D转换单元，将模拟电信 号转换成相应的数字量。并通过显示器或打印机显示记录下被 测样品的图谱。这就是荧光光度计的基本工作原理。
荧光分析法
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
荧光分析法
荧光分析法
某些物质经紫外线照射后，能立即放 出能量较低（亦即波长较长）的光。
当照射停止后，如化合物的发射在 10-9秒钟内停止，则称荧光
超过此限度即称为磷光。
荧光的波长与被照射物质有关。 以紫外线作激发光源，所发射的
荧光常在可见光区。
测量荧光强度以确定物质含量的方法 叫做荧光分析法，
所使用的仪器叫荧光计
三，荧光分析的操作
1.标准曲线法 先配制一第列浓度由大到小的标准 管C1，C2、C3、、、、、、C1为 浓度最大的标准管 作为起始浓度，置荧光计透光率为 100，调节光栅使检流计指零
然后再测一系列浓度较低的标准管 的透光率，以浓度对透光率作标准 曲线。
标准曲线的另一作法是以空白溶液 为起始浓度，置荧光计透光率于10 或20处，调节光栅使检流计指零， 然后再测一系列浓度较高的标准管 的透光率，作出标准曲线。
6.荧光强度达到最高点所需要的时间不同 有的反应加入试剂后荧光强度立即达 到最高峰
有的反应需要经过15~30分钟才能达到最 高峰
7.有机溶剂中常有产生荧光的杂质， 可用蒸馏法提纯。橡皮塞、软木塞 及滤纸中也常有能溶于溶剂的一些 带荧光的物质。
六.总结
荧光分析法 灵敏度高， 仪器设备相对简单，休积小， 操作较简便 反应时间也较快
但是它也有一些先天的不足限制了它的应 用，那就是只有少数化合物能发射荧光。 这就要靠这座的各位精英们以后多多努 力了
参考文献:
<<空气中有害物质的测定方法>> 中国医学科学院卫生研究所 编
<<定量化学分析简明教程>> 彭崇慧 冯建章 张锡瑜 李克安 赵凤林
<<分析化学>> 中国化学会 中国科学院院箕应用化学研究所主办
某些物质经紫外线照射后，能立即放 出能量较低（亦即波长较长）的光。
当照射停止后，如化合物的发射在 10-9秒钟内停止，则称荧光
超过此限度即称为磷光。
荧光的波长与被照射物质有关。 以紫外线作激发光源，所发射的
荧光常在可见光区。
测量荧光强度以确定物质含量的方法 叫做荧光分析法，
所使用的仪器叫荧光计
三，荧光分析的操作
1.标准曲线法 先配制一第列浓度由大到小的标准 管C1，C2、C3、、、、、、C1为 浓度最大的标准管 作为起始浓度，置荧光计透光率为 100，调节光栅使检流计指零
然后再测一系列浓度较低的标准管 的透光率，以浓度对透光率作标准 曲线。
标准曲线的另一作法是以空白溶液 为起始浓度，置荧光计透光率于10 或20处，调节光栅使检流计指零， 然后再测一系列浓度较高的标准管 的透光率，作出标准曲线。
6.荧光强度达到最高点所需要的时间不同 有的反应加入试剂后荧光强度立即达 到最高峰
有的反应需要经过15~30分钟才能达到最 高峰
7.有机溶剂中常有产生荧光的杂质， 可用蒸馏法提纯。橡皮塞、软木塞 及滤纸中也常有能溶于溶剂的一些 带荧光的物质。
六.总结
荧光分析法 灵敏度高， 仪器设备相对简单，休积小， 操作较简便 反应时间也较快
但是它也有一些先天的不足限制了它的应 用，那就是只有少数化合物能发射荧光。 这就要靠这座的各位精英们以后多多努 力了
参考文献:
<<空气中有害物质的测定方法>> 中国医学科学院卫生研究所 编
<<定量化学分析简明教程>> 彭崇慧 冯建章 张锡瑜 李克安 赵凤林
<<分析化学>> 中国化学会 中国科学院院箕应用化学研究所主办
分子荧光分析法
1.荧光效率
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
第五章 荧光及磷光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象。
光致发光
常见的光致发光现象是荧光和磷光。
荧光:
激发光停止照射后，发光过程持续
10-9-10-6s。
磷光:
激发光停止照射后，发光过程持续 10-3-10s。
分析方法特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个 数量级； ★线性范围宽，试样用量少，方法简便； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外 可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；
活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素和酚 酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有，
芴的荧光强，而联苯的荧光弱。
5.3 影响因素
5.3.1 温度与溶剂效应
溶剂效应
溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。 一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。 特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作 用，如氢键的生成和化合作用。 一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于
12:36:43
去活化 (5) 磷光发射
T1最低振动能级→ S0时产生磷光辐射 10-2-10s，寿命长多了！能量更低！
室 温 无 磷 光
(6) 外部转换 external conversion
激发态分子和溶剂等能量转换 荧光/磷光 消失，称熄灭或猝灭
12:36:43
去活化演示 驰豫 吸收
e
e
e
基态单重态
激发单重态
激发三重态
5.2.2
去活化过程
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能 量；激发态停留时间短、返回速度快的途径，发 生的几率大，发光强度相对大。
传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光分析法原理
荧光分析法原理
荧光分析法是一种基于物质在激发光作用下发出荧光的特性进行分析的方法。
它是一种高灵敏度、高选择性的分析方法，广泛应用于生物医学、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍荧光分析法的原理及其在分析中的应用。
荧光分析法的原理是基于物质在受到紫外线或可见光激发后，发出特定波长的荧光。
这种荧光的强度和波长可以提供关于物质本身性质和环境的信息。
荧光分析法的原理可以简单概括为激发-发射-检测三个步骤。
首先是激发步骤，样品受到紫外线或可见光的激发，激发能量被吸收后，电子跃迁至激发态。
接着是发射步骤，电子从激发态回到基态时，释放出特定波长的荧光。
最后是检测步骤，荧光信号被检测器接收并转换成电信号，通过信号处理得到荧光光谱图。
荧光分析法的应用非常广泛。
在生物医学领域，荧光标记技术被广泛应用于细胞成像、蛋白质检测、基因分析等方面。
通过选择合适的荧光标记物，可以实现对生物样品的高灵敏度、高选择性的检测。
在环境监测中，荧光分析法可以用于检测水体中的有机污染物、重金属离子等。
由于荧光分析法具有高灵敏度和快速响应的特点，因此在食品安全检测中也得到了广泛应用。
总之，荧光分析法作为一种高灵敏度、高选择性的分析方法，具有广泛的应用前景。
通过深入理解其原理，并结合合适的荧光标记物和检测技术，可以实现对各种物质的准确分析和检测。
随着技术的不断发展，相信荧光分析法在各个领域中的应用将会更加广泛，为科学研究和生产实践提供更多可能。
第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法
2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
荧光分析法
四氯化碳的拉曼光与激发光波长相近，即与 荧光波长相差较大，对荧光检测干扰较小。
影响荧光强度的主要因素
是波长比入射光较 长的拉曼散射光。因为物质发射的荧光波长比 激发光（即入射光）波长长。
• 消除溶剂拉曼光干扰的方法： - 选择合适的溶剂
- 改变激发光波长，使拉曼光向短波方向移动 如硫酸奎宁的测定
1.荧光检测的基本原理
14
2.荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum)：固定测量波长， 将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射 下所发射的荧光强度的变化，以IF —λ激发作图，便 可得到荧光物质的激发光谱。 发射光谱或荧光光谱（fluorescence spectrum)：固 定激发光波长和强度, 让物质发射的荧光通过单色 分光,以测定不同波长的荧光强度, 以IF—λ荧光作图 ，便可得到荧光物质的荧光光谱。
（四）、影响荧光强度的外部因素
温度
溶剂
酸度
01
02
03
荧光熄 灭剂
散射光
04
05
1. 温度的影响
• 随温度降低，荧光强度增加。如荧光素钠在 0℃以下，每降10℃荧光效率增加3％。-80 ℃ 时达到100％。
• 原因是温度升高，分子运动速度加快， 碰撞机率增加，使无辐射跃迁增加，因 而降低了荧光；
常见溶剂在不同激发光波长下的拉曼光波长
激发光 波长 248 水 271 溶剂拉曼光波长 乙醇 环己烷 267 四氯化碳 － 氯仿 －
267
313
365 405 436
350
416 469 511
344
405 459 500
344
408 458 499
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2
分子荧光分析法
二、分子发光的分类(按激发的模式 )
分
热致发光
荧光☆
子 光致发光
发 光
场致发光
磷光
化学发光
3
分子荧光分析法
光致发光：物质分子吸收电磁辐射能后，将从基态 跃迁到激发态，处于激发态的分子发射出光的现象， 称为光致发光。最常见形式是荧光和磷光。
荧光分析法：根据物质的荧光光谱的特征及强度对 物质进行定性和定量分析的方法，称之为荧光分析 法。
激发三重态（根据自旋禁阻定律）。
➢ 电子处于激发态（不稳定状态），可通过无辐射跃迁和辐 射跃迁(发光)等方式失去能量，返回基态。
能量传递 途径
无辐射跃迁
辐射跃迁
振动弛豫 内转换 外转换 系间窜跃
荧光
磷光 7
无辐射方式传递途径
（1）振动弛豫
在同一电子能级 中，电子由高振动 能级转至低振动能 级，而将多余的能 量以无辐射形式放 出的过程。
由于（T1→S0）这个跃迁过程 也是自旋禁阻的，其发光速率 较慢，约为10-4-10s。因此，这 种跃迁所发射的光，在光照停 止后，仍可持续一段时间。
13
振动弛豫
内转换
内转换
S2
系间窜跃
S1
能
T1 T2
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷
光
光
S0
l3
l1
l2
l 2
振动弛豫
荧光和磷光产生示意图
14
二、 激发光谱与荧光光谱
4 3 2 1
S0
lex =290nm (MAX)
l
lem= 620nm(MAX)
荧光光谱的特征 （重点） 1.斯托克斯位移(Stokes shift):
荧光发射波长总是大于激发光谱波长的现象。
室温下菲的乙醇溶液荧光光谱
19
2.荧光光谱与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波
长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一电子 激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从 而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱 的形状与激发波长无关。
15
二、 激发光谱与荧光光谱
16
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长（为最大激发波长）和强度，而让荧光物质 发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同发 射光波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧 光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光物质的最大激发波长（lex）和最大发射 波长（lem）是鉴定物质的根据；也是定量测定最 为灵敏的条件。
激发光谱（excitation spectrum）：使不同激发波长 的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固 定发射波长的单色器而照到检测器上，测定不同激 发波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横 坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光 谱。
注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光 谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则 是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。
振动弛豫时间: 10-12 秒数量级
8
（2）内转换
当两个电子激发态之间的能级 非常靠近以至其振动能级有重叠时， 常发生电子由高能级以无辐射方式 转移至低能级的过程。
如右图，处于高激发态（S2）的电 子，通过内转换，转移到低激发态 （S1）的振动能级。
9
（3）外转换
激发分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用而 失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。外转换使 荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭” 或“猝灭”。
17
B. 发射光谱(荧光光谱)
固定激发波长 扫描发射波长 发射光谱的形状与激发波长无关：
分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；
即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降 到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。
C. 激发光谱与发射 IF4800
注意：无论电子开始被激发至哪一个激 发单重态，经过振动弛豫及内转换，均 可回到第一激发单重态的最低振动能级， 然后再以辐射形式发射光而返回至基态 各振动能级上。
荧光的产生在10-7-10-9s内完成。
12
（2）发射磷光
电子由第一激发单重态的最低 振动能级，以系间窜跃方式转 至第一激发三重态，再经三重 态最低振动能级返回至基态时 发射的光，称为磷光。
优点：灵敏度高；选择性好；试样用量少；方法简单。
4
第一节 分子荧光分析法的基本原理（重点）
一、分子荧光的产生 1.分子的电子能级和激发过程
泡利不相容原理
自旋量子数：s = ½ 或-½
E
总自旋量子数：
s si
分子电子能级的多重性：
M 2s 1
单重态（S）：s=0，M=1，分子所处的电子能态。
三重态（T）：s=1，M=3，分子所处的电子能态。
光谱的镜像关系
4400 4000
固定lem=620nm(MAX)
1→ 4
固定lex=290nm (MAX)
1→4
4 3
3600
S1
3200
1→ 3
1 →3
2 1
2800
1→ 2
2400
1→2
2000
1600
1200 800
1→1
400
பைடு நூலகம்
1→1
0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
10
（4）系间窜跃
处于激发态分子的电子发生自 旋反转而使分子的多重性发生变 化的过程。
如图，电子S1的振动能级同T1的振 动能级重叠，则可能发生体系间 跨越S1→T1 ，分子由激发单重态 跨越到激发三重态，荧光强度减 弱甚至熄灭。
11
辐射方式传递途径
（1）发射荧光
物质分子吸收能量被激发后，从 激发单重态的最低振动能级返回 基态时发射出的光，称为荧光。
5
2.荧光的产生
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态 分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为104 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
电子能级的多重性：M=2s+1，s（总自旋量子数）
6
2.荧光的产生
➢ 根据波兹曼分布，分子室温基本处于电子能级的基态，激 发时，基态电子只能跃迁到激发单重态，不能直接跃迁到
第05章 荧光分析法
本章学习目标： 1、掌握分子荧光分析法的基本原理和特点 2、掌握荧光与分子结构的关系以及影响荧光强度
的因素 3 、熟悉荧光定量分析方法及荧光分光光度计
4 、了解分子荧光分析法的应用
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分子荧光分析法
一、什么是分子发光？
处于基态的分子吸收能量后，跃迁 到激发态，当激发态分子以发射光 的形式释放能量，返回基态的过程， 称为分子发光。
分子荧光分析法
二、分子发光的分类(按激发的模式 )
分
热致发光
荧光☆
子 光致发光
发 光
场致发光
磷光
化学发光
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分子荧光分析法
光致发光：物质分子吸收电磁辐射能后，将从基态 跃迁到激发态，处于激发态的分子发射出光的现象， 称为光致发光。最常见形式是荧光和磷光。
荧光分析法：根据物质的荧光光谱的特征及强度对 物质进行定性和定量分析的方法，称之为荧光分析 法。
激发三重态（根据自旋禁阻定律）。
➢ 电子处于激发态（不稳定状态），可通过无辐射跃迁和辐 射跃迁(发光)等方式失去能量，返回基态。
能量传递 途径
无辐射跃迁
辐射跃迁
振动弛豫 内转换 外转换 系间窜跃
荧光
磷光 7
无辐射方式传递途径
（1）振动弛豫
在同一电子能级 中，电子由高振动 能级转至低振动能 级，而将多余的能 量以无辐射形式放 出的过程。
由于（T1→S0）这个跃迁过程 也是自旋禁阻的，其发光速率 较慢，约为10-4-10s。因此，这 种跃迁所发射的光，在光照停 止后，仍可持续一段时间。
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振动弛豫
内转换
内转换
S2
系间窜跃
S1
能
T1 T2
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷
光
光
S0
l3
l1
l2
l 2
振动弛豫
荧光和磷光产生示意图
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二、 激发光谱与荧光光谱
4 3 2 1
S0
lex =290nm (MAX)
l
lem= 620nm(MAX)
荧光光谱的特征 （重点） 1.斯托克斯位移(Stokes shift):
荧光发射波长总是大于激发光谱波长的现象。
室温下菲的乙醇溶液荧光光谱
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2.荧光光谱与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波
长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一电子 激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从 而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱 的形状与激发波长无关。
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二、 激发光谱与荧光光谱
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荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长（为最大激发波长）和强度，而让荧光物质 发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同发 射光波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧 光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光物质的最大激发波长（lex）和最大发射 波长（lem）是鉴定物质的根据；也是定量测定最 为灵敏的条件。
激发光谱（excitation spectrum）：使不同激发波长 的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固 定发射波长的单色器而照到检测器上，测定不同激 发波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横 坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光 谱。
注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光 谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则 是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。
振动弛豫时间: 10-12 秒数量级
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（2）内转换
当两个电子激发态之间的能级 非常靠近以至其振动能级有重叠时， 常发生电子由高能级以无辐射方式 转移至低能级的过程。
如右图，处于高激发态（S2）的电 子，通过内转换，转移到低激发态 （S1）的振动能级。
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（3）外转换
激发分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用而 失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。外转换使 荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭” 或“猝灭”。
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B. 发射光谱(荧光光谱)
固定激发波长 扫描发射波长 发射光谱的形状与激发波长无关：
分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；
即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降 到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。
C. 激发光谱与发射 IF4800
注意：无论电子开始被激发至哪一个激 发单重态，经过振动弛豫及内转换，均 可回到第一激发单重态的最低振动能级， 然后再以辐射形式发射光而返回至基态 各振动能级上。
荧光的产生在10-7-10-9s内完成。
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（2）发射磷光
电子由第一激发单重态的最低 振动能级，以系间窜跃方式转 至第一激发三重态，再经三重 态最低振动能级返回至基态时 发射的光，称为磷光。
优点：灵敏度高；选择性好；试样用量少；方法简单。
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第一节 分子荧光分析法的基本原理（重点）
一、分子荧光的产生 1.分子的电子能级和激发过程
泡利不相容原理
自旋量子数：s = ½ 或-½
E
总自旋量子数：
s si
分子电子能级的多重性：
M 2s 1
单重态（S）：s=0，M=1，分子所处的电子能态。
三重态（T）：s=1，M=3，分子所处的电子能态。
光谱的镜像关系
4400 4000
固定lem=620nm(MAX)
1→ 4
固定lex=290nm (MAX)
1→4
4 3
3600
S1
3200
1→ 3
1 →3
2 1
2800
1→ 2
2400
1→2
2000
1600
1200 800
1→1
400
பைடு நூலகம்
1→1
0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
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（4）系间窜跃
处于激发态分子的电子发生自 旋反转而使分子的多重性发生变 化的过程。
如图，电子S1的振动能级同T1的振 动能级重叠，则可能发生体系间 跨越S1→T1 ，分子由激发单重态 跨越到激发三重态，荧光强度减 弱甚至熄灭。
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辐射方式传递途径
（1）发射荧光
物质分子吸收能量被激发后，从 激发单重态的最低振动能级返回 基态时发射出的光，称为荧光。
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2.荧光的产生
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态 分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为104 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
电子能级的多重性：M=2s+1，s（总自旋量子数）
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2.荧光的产生
➢ 根据波兹曼分布，分子室温基本处于电子能级的基态，激 发时，基态电子只能跃迁到激发单重态，不能直接跃迁到
第05章 荧光分析法
本章学习目标： 1、掌握分子荧光分析法的基本原理和特点 2、掌握荧光与分子结构的关系以及影响荧光强度
的因素 3 、熟悉荧光定量分析方法及荧光分光光度计
4 、了解分子荧光分析法的应用
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分子荧光分析法
一、什么是分子发光？
处于基态的分子吸收能量后，跃迁 到激发态，当激发态分子以发射光 的形式释放能量，返回基态的过程， 称为分子发光。