蛋白质的化学修饰

从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去， 而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白 质的化学修饰。
包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2） 主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而 后者则属于基因重组和定点突变的方法。
a
46
蛋白质化学修饰的意义
改变蛋白质的药代动力学 调节蛋白质的稳定性以及活性 改变蛋白质的空间构象
6. 10% SDS
取10g SDS，加水至100 ml，完全溶解后室温保存。
7. 10%过硫酸铵溶液（AP）
临用前现配。
a
20
8．染色液（0.25% R-250、50%甲醇、7%乙酸）
考马斯亮蓝R-250 2.5 g、 甲醇（可用无水乙醇代替） 500 ml、70 ml冰乙酸， 溶解后补足水至总体积1000 ml。
4. 0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲液pH6.8 （4x）
取5.98 g Tris，用1N HCl调至pH6.8，加水至 100 ml，4℃保存。
a
19
5. 电极缓冲液（pH 8.3）
取 14.49 g甘氨酸，3.02 g Tris，加100 ml 10%SDS，加水至1 升，4℃保存。
a
49
2 反应条件的选择
考虑因素包括pH、反应温度、反应介质以 及缓冲液组成
允许反应顺利进行
不能造成蛋白质的不可逆变性
有利于专一性修饰蛋白质
a
50
修饰反应的类型
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
a
51
二硝基氟苯法(FDNB,DNFaB): 1945年Sanger提出此方法.52
a
25
样品预处理
取样品液与等体积样品缓冲液混合，100℃加热 1～2分钟。
待浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，然后将胶 板固定于电泳装置上，上下槽各加入电极缓冲液。
加样
用微量进样器加样。每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。
a
26
【电泳】
在100 V的电压下电泳，当样品全部 进入分离胶时，加大电压至100 V，当溴 酚蓝达到胶底部，关闭电源。
这种迁移率的不同，就蛋白质分子本身 而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形 状有关。
a
7
当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫 酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只 取决于蛋白质的分子量，从而可推测蛋白 质的分子量。
a
8
SDS的作用原理
SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白 质结合，破坏蛋白质分子之间以及与其它物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改 变原有的空间构象。
因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋 白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋 白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷 量无关。
a
11
当SDS的总量为蛋白量的3～10倍且SDS 单位浓度大于1 mol/L时，这两者的结合是定 量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。
a
12
组成
该电泳系统由两层不连续聚丙烯酰胺凝胶组成
a
41
a
42
四、核磁共振波谱
核 磁 共 振 波 谱 (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).是将具有磁矩的核放入磁场后，用适宜的频率的电磁波照射， 它们就会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信 号，得到核磁共振波谱。在有机化合物中，经常用于1H和13C核的共 振吸收波谱。在生物学方面主要研究生物大分子的结构和分子量。 到目前为止，采用1H 2D-NMR（二维NMR）能解决的最大蛋白质分子 量在10000Da左右。如果采用杂核多维NMR技术，能解决的最大蛋白 质分子量大在25000Da左右。
11．TEMED（四甲基乙二胺）
Tetramethylethylenediamine
a
22
分离胶和浓缩胶的配制
分离胶的浓度
12%
重蒸水 /ml
3.35
1.5M Tris-HCl(pH8.8) /ml 2.5
10%SDS /ml
0.1
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml
4.0
10%过硫酸铵 /μl
50
二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有强烈的黄色荧
光,灵敏性是DNFB法的100倍.
a
53
a
54
巯基的氧化还原反应可以应用于蛋白质结构分 析、包涵体的复性、增加蛋白质可溶性等。
a
33
层析法装置
a
34
a
35
a
36
优点
分离条件温和 回收率高 重复性好 设备简单
缺点
对样品的稀释大 流速慢 操作费时
a
37
a
38
三、质谱法
【原理】
质谱仪是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质 荷比进行分离的装置。离子电离后经过加速进入磁场中。 其动能与加速电压及电荷Z有关。 Z：电荷数
a
43
几种测定蛋白质分子量的方法比较
方法
机理
分子量计算
关键技术
特点
电泳 分子表面电荷 电泳条带(mR)
SDS包裹
单链分子
层析 分子质量
层析峰的位置
介质交联度 球形分子
质谱 质荷比
质谱峰直接标识 样品质子化 整体分子
核磁 核磁共振波谱 核磁谱线计算
磁场能量
整体分子
a
44
蛋白质的化学修饰
a
45
概念
A. 分离胶的阻力（孔径小），浓缩作用 B. 缓冲液离子成分的不同 [（甘氨酸离子 （慢）氯离子（快）]，压缩作用 C .浓缩胶与分离胶之间pH值差（分离胶pH高，
调节慢离子的迁移率）
a
15
▼分子筛效应 大分子运动慢，小分子运动快
▼电荷效应 带电荷多的运动快，带电荷少的运动慢
a
16
【器材】
电泳仪、 垂直板电泳槽、 进样器、 乳头吸管、 50 ml小烧杯
9．脱色液（30%甲醇、7%乙酸）
甲醇（可用无水乙醇代替） 300 ml，冰乙酸70 ml， 补足水至1000 ml。
a
21
10．样品缓冲液（2x）
H2O 2.4 ml，浓缩胶缓冲液1.0 ml、甘油0.8 ml、10% SDS 3.2 ml，b-硫基乙醇0.4 ml，0.025%（W/V）溴 酚兰0.2 ml。
TEMED/μl（最后加，防烧杯中聚合） 5
总体积 /ml
10ml
浓缩胶的浓度 5%
重蒸水/ml
2.92
0.5M Tis-HCl(pH6.8)/ml 1.25
10%SDS /ml
0.05
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml 0.8
10%过硫酸铵 /μl
25
TEMED /μl
5
总体积 /ml
5ml
a
23
上层胶:浓缩胶(stacking or concentration gel) 浓 度 2-5%，缓冲液pH值为6.8
下层胶：分离胶(seperation or resolving gel) 浓 度 5-20%，缓冲液pH值为8.3
a
13
a
14
特点
具有很高的分辨力，这是因为它具有以下三种效应：
▼样品浓缩效应
a
47
化学修饰的原理
影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有： 1 蛋白质功能基的反应性（亲核性） 1.1 基团之间的氢键及静电作用 1.2 基团之间的空间位阻 2 修饰剂的反应性 2.1 选择吸附 2.2 静电相互作用 2.3 位阻因素
a
48
化学修饰的方法学
1 试剂的选择
水解稳定性； 蛋白质的修饰位点，反应类型以及专一性； 修饰剂的大小； 连接键的稳定性、毒性和抗原性； 修饰后是否需要进一步的分离； 是否适于建立快速、方便的分析方法； 是否能够简便经济的合成或购买
分离生物大分子多采用电喷质谱法，属于动态质谱仪。 基本原理是生物大分子在很高的电场下电离。样品溶液以 很低的流速，在高的电场下使生物分子从毛细管中流出來。
a
40
【方法】
样品溶液以很低的流速(1-20μl/分钟)从毛细管中流出来。 在毛细管的柱头上施加一个高电压(1-5kv)，使柱头液体雾化 成很细的带电液滴，这种带电液滴在逆向干燥气流中挥发，使 液滴表面电荷密度增大。直到产生的库仑斥力与液滴表面张力 的雷利极限值相等时，液滴就会发生爆裂，形成更小的子液滴， 这些子液滴又被蒸发，又会形成爆裂。如此循环下去，直到液 滴变得非常小，它的表面的电荷密度变得非常大，形成很强的 电场，并从液滴中解离出带多电荷的分子离子。这些离子是靠 吸附上或丢失若干质子而形成的，所以正离子或负离子谱上会 观察到谱峰。生物大分子在ESI谱上往往是一组带不同的电荷 的分子离子峰。
a
17
【试剂】 1．标准蛋白质：
a
18
2. 30%丙烯酰胺溶液
丙烯酰胺29.2 g， 甲叉双丙烯酰胺0.8 g， 加水至100 ml，棕色瓶4℃保存。
3. 1.5 mol /L Tris-Hcl分离胶缓冲液pH8.8（4x）
取18.15 g Tris， 用1M HCl调pH至 8.8，加水 至100 ml，4℃保存
a
2
蛋白质鉴定的主要参数
蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参 数很多.但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数， 归纳起来主要有以下几种。 (1)蛋白质的质量鉴定(分子量) (2)蛋白质带电性鉴定（等电点） (3)蛋白质结构鉴定(一、二级结构、晶体、肽谱、NC-末端) (4)蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学) (5)免疫学鉴定（抗原-抗体反应、酶联免疫反应）