细胞培养基的Exosome提取方案
外泌体（Exosome）知识与检测方法
外泌体（Exosome）知识与检测方法一、 Exosome 简介最近几年，一种叫做Exosome的小囊泡正受到大家广泛的关注。
Exosome是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。
Exosome天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体(Exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。
Exosome在30年前被人们所发现。
早期的研究认为，exosome 执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。
直到2007年，研究人员发现exosome也运输核酸，参与细胞间通讯。
总之，其蛋白、RNA和脂肪成分特异，且携带了一些重要的信号分子，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用，这使得exosome的市场也在快速扩展，并成为热门的研究对象。
不同组织细胞来源exosome由于携带的蛋白质不同，而能够发挥不同的生物学功能。
例如，肿瘤细胞分泌的exosome能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸；而树突状细胞源性exosome则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。
目前研究发现，Exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且exosome能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故exosome有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。
Exosome携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。
前者可能与exosome的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的exosome，而这些特定细胞源的exosome与其生物学功能有着密切联系，例如分子来源的Exosome上含有MHCII类分子。
二， Exosome 提取Exosome是由活细胞分泌的，它是一种亚细胞成分，组要成分是磷脂双分子和携带的膜性分子，其界定依据形态学和生物化学及提取方式不同细胞源的exosome是不同的，这些不同的理化性质有利于exosome的提取。
大鼠T细胞源性exosome提取方法比较
大鼠T细胞源性exosome提取方法比较孙祯;黄赤兵;宋亚军;陈益荣;李传贵【摘要】目的：采用3种方法从大鼠T细胞培养上清中提取纯化exosome ，以获取高质量的exosome。
方法分别采用Exo-Quick Precipitation提取法、超滤密度梯度离心法、差速离心法提取 T 细胞培养上清中的exosome。
利用透射电镜进行形态学观察，2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠（BCA ）法进行蛋白定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）分析蛋白表达的差异，Western blotting检测白细胞介素2（IL-2）的表达。
结果3种方法均可提取出exosome；ExoQuick Precipitation 提取法、超滤密度梯度离心法所得样本浓度显著高于差速离心法所得样本浓度（P＜0．05）；SDS-PAGE结果显示3种方法所得样本具有蛋白表达强度的差异；Western blotting显示3种方法所得样本均表达IL-2。
结论 ExoQuick Precipitation提取法、超滤密度梯度离心法可获得高纯度、无蛋白丢失的exosome样本。
%Objective The purification methods of the exosomes derived form T cells were established in order to get high quan-tity exosomes .Methods Exosomes from T cells culture supernatants were purified by ExoQuick Precipitation ,ultrafiltration and sucrose gradient centrifugation ,differential ultracentrifugation ,and confirmed via using transmission electron microscopy .The pro-tein expression of the exosomes were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis .Western blotting was used to test the expression of IL-2 .Results The protein concentrationof the exosomes purified through ExoQuick Precipitation ,ultrafiltrationand sucrose gradi-ent centrifugation were higher than through differential ultracentrifugation (P<0 .05) .SDS-PAGE displayed the difference amongthe exosome purified by three methods .Three kinds of exosomes all expressed IL-2 .Conclusion ExoQuick Precipitation ,ultrafiltra-tion and sucrose gradient centrifugation technique can obtain high purity and complete exosome sample .【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2013(000)029【总页数】4页(P3512-3514,3517)【关键词】exosome;Exo Quick Precipitation;超滤密度梯度离心;差速离心【作者】孙祯;黄赤兵;宋亚军;陈益荣;李传贵【作者单位】第三军医大学新桥医院泌尿外科，重庆400037;第三军医大学新桥医院泌尿外科，重庆400037;第三军医大学新桥医院泌尿外科，重庆400037;第三军医大学新桥医院泌尿外科，重庆400037;第三军医大学新桥医院泌尿外科，重庆400037【正文语种】中文Exosome是一种起源于内吞体系统并被排出胞外的膜性囊泡，直径在30～100nm［1］，含有大量与其来源相关的特异性蛋白，并由此发挥不同的功能［2］。
exosomes外泌体实验方案
外泌体分离提纯草案By 朱旭峰一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。
（sigma）1.2快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地细胞和残渣。
超速离心于120,000_g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotorA-641) 4 ℃. 2 小时1.3用1mL 冷的PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃. 2 小时1.4再用100μL 冷的PBS 重悬后转移到低粘附的管中1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL的样品置于卡上，用Direct Detect™(Millipore)2材料a)细胞培养液b)蛋白酶抑制（Sigma）c)过滤筛(Millipore)d)冷的PBSe)低粘附的管f)Direct Detect™(Millipore)二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟4℃1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g 30分钟于4℃来去除较大的囊泡、1.4此阶段的样品可以1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时4℃1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).，1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏2.材料a)蛋白酶抑制（Sigma）b)过滤筛(Millipore)c)冷的PBSd)低粘附的管e)Direct Detect™(Millipore)三、ExoQuick TM化学沉淀法1.1ExoQuick TM的使用要按照厂家提供的说明书来实行1.2该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuick TM试剂盒里的溶液1.3溶液孵化过夜，在4℃温和的摇晃1.4在流式细胞仪缓冲液中洗涤1.5试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可(BD Biosciences) 配合使用CellQuest 的软件。
外泌体提取试剂盒解决方案
外泌体是大多数细胞分泌的40 - 150nm的膜泡，存在于细胞培养基、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶性腹水等生物液体中。
越来越多的证据表明，这些囊泡充当细胞信使，将信息传递给身体内的细胞和组织。
外泌体包含细胞特异性蛋白、脂质和RNA，它们被运输到其他细胞，并改变其他细胞的功能或生理作用。
这些外泌体可能在介导对感染性病原体和肿瘤的适应性免疫反应、组织修复、神经通讯和病原蛋白转移方面发挥作用。
如何提取各种样本类型中的外泌体呢？艾美捷科技作为专业的生命科学领域解决方案供应商，为您推荐Norgen Biotek品牌的外泌体提取试剂盒：1.血浆/血清外泌体提取试剂盒：（Plasma/Serum Exosome Purification Midi Kit；57500）。
使用血浆/血清外泌体提取试剂盒从1 mL和10 mL血浆中纯化的完整外泌体，使用NanoSight®LM10仪器观察如下图：【血浆/血清外泌体提取试剂盒-各品牌横向对比】Norgen的试剂盒分离出55 nm外泌体，回收率为每毫升血浆9.64 x 1013颗粒。
另外与其他两种竞争对手相比，从1mL血浆中纯化的外泌体覆盖50nm-150nm的更宽尺寸范围，血浆浓度更高。
2.尿液外泌体提取试剂盒（Urine Exosome Purification Midi Kit；57800）：图4使用尿液外泌体提取试剂盒从10 mL尿液中纯化的完整外泌体与使用超速离心发相比，使用NanoSight®LM10仪器观察如下图：经过Norgen的试剂盒纯化的外泌体大小从65nm到195nm，总回收率为7.63×108个颗粒/ mL。
【尿液外泌体提取试剂盒-各品牌横向对比】Norgen的试剂盒分离出115 nm外泌体，回收率为每毫升尿液8.36 x 109颗粒。
另外与其他两种竞争对手相比，从5mL尿液中纯化的外泌体覆盖75nm-250nm的更宽尺寸范围，尿液浓度更高。
外泌体提取
外泌体提取
Exosome 分离需知注意： 分离 exosome 前的样品不能加入任何 RNA 保护剂（如 Trizol，RNA later）；已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察， 只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 1. 血清样品（不能加抗凝剂） （1）干燥管采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管； （2）4 度下静置 3~4 小时，可见血块析出（也可放置 4 度冰箱过夜）； （3）5000 rpm，4 度离心 10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000rpm 4度离心 10min，以最大程度保证血清质量。 （4）将血清分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 2. 血浆样品(不能用肝素抗凝) 1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，混匀； 2) 4 度下静置 3~4 小时（也可放置 4 度冰箱过夜），5000 rpm，4 度离心 5min，取上清即为血浆； 3) 可将血浆分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 3. 细胞上清需要提前预备的实验材料：去除 exosome 的血清（自己制备或购买） 1) 培养皿的细胞汇合率达到 80%~90%时； 2) 把原有培养基吸掉，加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）进行消化； 3) 细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化； 4) 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来； 5) 1100rpm，离心 5 分钟； 6) 吸掉上清液，用无 exosome 血清的培养基清洗细胞一次； 7) 1100rpm，离心 5 分钟； 8) 吸掉上清液，加入无 exosome 血清的培养基，悬浮细胞； 9) 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中（ 收集上清时细胞汇合率为60%~80%），继续培养； 10) 培养 48h~72h 后，收集细胞上清； 11) 2000 rpm，离心 10min，然后 10000 rpm, 离心 30min, 去除细胞或者细胞碎片，取上清即可。
尿液exosomes RNA提取 SOP
尿液exosomes RNA提取SOP实验步骤：A.exosome 沉淀——10ML样本起始量（用ExoQuick-TC 分离exosomes）1.尿液离心（3000g,15min,4℃），取上清（沉淀为细胞或细胞碎片）2.转移上清至无菌试管，加入2ML的ExoQuick-TC , 颠倒试管混匀。
3.4℃冷藏过夜（至少12h）（冷藏期间试管需静置，勿旋转）。
4.离心（1500g, 30min,4℃或室温），离心后，exosomes为管底的米黄色/白色小球。
5.去除上清，再次离心（1500g, 5min），尽量去除所有的液体，小心别碰到沉淀。
6.在上步沉淀中加入350ul LYSIS Buffer,涡旋15sB.exosomes RNA提取1.在上步沉淀中加入350ul LYSIS Buffer,涡旋15s；2.室温放置5min(使exosomes裂解完全)；3.加入200ul 100%乙醇（RNAse-free）,涡旋10s；4.将柱子装入收集管，将600ul 上述溶液转移到柱子中；5.离心（13000rpm，1min，4℃）；6.弃废液；7.加入400ul WASH Buffer；8.离心（13000rpm，1min，4℃）；9.重复⑹-⑻，再洗一次（共洗两次）；10.弃废液，离心（13000rpm，2min，4℃）（关键，为了甩干柱子便于更好地洗脱RNA）；11.将柱子转移到新的1.5ml EP管（RNAse-free）中；12.加入30ul Elution buffer 至膜中央；13.离心（2000rpm,2min, 此步为使Elution buffer 浸透膜）；14.增加转速离心（13000rpm,1min, 此步为洗脱RNA）。
15.弃柱子，将提取的RNA立即放-80℃。
exo-fect的原理
exo-fect的原理EXO-FECT技术原理解析引言：EXO-FECT是一种新型的基因转染技术，通过利用细胞外囊泡（exosome）作为载体，将外源基因或RNA引入目标细胞中，实现基因转染和基因表达。
本文将详细介绍EXO-FECT技术的原理及应用。
一、EXO-FECT技术的基本原理1. 细胞外囊泡（exosome）的提取：细胞外囊泡是由细胞分泌的一种小型脂质囊泡，直径约为30-150纳米。
通过超速离心、滤膜或聚合物沉淀等方法，可以从细胞培养上清液、体液或尿液中提取到细胞外囊泡。
2. 外源基因或RNA的包装：将外源基因或RNA通过某种方法导入到细胞外囊泡中，可以利用转染剂、电穿孔或共沉淀等技术实现。
外源基因一般是经过表达载体构建的，可以携带特定的启动子和调控元件，实现基因在目标细胞中的表达。
3. 细胞外囊泡的靶向：通过对细胞外囊泡表面的蛋白质或糖基进行修饰，可以实现细胞外囊泡的靶向。
例如，可以通过修饰特定的抗体或配体，使细胞外囊泡能够选择性地结合到目标细胞表面的受体上。
4. 细胞外囊泡的摄取：经过靶向修饰后的细胞外囊泡可以与目标细胞表面的受体结合，通过内吞作用进入目标细胞内。
在目标细胞内，细胞外囊泡可以与内质网或溶酶体融合，释放出内部的外源基因或RNA。
5. 外源基因或RNA的表达：在目标细胞内，被释放出的外源基因或RNA可以进入细胞核，并与细胞内的转录因子结合，启动特定基因的表达。
这样，外源基因或RNA就可以在目标细胞中发挥作用。
二、EXO-FECT技术的应用1. 基因治疗：EXO-FECT技术可以用于将治疗基因引入患者体内的靶细胞中，实现基因治疗。
例如，可以将修复基因导入到患者的干细胞或肌肉细胞中，用于治疗遗传性疾病或肌肉萎缩等疾病。
2. 肿瘤治疗：EXO-FECT技术可以用于将抗癌基因或siRNA引入肿瘤细胞中，抑制肿瘤的生长和扩散。
通过靶向修饰细胞外囊泡，可以使基因或siRNA选择性地进入肿瘤细胞内，减少对正常细胞的影响。
Exosomes分离方法
人们往往以为，血液、尿液、乳汁和脑脊液这些体液系统是均匀的，不过事情并非这么简单。
蛋白和核酸的确能够在这些体液系统中自由流动。
但也有一些生物分子被包裹在脂质囊泡中，这些囊泡被称为胞外体（Exosome）。
近年来研究者们渐渐发现，这些胞外体中含有大量可以成为生物学指标的分子。
研究者们已经在相应数据库中录入了胞外体的许多分子成分，包括脂质、蛋白和核酸。
比较常用的两个网站是Vesiclepedia和ExoCarta，这两个网站都是澳大利亚La Trobe大学的Suresh Mathivanan开发的。
外泌小体（Exosome）是一种囊泡结构，直径通常在30-150nm，常见于正常体液和病理样本，培养细胞也可分泌。
研究人员已经在血液、唾液、尿液、母乳等中发现外泌小体，其运载的蛋白和核酸涉及其细胞间物资、信息交流，影响和调控着多方面的生理功能，包括肿瘤发生、免疫促进、凋亡调控、血管生成、炎症反应及发育和分化等。
由于在体液中出现，外泌小体对于临床生物标志物检测特别有利。
近年来随着分离纯化技术的提高，关于外泌小体的研究成果颇丰，主要集中于其在细胞间物资交流、通讯方面作用，远期则预计有临床应用的潜力。
因此这一领域已渐成热点。
研究的前提是方便、高效、标准化地分离纯化外泌小体。
这一点上默克密理博已经建立了操作标准（研究通讯备索），相较于需要昂贵的设备及繁琐操作的超速密度梯度离心，用这样的简单流程操作，研究人员对外泌小体的探讨变得简便多了。
超滤方法纯化：简单6步，exosome制备不再成为你的拦路虎∙用Sterifip®真空抽滤对样品进行澄清[目录号SCGP00525; 0.22µm MilliporeExpress PLUS (PES)膜]∙用PBS平衡Amicon® Ultra-15超滤管(目录号UFC901024，10 kDaMWCO)，离心4000g X 10 min。
∙从超滤管内管及收集管吸走PBS。
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细胞培养基上清提取外泌体
外泌体产生细胞（Exosome源细胞）的选取：
293T细胞：常用于基因改造外泌体；
Mouse immature dendritic cells（imDCs）：小鼠未成熟的树突细胞，常用于小鼠in vivo 体内反应使用，产生的外泌体引起的免疫反应极小；
Mouse lymphoma cell line（EL-4）：小鼠淋巴细胞；
各类癌细胞系：常用于研究各个癌产生的外泌体本身特性研究:
……
不同实验的需求不同， Exosome源细胞的细胞选择不同，例如：需要基因改造就选择较容易感染的293T，体内实验就要避免机体的免疫反应，要充分了解实验要求和各个细胞系背景。
Exosome源细胞用量：
以293T为例，2个15cm盘=4.5个10cm 盘=4*107 cells，最终的Exosome 20ul/20ul 可用于体内原位癌3*104/1ul注射给药，15ul/50ul 可用于105 受体细胞培养加药。
P S: 王红阳方法1ug Exosome=5*106 cells，原位癌注射用量5ug，105细胞培养用量1ug。
我约莫算了一下，差不多。
楼上的方法不要定量，更简单方便，以楼上为主。
以293T细胞为例制备Exosome：
1.2盘10cm 盘在60-70%进行病毒感染，1盘感染GFP（control病毒），1盘感染plv-cs
2.0-myc-PD1，病毒感染后16-18h后换液；
2.36-48h后进行传代：准备10盘10cm盘，每盘加入15ml Exosome-free的10%血清的DMEM，放入37°C培养箱备用。
取出2感染好的2盘细胞，迅速用5ml PBS/遍洗涤3遍，加入1ml胰酶，摇匀使每个细胞都孵育胰酶，37°C静置消化1min，加入4ml Exosome-free 的10%血清的DMEM静置，获得5ml细胞悬液，加入到准备好的10盘10cm盘中，获得5盘GFP、5盘plv-cs2.0-myc-PD1稳转293T 细胞系，37°C培养48h；
3.取4根灭菌处理过的50ml管，收集细胞培养基，分装成37.5ml GFP、plv-cs2.0-myc-PD1各两管，进行三步法离心：
✓4°C离心200-300g，5min去细胞，分别小心吸取上清34ml入新的灭菌50ml 管；
✓4°C离心12,000-16,000g，45min去碎片，分别吸取31ml上清入新的灭菌50ml 管，0.22um滤膜（Millipore）过滤，最后62ml左右汇入一管Beckman快速密
封管Beckman Quick seal tubes；
✓Beckman 70Ti 转子4°C超离100,000-110,000g，90-120min，弃上清，用50ul PBS重悬exoxome。
3’.收取上清，进行三步法离心：200-300g 5min去细胞；12,000-16,000g 45min去碎片，0.22um滤膜过滤，用100kDa的超滤管（Millipore）将上清浓缩至200ul，加入15ml PBS 浓缩至50ul。
4.取 1、3、5、15ul/50ul 的Exosome 加入105受体细胞中，培养48h，观察或检测目的基因、药物的摄入情况。
（GFP观察荧光，RNA用RT-PCR，蛋白用WB）。