细胞培养基本知识基本技术
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧细胞培养技术是现代生物学和医学领域中不可或缺的技术之一。
利用细胞培养技术，我们可以研究细胞生长、发育、分化、疾病等方面的基本问题，也可以应用于药物筛选、细胞治疗、工程组织等领域。
本文将向您介绍一些细胞培养技术中的基础知识和操作技巧。
一、选择培养物在进行细胞培养之前，首先需要选择合适的细胞种类和培养物。
常见的培养物包括DMEM、RPMI1640、MEM等等，不同的培养物适用于不同类型的细胞，具体应该根据细胞种类和实验需求来选择。
此外，培养物中一般也会添加一些重要的成分，如胎牛血清、人血清、靶向蛋白、激素等等，这些成分的含量和种类也会影响细胞的生长与生理状态。
二、细胞培养的基本步骤细胞培养的基本步骤包括细胞的分离、细胞的培养和细胞的观察与分析。
1. 分离细胞分离细胞是细胞培养中的关键步骤之一，通常采用酶消化法和机械法两种方式。
通过酶消化法，可以使细胞与培养皿表面解离，从而得到单个或小团细胞；而机械法则是通过振荡或刮擦来达到分离细胞的目的。
2. 细胞的培养将分离好的细胞加入到预先涂覆有培养物的培养皿中，并将培养皿置于恒温箱（37℃，5% CO2）中培养。
在细胞生长的过程中需要定期更换或添加培养物。
3. 细胞的观察与分析细胞的观察可以通过显微镜来实现，观察细胞形态、大小、数量、移动等生长状态；而细胞的分析则可以利用细胞计数仪、细胞分选仪、PCR等技术，对细胞进行数量统计和功能评估。
三、细胞培养常见问题及应对方法在进行细胞培养的过程中，常会遇到一些问题。
例如，细胞不能够生长或生长缓慢；细胞死亡严重；细胞感染等等。
以下是一些常见问题以及针对问题的解决方法：1. 细胞不能够生长或生长缓慢这种情况可能是培养物失活或者浓度不足，这时候需要更换新鲜的培养物，或者调整培养物的含量。
2. 细胞死亡严重细胞死亡可能是由于细胞抗性引起的，这时候可以根据细胞类型来调整培养条件和细胞密度；另外，也有可能是由于感染、缺氧等过程中引起的，需要及时采取相应的处理措施。
实验室细胞培养基本知识
细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。
• 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。 • 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2
环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。
细胞培养中的无菌操作
• 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但 光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。
• 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各 种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须 用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。
细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。
• 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要 也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质， 还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
准备与灭菌
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。 • 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
细胞培养技术总结
细胞的生长特点
体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴壁型和 悬浮型。 贴壁细胞的主要代表是成纤维细胞，一般在接种 后24h内贴壁，刚开始时细胞多呈圆形，随贴 壁时间延长，逐渐伸展成梭形或多边形。传代 后的成纤维细胞12h开始贴壁，24h内完全贴壁。 上皮细胞型、游走细胞型和多形型都属于贴壁 型细胞。 悬浮型细胞包括血液白细胞和癌肿瘤细胞，不需 要附着于底物而于悬浮状态下生长良好。
四、细胞的冻存与复苏
• 细胞冻存和复苏的基本原则：慢冻快融， 可以最大限度的保存细胞活力。 • 目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作 保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的 通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分 渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从 而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。 • 冻存的细胞浓度：正常人的成纤维细胞浓 度： 5×106~1×107细胞/ml
细胞生长的三个阶段
• 潜伏期 ：细胞接种后先悬浮在培养液中，此时细胞 质回缩，胞体呈圆球形，继续培养便开始贴壁， 24h内便可长满瓶壁。 • 对数生长期 ：细胞增殖最旺盛的时期，随细胞数量 不断增多，生长空间逐渐减少，最后细胞互相接触 汇成一片。 • 停滞期：细胞数量达到饱和密度之后，停止增殖， 细胞数量不再增加，但仍有代谢活动，因而培养液 中的营养逐渐耗尽，代谢产物积累，此时需要分离 培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变或者 脱落死亡，故传代应在细胞长满瓶壁80%的时候传 代最好。
注：细胞培养液要贮存在4℃冰箱，避免光照， 试验前放入37℃水浴中温热。
加血清的高糖培养液存放期为六个月，期间 谷氨酰胺会分解，若细胞生长不佳，可以 再添加适量谷氨酰胺。 环境条件：95%空气和5%CO2 的气体； 温度：37℃
三、细胞的消化传代
成纤维细胞生长至高密度时，须分殖至新的培养瓶中， 一般稀释比例为1:3 至1:6。 1.PBS缓冲液、0.25%的胰蛋白酶和含10%的DMEM预先 放入37℃水浴中温热； 2.倒掉培养瓶内旧的培养液，加入4~6ml PBS缓冲液洗 涤残留培养液； 3.加入2~3ml胰蛋白酶，放入37℃ CO2孵箱中消化2~3 分钟，镜检观察，如有细胞间隙变大，细胞质回缩 现象，加入培养液终止消化。 4.用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，加入 离心管中，800rpm离心5min； 5.倾去上清液，加少量培养液重悬细胞，计数后调整 细胞浓度为1×107 /ml，在新的或者灭菌好的培养瓶 加入6ml左右新鲜培养液，将调整好浓度的细胞液 滴入培养瓶中，混匀，做好标记，放入37℃ CO2孵 箱培养。隔天换液。
细胞学的基本知识和技术
细胞学的基本知识和技术细胞学是研究细胞的学科，它是现代生命科学的基础。
细胞是生命体的最基本单位，掌握细胞学的基本知识和技术对于研究生命现象、治疗疾病、开发新药物等方面都有重要的意义。
下面将从细胞的组成、结构、功能、培养和检测等方面介绍细胞学的基本知识和技术。
一、细胞的组成所有生命体都由细胞组成，有的是单细胞生物，有的是多细胞生物。
每个细胞都有细胞膜、细胞浆、细胞核和细胞器等基本组成部分。
细胞膜是一层由脂质分子组成的薄膜，外围包裹着细胞，内部与细胞质相接。
细胞浆是一种胶状物质，包括细胞质、细胞器和溶胶等。
细胞核是控制细胞生长、分裂和代谢的中心，包括染色体、核膜和核仁等。
细胞器是细胞内部的自主生命体，包括内质网、高尔基体、线粒体、溶酶体等多种类型。
二、细胞的结构细胞结构非常复杂，每种细胞有其独特的结构和功能。
例如，细菌细胞没有核和内膜系统，结构比较简单；而真核细胞则包含有明确的核和内膜系统。
另外，细胞表面的膜结构、细胞骨架、纤毛和鞭毛等都是细胞的重要组成部分，它们在细胞的定向移动和细胞间的相互作用中扮演重要角色。
三、细胞的功能细胞有多种功能，主要包括代谢、生长、分裂、传递信息等方面。
细胞代谢是指细胞在维持生命过程中进行的各种化学反应。
生长是细胞增加体积和数量的过程，分裂则是细胞繁殖的过程。
传递信息则是指细胞内外信号的传递和响应，包括神经递质、荷尔蒙、化学介质和免疫因子等。
四、细胞培养技术细胞培养技术是指在体外模拟细胞生长环境，培养细胞进行科学研究和应用开发的一种技术。
细胞培养技术已经成为现代生命科学研究的一项重要工具。
其应用领域包括细胞医学、药理学、人类和动物疾病模型研究、生产生物制品和育种等。
细胞培养技术可以分为原代培养和细胞系培养两种，其操作过程一般包括细胞获取、细胞质量检测和细胞培养、细胞处理等多个步骤。
五、细胞检测技术为了对细胞的生长状态、代谢状态、遗传状态和变异状态等进行分析和比较研究，需要使用细胞检测技术。
细胞培养基本技术
医学实验中心 闾宏伟
主要内容
细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养用液的配制 细胞培养的基本方法 培养细胞活力测定 细胞冻存和复苏 细胞培养的污染和检测
一、基本概念
细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模 拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生 长与增殖的技术。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵 育，细胞自其周围移出并生长。 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。
血清解冻步骤
逐步解冻法
–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可 分装40～45 ml。
勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变 太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
无机盐
CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、 NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性 及溶液的酸碱度都是必须的。
酶液等均采用滤过法除菌。
安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝
上，否则起不到过滤的作用。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2 使用CO2培养箱应注意的问题：
。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，
以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 ③箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
细胞培养基本知识
（2） 传代期培养：初代培养的细胞生长到一定 程度，即可连接传代，使其连续生长。一般正常 二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代， 此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、
停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。
这一转折点有人称之危象临界点（crisis），有 些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞 可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们 称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。
（3） 细胞作为生命活动的基本单位的共同特点： 首先所有细胞 表面均有一层脂蛋白成分的生物 膜，即细胞膜，使细胞能与周围环境保持相对独 立性； 其次，所有细胞都有两种核酸，即DNA和RNA 作为遗传信息的复制和转录的物质基础； 第三作为蛋白质合成的“机器”-核蛋白，是一 切细胞不可缺少的基本结构； 第四所有细胞都是以一分为二的分裂方式增殖。 第五，细胞具有多样性，形状、大小悬殊很大， 结构复杂程度也很不一样。
株（Cell strain)
4. 组织（细胞）培养的医学生
物学意义
（1） 培养的组织器官或细胞，能在一定范围和 程度上反映生命活动规律和机体功能特点。培养 的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物
质基础
（2） 细胞培养与生物工程：细胞培养技术已经 成为商品化生物技术的核心。如目前可提供的产 品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗、乙肝疫苗； 非抗体型免疫调节剂：干扰素、白介素、集落刺
（3） 衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生 增殖缓慢，逐 渐停止，进而发生衰退、死亡， 多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所
谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，
这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人 胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人 的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。
细胞培养相关知识点
细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。
常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。
1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。
常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。
2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。
3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。
细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。
4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。
常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。
5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。
常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。
6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。
7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。
注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。
细胞组织培养技术3篇
细胞组织培养技术第一篇：细胞培养技术的基础知识细胞培养技术是生物学及其相关领域中的一个重要分支，其通过在体外培养已经分离出来的组织和细胞，以及从原料中获得的其他细胞或细胞系，来进行生物学及医学相关的实验研究，具有广泛的应用价值。
细胞培养技术的起源可以追溯到19世纪末期，当时生物学家Robert Koch首先建立了来自斑点病人的细菌培养技术，从而开创了细菌研究的全新领域。
20世纪上半叶，细胞生物学家和肿瘤学家开始将植物和动物细胞培养的方法应用于研究，逐渐发展出了细胞培养技术的基础知识。
在现代细胞培养技术中，主要包括以下几个方面：1.细胞培养基的制备细胞培养基是进行细胞培养的最基本要素，其基本成分包括营养物质、激素、生长因子等。
常见的细胞培养基有DMEM、RPMI1640、MEM等，此外还有更为复杂的定制培养基，其成分和配比需要根据不同的实验要求而定。
2.细胞培养条件的控制细胞培养需要一些特殊的环境条件，如适宜的温度、湿度、物质浓度、气体含量等。
实验时需要定期检查细胞培养条件是否合适，从而保证细胞的正常生长和増殖。
3.细胞培养器的选择细胞培养器主要有平底培养皿、培养瓶、滚筒式培养器等，不同的培养器在不同的实验中会有不同的选择，从而满足不同的实验要求。
4.细胞的分离和传代细胞在培养中会出现一些问题，如纷繁多样的细胞类型、生长速度过快或过慢、细胞死亡等。
此时需要进行细胞分离和传代，将健康的细胞分离出来，进行下一轮的培养或实验。
以上是细胞培养技术的基础知识，掌握了这些基础知识之后，才能够更好地进行实验和开展研究工作。
第二篇：细胞培养技术在医学研究中的应用细胞培养技术的广泛应用在许多领域都产生了积极的影响，其中医学研究成为了细胞培养技术应用最为广泛的领域之一。
细胞培养技术在医学研究中的应用有以下几个方面。
1.药物筛选细胞培养技术在医药研究中有着广泛的应用，其中药物筛选是其最为重要的应用之一。
通过对不同细胞系的培养实验，可以筛选出对某种疾病有治疗作用的药物，并对其进行实验验证。
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• 1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培 养法，首建长期传代的L-细胞系。
• 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
• 从50年代末开始，组织培养技术应用进入 了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和 医学研究各个领域。
无血清培养
无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在
• 测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞 活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本 参数之一。
• 饱和密度：在特定条件下，培养器皿内能
达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞 群体停止繁殖。
• 潜伏期/滞留期 • 指数增长期 • 平台期/停滞期 • 退化或死亡
• 细胞系的生长过程
• 细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为
• 1907 年 -Harrison用细胞培养解决一个难题 • 盖玻片覆盖凹型载玻片悬滴培养法
悬滴培养法基本步骤
1、在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆和 植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。
2、在凹载片周围涂凡士林。将凹载片向 下压向盖玻片
3、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。 放入培养箱培养
• 1910 至 1923年 – Carrel 和早期的组织培养 • 卡氏瓶培养法
• 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
细胞增殖密度抑制
• 当细胞生长汇合形成单层时，细胞变得比 较拥挤，这时其分裂停止，这种细胞可在 静止状态下维持存活一段时间，但不会继 续分裂生殖。
• 转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们 的接触抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以 增殖至较高的终末细胞密度。
细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。
• 细胞株：通过筛选或克隆化，从原代细胞或细胞
系中获得具有特殊性质或标志物的细胞。
• 细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状
上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系
• 有限细胞系：如果不能
继续传代或传代有限， 可称为有限细胞系。
• 连续细胞系：能够连续
传代的细胞叫做“连续 细胞系或无限细胞系。 可培养50代以上并无限 培养下去。
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。
• 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。
细胞培养的基本知识、 基本技术
医学院 中心实验室
谷景义Leabharlann 主要内容： • 1、细胞培养基本知识 • 2、培养细胞生长的条件 • 3、细胞培养的基本技术
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
培养细胞的特性3 -生长过程
• 单个细胞增殖：细胞周期
• 高等生物体，细胞周期时间的长短变化主 要集中在G1期，S，G2和M期基本保持稳 定。
• Hela 8-16h 5-9h 2-8h
20-28h
一群细胞的增殖：细胞生长曲线
• 接种后，每天进行检测计数，以细胞数为 纵坐标，以时间为横坐标，绘制成曲线。
• 大多数的二倍体细胞为 有限细胞系。无限细胞 系大多已发生变异。
• 原代细胞：从机体取得组织材料，在体外
培养生长，到第一次传代前。
• 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段
时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。
培养瓶培养法
方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放
入培养箱进行培养。
优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物 的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作， 以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
• 目前常用的三维培养模型： 基质覆盖培养 旋转烧瓶培养 微载体培养 预置支架培养 旋转细胞培养系统 自发性细胞聚集
细胞培养技术的特点及应用
优点： 1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体 内的细胞。
应用
• 病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产…… • 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体…… • 遗传学：染色体分析…… • 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物…… • 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变…… • 细胞毒实验：药效测试…… • 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分
培养板培养法
方法：将培养细胞接种在培养 板的孔内，然后在CO2培养箱 内培养。应培养量较小也称为 微量培养。
悬滴培养法也称植块悬滴培养法，是最早
建立的体外培养技术
基本要点：将组织或器官植块接种在一张盖
玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使 植块及营养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹 形载片之上，最后用溶蜡密封后放入培养箱中 培养。
往往针对性很强，价格偏高。
三维细胞培养技术
• 将具有三维结构不同材料的载体与各种不 同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能 够在载体的三维立体空间结构中迁移、生 长, 构成三维的细胞-载体复合物。
• 普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失 了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在 体内进行, 但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境 相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程，且难以研究中 间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验 之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现 细胞培养的直观性及条件可控性的优势。
体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含 个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加 组分两大部分。
观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他 生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子； 又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、 生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获 得它们的分泌产物。