实验室细胞培养基本知识ppt课件
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动物细胞培养技术ppt课件
常用的排除微生物污染的方法
抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓 度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养物，有时可能奏 效。
加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的 细胞至于41摄氏度作用5～10h（最长可达18h），以杀灭支 原体。
动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或 腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细 胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤 细胞进行培养
2、上皮型细胞：
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同
来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍 生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形， 中有圆形核
生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层— 铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个 活动
3、游走细胞型：
呈散在生长，一般不连成片，胞质常 突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细 胞相区别。
4、多型细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以确定其 规律和稳定的形态，可统归于此类。
（二）悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易 大量繁殖。
(二) 细胞的营养
培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增 殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞 营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还 提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一， 含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养 成分 。
其它成分（条75%酒精泡2—3秒钟 （时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再 用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置 平皿中。
《细胞培养培训》课件
细胞培养过程中产生的废液和 废弃物不可随意处理。实验室 应该制定废物处理计划并妥善 处理、处置，确保环保。
结
1 细胞培养中的安全问题
在进行细胞培养操作时需要注意一些安全问题，如在安全柜操作，穿戴实验外套和化、功能化和量化方向发展，国内企业正加紧提升技术水 平和产业化水平。
细胞培养培训
细胞培养是生物技术和医学研究中不可或缺的重要技术之一。在本次培训中， 我们将全面介绍细胞培养的基本概念、操作流程和常见问题解决方法。欢迎 大家踊跃参与！
介绍
1 定义
2 重要性
细胞培养是指通过在无菌 环境下加入合适的营养液， 使人类或动物细胞在体外 的人工环境中生长和繁殖 的技术。
细胞培养是研究生命科学 和药物研发不可缺少的技 术。它能够帮助我们理解 细胞的生长、分化、凋亡 和信号传导等基本生理过 程。
2
殖，以获得足够的细胞数量用于实验。 细胞传代技术可以使细胞连续繁殖多代
细胞凋亡是指由一系列信号调控的正常
并保持生物学特性。
细胞死亡程序。在细胞培养中凋亡的部
分或全部细胞可能会影响实验结果。因
此，细胞凋亡检测技术成为了细胞培养
3
细胞培养蛋白表达技术
的重要技术方法。
细胞培养蛋白表达技术是指通过转染外
源性质粒或病毒载体进入细胞，使细胞
3 应用场景
细胞培养技术广泛应用于 基础研究、药物筛选、生 物材料研究、环境毒理学 等领域。
细胞培养的基本概念
细胞种类
主要包括原代细胞、细胞株、酶处理细胞等。不 同种类的细胞具有不同的生长要求，因此对于细 胞的选择要根据科学研究的需要作出选择。
细胞培养的条件
温度、CO2浓度和通气等条件对于细胞培养的影 响非常大。合理的培养条件是保证细胞生长和繁 殖的前提。
结
1 细胞培养中的安全问题
在进行细胞培养操作时需要注意一些安全问题，如在安全柜操作，穿戴实验外套和化、功能化和量化方向发展，国内企业正加紧提升技术水 平和产业化水平。
细胞培养培训
细胞培养是生物技术和医学研究中不可或缺的重要技术之一。在本次培训中， 我们将全面介绍细胞培养的基本概念、操作流程和常见问题解决方法。欢迎 大家踊跃参与！
介绍
1 定义
2 重要性
细胞培养是指通过在无菌 环境下加入合适的营养液， 使人类或动物细胞在体外 的人工环境中生长和繁殖 的技术。
细胞培养是研究生命科学 和药物研发不可缺少的技 术。它能够帮助我们理解 细胞的生长、分化、凋亡 和信号传导等基本生理过 程。
2
殖，以获得足够的细胞数量用于实验。 细胞传代技术可以使细胞连续繁殖多代
细胞凋亡是指由一系列信号调控的正常
并保持生物学特性。
细胞死亡程序。在细胞培养中凋亡的部
分或全部细胞可能会影响实验结果。因
此，细胞凋亡检测技术成为了细胞培养
3
细胞培养蛋白表达技术
的重要技术方法。
细胞培养蛋白表达技术是指通过转染外
源性质粒或病毒载体进入细胞，使细胞
3 应用场景
细胞培养技术广泛应用于 基础研究、药物筛选、生 物材料研究、环境毒理学 等领域。
细胞培养的基本概念
细胞种类
主要包括原代细胞、细胞株、酶处理细胞等。不 同种类的细胞具有不同的生长要求，因此对于细 胞的选择要根据科学研究的需要作出选择。
细胞培养的条件
温度、CO2浓度和通气等条件对于细胞培养的影 响非常大。合理的培养条件是保证细胞生长和繁 殖的前提。
细胞培养知识
细胞培养基础知识细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
2、优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清。
血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。
3、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。
在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。
因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。
4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
5、合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。
细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。
干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。
1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质：氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。
其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。
但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。
主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
实验室细胞培养基本知识
• 引进的培养物（如购买的细胞系）是高危污染源，要先经过检 疫，并坚持用不含抗生素的培养基培养直至证明没有污染。
细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。
• 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。 • 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2
环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。
细胞培养中的无菌操作
• 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但 光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。
• 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各 种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须 用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。
细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。
• 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要 也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质， 还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
准备与灭菌
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。 • 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。
• 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。 • 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2
环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。
细胞培养中的无菌操作
• 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但 光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。
• 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各 种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须 用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。
细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。
• 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要 也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质， 还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
准备与灭菌
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。 • 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
细胞生物学实验PPT课件
细胞生物学实验ppt课件
目录
• 引言 • 细胞生物学基础知识 • 实验操作流程 • 实验结果分析 • 结论
01 引言
实验目的
01
02
03
04
掌握细胞生物学的基本 实验技能
了解细胞的结构和功能
学习细胞培养和细胞转 染技术
探究细胞信号转导的机 制
实验背景
细胞是生命的基本单位，是生物体结 构和功能的基础
能量转换
细胞中的线粒体和叶绿体 可以将光能或化学能转换 为细胞可利用的ATP等能 量形式。
信息传递
细胞通过分泌化学信号和 电信号传递信息，协调各 种生理活动。
细胞的生命活动
细胞分裂
通过有丝分裂和减数分裂，细胞 可以复制自身并产生新的子细胞。
细胞分化
在发育过程中，细胞会逐渐失去其 全能性，并获得特定的功能和形态。
定性分析
根据实验结果，对实验现象进行解释 和推理，探究可能的机制和影响因素 。
结果解读与讨论
结果解读
根据实验结果，结合理论知识，对实验结果进行解释和解读，明确实验目的和 结论。
结果讨论
对实验结果进行深入讨论，探讨实验的局限性和改进方向，提出可能的假设和 研究方向。
05 结论
实验总结
实验目的
通过实验，学生能够掌握细胞生物学的基本实验技能，了 解细胞的结构和功能，以及细胞的生命活动规律。
实验步骤
实验包括细胞培养、显微观察、细胞计数等步骤，每个步 骤都有详细的操作说明和注意事项。
实验原理
实验涉及细胞培养、显微观察、细胞计数等技术，通过这 些技术，学生可以深入了解细胞的结构和功能，以及细胞 分裂、分化等生命活动过程。
实验结果
实验结果清晰，学生能够观察到细胞的形态、结构和功能 ，并得出准确的实验结论。
目录
• 引言 • 细胞生物学基础知识 • 实验操作流程 • 实验结果分析 • 结论
01 引言
实验目的
01
02
03
04
掌握细胞生物学的基本 实验技能
了解细胞的结构和功能
学习细胞培养和细胞转 染技术
探究细胞信号转导的机 制
实验背景
细胞是生命的基本单位，是生物体结 构和功能的基础
能量转换
细胞中的线粒体和叶绿体 可以将光能或化学能转换 为细胞可利用的ATP等能 量形式。
信息传递
细胞通过分泌化学信号和 电信号传递信息，协调各 种生理活动。
细胞的生命活动
细胞分裂
通过有丝分裂和减数分裂，细胞 可以复制自身并产生新的子细胞。
细胞分化
在发育过程中，细胞会逐渐失去其 全能性，并获得特定的功能和形态。
定性分析
根据实验结果，对实验现象进行解释 和推理，探究可能的机制和影响因素 。
结果解读与讨论
结果解读
根据实验结果，结合理论知识，对实验结果进行解释和解读，明确实验目的和 结论。
结果讨论
对实验结果进行深入讨论，探讨实验的局限性和改进方向，提出可能的假设和 研究方向。
05 结论
实验总结
实验目的
通过实验，学生能够掌握细胞生物学的基本实验技能，了 解细胞的结构和功能，以及细胞的生命活动规律。
实验步骤
实验包括细胞培养、显微观察、细胞计数等步骤，每个步 骤都有详细的操作说明和注意事项。
实验原理
实验涉及细胞培养、显微观察、细胞计数等技术，通过这 些技术，学生可以深入了解细胞的结构和功能，以及细胞 分裂、分化等生命活动过程。
实验结果
实验结果清晰，学生能够观察到细胞的形态、结构和功能 ，并得出准确的实验结论。
细胞培养技术_第一讲
消化液
(1) 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落
并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。
(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶
克隆培养（clone culture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距 离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。
群体培养（左）和克隆培养（右）
原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集 落形成，细胞围绕中心漩涡状排列﹙×100﹚
原代培养第7天，多个集落形成并融合﹙×100﹚
细胞系：500元/每株
菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送 二次（周一，周五）。
二、细胞的生长条件 细胞的营养
碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素
细胞培养常用液体
水 平衡盐溶液 pH调节液 消化液 抗生素溶液 培养基
近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术， 各国建立细胞库
我国组织培养的发展
20世纪30年代传入我国。
20世纪50年代起步。
20世纪70年代，成为医学和生物学研究 中普遍应用的手段。
细胞培养的优点
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、 生命活动。
2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素） 利用方法：研究技术、记录方法
常用培养器皿及清洗消毒
玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤
第十一章动物细胞培养基础知识
液、促进细胞贴壁得胶原类物质在培养某些特殊细胞时也不可缺 少。
(一)、培养基
▪ (1)、天然培养基
▪ 血清得种类 :主要就是牛血清,在培养某些特殊细胞 时也用人血清、马血清等。
▪ 牛血清还分为小牛血清、新生牛血清与胎牛血清。 一般使用得为小牛血清,小牛血清取自出生10～30 天得小牛。
(一)、培养基
倍浓缩液,配制时应加温至30℃,完全溶解后过滤除菌,分 装至小瓶,储存于-20℃。
(三)、其她培养用液
▪ 4、抗生素液
▪ 常用得就是青链霉素,俗称“双抗溶液”。青霉素主要 对革兰阳性菌有效,链霉素主要对革兰阴性菌有效。
▪ 青霉素使用得终浓度为100000U/L,链霉素使用得终浓 度为0、1g/L。一般配制成100倍浓缩液,可用PBS或 培养基配制。
▪ 用过得橡胶制品:同玻璃器材得清洗
二、常用器具得清洗消毒方法
▪ 1、清洗
▪ (3)塑料器皿
▪ 2%NaOH浸泡过夜 2~5% HCl 浸泡 30min 蒸馏水洗
▪ (4)金属器皿
▪ 洗衣粉洗涤 蒸馏水洗
酒精棉球擦拭晾干
二、常用器具得清洗消毒方法
▪ 2、消毒 ▪ 物理:热力灭菌 、电离辐射、紫外灭菌
度较低、生长较困难得情况
▪ RPMI1640
(一)、培养基
▪ (2)、合成培养基
▪ ②无血清培养基
▪ 虽然基础培养基加少量血清所配制得完全培养基可以满足大 部分细胞培养实验得要求,但对有些实验却不适合,如观察一种 生长因子对某种细胞得作用,又如测定某种细胞在培养过程中 分泌某种物质(抗体、生长因子)得能力。
▪ NaHCO3 ＋H2O ←→ Na++HO-+H2O+CO2 ↑
(一)、培养基
▪ (1)、天然培养基
▪ 血清得种类 :主要就是牛血清,在培养某些特殊细胞 时也用人血清、马血清等。
▪ 牛血清还分为小牛血清、新生牛血清与胎牛血清。 一般使用得为小牛血清,小牛血清取自出生10～30 天得小牛。
(一)、培养基
倍浓缩液,配制时应加温至30℃,完全溶解后过滤除菌,分 装至小瓶,储存于-20℃。
(三)、其她培养用液
▪ 4、抗生素液
▪ 常用得就是青链霉素,俗称“双抗溶液”。青霉素主要 对革兰阳性菌有效,链霉素主要对革兰阴性菌有效。
▪ 青霉素使用得终浓度为100000U/L,链霉素使用得终浓 度为0、1g/L。一般配制成100倍浓缩液,可用PBS或 培养基配制。
▪ 用过得橡胶制品:同玻璃器材得清洗
二、常用器具得清洗消毒方法
▪ 1、清洗
▪ (3)塑料器皿
▪ 2%NaOH浸泡过夜 2~5% HCl 浸泡 30min 蒸馏水洗
▪ (4)金属器皿
▪ 洗衣粉洗涤 蒸馏水洗
酒精棉球擦拭晾干
二、常用器具得清洗消毒方法
▪ 2、消毒 ▪ 物理:热力灭菌 、电离辐射、紫外灭菌
度较低、生长较困难得情况
▪ RPMI1640
(一)、培养基
▪ (2)、合成培养基
▪ ②无血清培养基
▪ 虽然基础培养基加少量血清所配制得完全培养基可以满足大 部分细胞培养实验得要求,但对有些实验却不适合,如观察一种 生长因子对某种细胞得作用,又如测定某种细胞在培养过程中 分泌某种物质(抗体、生长因子)得能力。
▪ NaHCO3 ＋H2O ←→ Na++HO-+H2O+CO2 ↑
细胞培养基本技术
研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识
医学实验中心 闾宏伟
主要内容
细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养用液的配制 细胞培养的基本方法 培养细胞活力测定 细胞冻存和复苏 细胞培养的污染和检测
一、基本概念
细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模 拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生 长与增殖的技术。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵 育，细胞自其周围移出并生长。 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。
血清解冻步骤
逐步解冻法
–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可 分装40～45 ml。
勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变 太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
无机盐
CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、 NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性 及溶液的酸碱度都是必须的。
酶液等均采用滤过法除菌。
安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝
上，否则起不到过滤的作用。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2 使用CO2培养箱应注意的问题：
。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，
以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 ③箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
医学实验中心 闾宏伟
主要内容
细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养用液的配制 细胞培养的基本方法 培养细胞活力测定 细胞冻存和复苏 细胞培养的污染和检测
一、基本概念
细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模 拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生 长与增殖的技术。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵 育，细胞自其周围移出并生长。 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。
血清解冻步骤
逐步解冻法
–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可 分装40～45 ml。
勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变 太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
无机盐
CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、 NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性 及溶液的酸碱度都是必须的。
酶液等均采用滤过法除菌。
安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝
上，否则起不到过滤的作用。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2 使用CO2培养箱应注意的问题：
。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，
以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 ③箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一 定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、 维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体 (O2、CO2)，并可调节其 物理化学环境 (pH、渗透压、温度
• 避开机体自身调节和实验应激的整体因素的影响； • 环境控制、均一性（可以使用一批同源细胞获得稳定、可重复的结
• 液氮 (N2) 冷冻柜或冻存 容器
• 灭菌器 (即：高压灭菌器)
• 扩增设备： • 抽吸泵 (蠕动泵或真空泵) • pH 计 • 共聚焦显微镜 • 流式细胞仪
• 其他用品： • 细胞培养容器 (例如：培 养瓶、培养皿、滚瓶、 多孔板) • 吸管和移液器 • 注射器和针头 • 废物容器 • 培养基、血清和试剂 • 细胞系
.
23
配置完全培养基
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水，置于磁力搅拌器上，设定200r/min，边 搅拌边加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸 钠）；
• 用注射器吸取超纯水，将包装袋内残留培养基洗下；
• 干粉溶解后加入2.438g NaHCO3，搅拌至完全溶解；
.
17
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
• 热稳定的液体：水、盐溶液和适度热稳定的塑料制品：硅 树 脂 、 尼 龙 、 聚 丙 烯 、 聚 碳 酸 酯 用 湿 热 灭 菌 ： 121 ℃ ， 20min；
• 不耐热液体：过滤除菌； • 不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。
却后使用； • 100目和600目的筛网需要超声清洗。
.
20
塑料制品的清洗和灭菌
• 将塑料制品放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂（Decon） 的洗液中浸泡30min，自来水冲洗干净；
• 置于超声清洗器中清洗30min； • 用自来水充分清洗后用去离子水清洗（塑料制品要用专用的
刷子或者将自来水连上胶管伸进塑料管内部冲洗）； • 将离心管的盖子和管体分开用图纸包起来，直立放入灭菌锅
.
18
灭菌方式的选择
项目
消毒方式
玻璃器皿
干热
金属制品
干热
带螺口盖的玻璃品 高压灭菌，将盖悬 松
玻璃移液管
干热
枪头
高压灭菌
离心管(5ml，15ml， 高压灭菌，直立放
50ml)
置
EP管(1.5ml，2ml， 高压灭菌 5ml，10ml)
试管
干热
艾本德移液器（新） 高压灭菌，整支
高压灭菌 琼脂 蛋白胨 EDTA 甘油 HEPES 甲基纤维素 酚红 盐溶液 水
中湿热灭菌121℃，20min（高速离心管尤其注意灭菌时要 直立放置）； • 自然冷却后置于烘箱中烘干。
.
21
水的制备和灭菌
• 细胞培养需要用超纯水（UPW）； • 第一：反向渗透或蒸馏；第二：碳过滤去除有机或无机胶
体（总有机碳TOC ≤10ug/L）；第三：去离子（电阻 ≥10MΩ/cm）； • 高压灭菌121℃，20min，自然冷却。
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5
细胞培养实验室
隔间
走廊
二更
一间
二间
三间
一更
准备室
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6
细胞培养设备
• 基本设备：
• 细胞培养通风橱 (即：层 流通风橱或生物安全柜)
• 培养箱 (推荐使用湿式二 氧化碳培养箱)
• 水浴锅
• 离心机
• 冰箱和冰柜 (–20°C) • 细胞计数器 (例如：
Countess® 自动细胞计数 器或血球计数器) • 倒置显微镜
细胞培养基本知识
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细胞培养基本概念
• 细胞培养：从动物或植物中取出细胞，使其在合适的人工环境中生长。
• 细胞来源：细胞可直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离， 也可来自已经建立的细胞系或细胞株。
• 原代培养：是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖， 直到占据所有可用基质(即：汇合) 的培养阶段。
果）、经济、规模和机械化；
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4
细胞培养的应用
• 细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术，可为细胞正常生 理和生化 (例如：代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的 作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可用于 药物筛选和开发以及生物化合物 (例如：疫苗、治疗性蛋白) 的大规模 生产。
• 传代培养：在细胞生长至汇合，必须将细胞转移到新的容器中并更换 新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。
• 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。
• 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中 明确地选择出来，就成为一个细胞株。
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2
细胞培养基本概念
• 有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后 就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这 种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞 系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生， 也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力 后，就成为连续细胞系。
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7
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
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准备与灭菌
过滤 氨基酸 抗生素 牛血清白蛋白 胶原酶 药物 谷氨酸盐 生长因子 HCL NaHCO3 NaOH 血清 丙酮酸钠
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胰蛋白酶
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玻璃器皿、金属器皿的清洗和灭菌
• 将玻璃和金属器皿放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂 （Decon）的洗液中，侵泡过夜或至少2h（铝、铜制品不得浸 泡）;
• 试管刷清洗，自来水冲洗4次，去离子水冲洗3次； • 倒置于烘箱中烘干； • 铝箔封口保存； • 使用前24~48h，放入干热灭菌箱中，160℃灭菌1h，自然冷
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PBS的制备
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水； • 放在磁力搅拌器上，设定转速200r/min； • 打开PBS干粉（1L装）加入烧杯中； • 搅拌至完全溶解； • PH计检测PH为7.4，变化＜0.1； • 分装至灭菌的储液瓶中，盖子只轻旋一圈，放入灭菌锅中湿热灭菌； • 自然冷却后盖紧，4℃或室温保存。
• 避开机体自身调节和实验应激的整体因素的影响； • 环境控制、均一性（可以使用一批同源细胞获得稳定、可重复的结
• 液氮 (N2) 冷冻柜或冻存 容器
• 灭菌器 (即：高压灭菌器)
• 扩增设备： • 抽吸泵 (蠕动泵或真空泵) • pH 计 • 共聚焦显微镜 • 流式细胞仪
• 其他用品： • 细胞培养容器 (例如：培 养瓶、培养皿、滚瓶、 多孔板) • 吸管和移液器 • 注射器和针头 • 废物容器 • 培养基、血清和试剂 • 细胞系
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配置完全培养基
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水，置于磁力搅拌器上，设定200r/min，边 搅拌边加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸 钠）；
• 用注射器吸取超纯水，将包装袋内残留培养基洗下；
• 干粉溶解后加入2.438g NaHCO3，搅拌至完全溶解；
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灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
• 热稳定的液体：水、盐溶液和适度热稳定的塑料制品：硅 树 脂 、 尼 龙 、 聚 丙 烯 、 聚 碳 酸 酯 用 湿 热 灭 菌 ： 121 ℃ ， 20min；
• 不耐热液体：过滤除菌； • 不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。
却后使用； • 100目和600目的筛网需要超声清洗。
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塑料制品的清洗和灭菌
• 将塑料制品放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂（Decon） 的洗液中浸泡30min，自来水冲洗干净；
• 置于超声清洗器中清洗30min； • 用自来水充分清洗后用去离子水清洗（塑料制品要用专用的
刷子或者将自来水连上胶管伸进塑料管内部冲洗）； • 将离心管的盖子和管体分开用图纸包起来，直立放入灭菌锅
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灭菌方式的选择
项目
消毒方式
玻璃器皿
干热
金属制品
干热
带螺口盖的玻璃品 高压灭菌，将盖悬 松
玻璃移液管
干热
枪头
高压灭菌
离心管(5ml，15ml， 高压灭菌，直立放
50ml)
置
EP管(1.5ml，2ml， 高压灭菌 5ml，10ml)
试管
干热
艾本德移液器（新） 高压灭菌，整支
高压灭菌 琼脂 蛋白胨 EDTA 甘油 HEPES 甲基纤维素 酚红 盐溶液 水
中湿热灭菌121℃，20min（高速离心管尤其注意灭菌时要 直立放置）； • 自然冷却后置于烘箱中烘干。
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水的制备和灭菌
• 细胞培养需要用超纯水（UPW）； • 第一：反向渗透或蒸馏；第二：碳过滤去除有机或无机胶
体（总有机碳TOC ≤10ug/L）；第三：去离子（电阻 ≥10MΩ/cm）； • 高压灭菌121℃，20min，自然冷却。
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细胞培养实验室
隔间
走廊
二更
一间
二间
三间
一更
准备室
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细胞培养设备
• 基本设备：
• 细胞培养通风橱 (即：层 流通风橱或生物安全柜)
• 培养箱 (推荐使用湿式二 氧化碳培养箱)
• 水浴锅
• 离心机
• 冰箱和冰柜 (–20°C) • 细胞计数器 (例如：
Countess® 自动细胞计数 器或血球计数器) • 倒置显微镜
细胞培养基本知识
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细胞培养基本概念
• 细胞培养：从动物或植物中取出细胞，使其在合适的人工环境中生长。
• 细胞来源：细胞可直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离， 也可来自已经建立的细胞系或细胞株。
• 原代培养：是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖， 直到占据所有可用基质(即：汇合) 的培养阶段。
果）、经济、规模和机械化；
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细胞培养的应用
• 细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术，可为细胞正常生 理和生化 (例如：代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的 作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可用于 药物筛选和开发以及生物化合物 (例如：疫苗、治疗性蛋白) 的大规模 生产。
• 传代培养：在细胞生长至汇合，必须将细胞转移到新的容器中并更换 新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。
• 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。
• 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中 明确地选择出来，就成为一个细胞株。
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细胞培养基本概念
• 有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后 就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这 种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞 系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生， 也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力 后，就成为连续细胞系。
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• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
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准备与灭菌
过滤 氨基酸 抗生素 牛血清白蛋白 胶原酶 药物 谷氨酸盐 生长因子 HCL NaHCO3 NaOH 血清 丙酮酸钠
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胰蛋白酶
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玻璃器皿、金属器皿的清洗和灭菌
• 将玻璃和金属器皿放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂 （Decon）的洗液中，侵泡过夜或至少2h（铝、铜制品不得浸 泡）;
• 试管刷清洗，自来水冲洗4次，去离子水冲洗3次； • 倒置于烘箱中烘干； • 铝箔封口保存； • 使用前24~48h，放入干热灭菌箱中，160℃灭菌1h，自然冷
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PBS的制备
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水； • 放在磁力搅拌器上，设定转速200r/min； • 打开PBS干粉（1L装）加入烧杯中； • 搅拌至完全溶解； • PH计检测PH为7.4，变化＜0.1； • 分装至灭菌的储液瓶中，盖子只轻旋一圈，放入灭菌锅中湿热灭菌； • 自然冷却后盖紧，4℃或室温保存。