08核移植技术与动物克隆全解
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生物：2.2.1《动物细胞培养和核移植技术》教案(2)(新人教版选修3)
2、动物细胞培养的应用和概念：
动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.
动物细胞的培养过程
见书：
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
•思考讨论：在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？
答：胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。
比较项目
植物组织培养
动物细胞培养
原理
细胞的全能性
细胞增殖
培养基性质
固体培养基
液体培养基
培养基特有成分
蔗糖植物激素
葡萄糖动物血清
培养结果
植物体
细胞株、细胞系
培养目的
快速繁殖、培育无病毒植株
获得细胞或细胞分泌蛋白
二、动物体细胞核移植技术和克隆动物
核移植技术
1.克隆羊培育过程
胚胎移植技术
2.体细胞核移植技术的应用前景
3.体细胞核移植技术存在的问题
课后笔记：有了第一节的基础，学生对本节内容易于理解，因此，在教学中我采用讲授、自学、讨论等相结合的教学方法。
学生在比较中学习知识，加深对知识的理解
学习这部分内容
可先让学生列举所知道的克隆动物
课堂巩固
学案与测评的反馈练习
作业
学案与测评练习
板书设计：动物细胞培养和核移植技术
一、动物细胞培养
1.发展历史:
2、动物细胞培养的应用和概念：
3.动物细胞培养的条件:
4.动物细胞培养技术的应用:
5．植物组织培养和动物细胞培养的比较
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.
动物细胞的培养过程
见书：
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
•思考讨论：在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？
答：胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。
比较项目
植物组织培养
动物细胞培养
原理
细胞的全能性
细胞增殖
培养基性质
固体培养基
液体培养基
培养基特有成分
蔗糖植物激素
葡萄糖动物血清
培养结果
植物体
细胞株、细胞系
培养目的
快速繁殖、培育无病毒植株
获得细胞或细胞分泌蛋白
二、动物体细胞核移植技术和克隆动物
核移植技术
1.克隆羊培育过程
胚胎移植技术
2.体细胞核移植技术的应用前景
3.体细胞核移植技术存在的问题
课后笔记：有了第一节的基础，学生对本节内容易于理解，因此，在教学中我采用讲授、自学、讨论等相结合的教学方法。
学生在比较中学习知识，加深对知识的理解
学习这部分内容
可先让学生列举所知道的克隆动物
课堂巩固
学案与测评的反馈练习
作业
学案与测评练习
板书设计：动物细胞培养和核移植技术
一、动物细胞培养
1.发展历史:
2、动物细胞培养的应用和概念：
3.动物细胞培养的条件:
4.动物细胞培养技术的应用:
5．植物组织培养和动物细胞培养的比较
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
动物克隆的基本原理及过程
动物克隆的基本原理及过程《动物克隆的基本原理及过程》动物克隆是指通过人工手段复制原始个体的生殖过程。
这项技术的发展引起了广泛的关注和讨论，同时也引发了一系列伦理和道德问题。
本文将介绍动物克隆的基本原理及过程，以帮助读者更好地理解这一领域的发展和挑战。
动物克隆的基本原理是利用体细胞核移植技术，将一个成熟核移植到一个去核的卵细胞中，然后通过合适的刺激使其发育成一个完整的新个体。
在这个过程中，克隆个体将完全或部分地拥有捐赠体细胞的遗传信息。
动物克隆的过程可以分为以下几个关键步骤：1. 获取捐赠体细胞：捐赠体细胞可以来自成年个体的体细胞，比如皮肤细胞或肌肉细胞。
这些细胞将成为克隆个体的遗传来源。
2. 准备去核卵细胞：通过一系列的实验操作，去除卵细胞中的细胞核，以确保克隆个体将只携带捐赠体细胞的遗传信息。
3. 核移植：将捐赠体细胞的细胞核注射到去核卵细胞中。
4. 诱导发育：经过核移植后，为了启动克隆个体的发育，科学家通常需要提供一些刺激，比如电脉冲或化学物质。
这些刺激可以激活细胞的发育能力，使其开始分裂和发育。
5. 移植和孵化：克隆胚胎可以被移植到一只母兽体内，或在试管中孵化出来。
无论哪种方法，都需要为克隆个体提供适当的环境和条件，使其正常生长和发育。
需要注意的是，动物克隆是一项复杂和技术密集型的过程，目前仍然面临许多挑战和限制。
成功率仍然相对较低，伦理和道德问题也一直备受关注。
然而，动物克隆也有着广阔的应用前景。
它可以用于保护濒临灭绝的物种、提高家畜和农作物品质、以及研究人类和动物发育等基础科学问题。
随着技术的不断发展和完善，我们相信动物克隆将在未来发挥更大的作用。
总之，动物克隆是一项具有巨大潜力和困难的技术。
通过核移植和发育诱导等关键步骤，科学家可以实现原始个体的复制和繁殖。
尽管仍面临许多挑战，但动物克隆在生物学和应用领域的潜力仍然令人兴奋。
动物体细胞核移植技术和克隆动物课件-高二生物人教版选择性必修3
①研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程； ②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病 基因； ③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应 的药物提供帮助。
该技术有望增加濒危物种的存活数量
体细胞核移植存在问题
（1）成功率低： 克隆胚胎移植成功率平均不到10% （2）理论研究较为滞后：需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传
C 了克隆鼠，培育过程如图所示。下列叙述错误的是( )
A.细胞A为培育到MⅡ期的卵母细胞 B.克隆鼠的遗传物质主要来自鼠成纤维细胞 C.利用胚胎干细胞作为核供体更难培育克隆鼠 D.在培养瓶中培养成纤维细胞时会出现细胞贴壁和接触抑制现象
D 5.核移植中常用卵母细胞作为受体细胞的原因不包括( )
A.卵母细胞体积大，易操作 B.细胞质较多，营养物质丰富 C.含有促进全能性表达的物质 D.细胞核中遗传物质少
CC.早期胚胎细胞作为细胞核的供体细胞妊娠成功率最高
D.培养动物细胞的培养液中含维生素、激素等多种能源物质
12.(2022·福建福州高二阶段练习)某研究人员欲利用核移植技术来治疗糖
D 尿病，提出了如图所示的方案。下列相关叙述错误的是( )
A.动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植 B.图中所用的①一般选择传代培养10代以内的细胞 C.图中所用的去核卵母细胞一般处于减数分裂Ⅱ中期 D.图中“定向诱导”的目的是使重组细胞B发生基因突变
A 14.如图为某哺乳动物的生殖过程图，下列叙述正确的是( )
A.个体2为克隆动物，c可以为高度分化的体细胞 B.个体2的遗传性状与提供b细胞的母本完全不同 C.产生个体1的生殖方式为无性生殖 D.e细胞为MⅠ中期的卵母细胞
核移植技术与动物克隆 .ppt
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二、两栖类细胞核移植
• 1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植 到去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。
• 1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首 次获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代．
其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产 生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能 重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。
供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外， 核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。
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3．细胞核移植
常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注 射。胞质内注射是用一个外径5～8μm 的注核针吸取供体核 后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供 体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后 用电刺激进行细胞融合。
核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技
术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两 个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造 无性杂交生物新品种的一项技术。
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胚 胎 克 隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段 的胚胎，叫做胚胎克隆。
体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体，叫做 体细胞克隆。
经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养， 观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养 方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入 休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和 囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内 培养7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培 养，发育至桑椹胚或囊胚。
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二、两栖类细胞核移植
• 1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植 到去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。
• 1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首 次获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代．
其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产 生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能 重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。
供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外， 核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。
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3．细胞核移植
常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注 射。胞质内注射是用一个外径5～8μm 的注核针吸取供体核 后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供 体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后 用电刺激进行细胞融合。
核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技
术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两 个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造 无性杂交生物新品种的一项技术。
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胚 胎 克 隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段 的胚胎，叫做胚胎克隆。
体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体，叫做 体细胞克隆。
经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养， 观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养 方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入 休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和 囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内 培养7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培 养，发育至桑椹胚或囊胚。
动物细胞工程动物细胞培养和核移植技术
核移植操作
显微操作
在显微镜下，将供体细胞核移植到受体细胞中。
融合与激活
通过电刺激或化学方法诱导受体细胞与供体细胞 融合，并激活新形成的细胞。
筛选与鉴定
对新形成的细胞进行筛选和鉴定，确保核移植成 功。
重组胚胎的培养与移植
胚胎培养 在适宜的培养条件下，对重组胚胎进行培养，促进其发育。
胚胎移植 将培养成熟的胚胎移植到代孕动物体内，以产生后代。
融合后的细胞开始分裂和发育，最终 形成与供体具有相同遗传物质的克隆 个体。
核移植技术流程
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供体细胞的选择与准备
选择适当的供体细胞
01
根据实验需求选择具有所需特性的供体细胞，如特定组织或器
官来源的细胞。
细胞培养准备
02
确保供体细胞处于适宜的培养环境中，包括适当的培养基、温
度、气体条件等。
细胞传代与扩增
03
对供体细胞进行传代和扩增，以获得足够的细胞数量用于核移
植。
受体细胞的选择与准备
选择适当的受体细胞
根据实验需求选择具有良好接受性的受体细胞，如去核的卵母细 胞。
去核处理
使用显微操作技术去除受体细胞的细胞核，为核移植做好准备。
受体细胞激活
通过化学或电刺激方法激活受体细胞，使其恢复分裂活性。
细胞分离
通过离心、过滤等方法将细胞从酶液
3
中分离出来。
培养环境控制
提供适宜的温度、湿度、气体环境，
5
保持培养基的营养成分和pH值。
组织消化
2
使用适当的酶液将组织分解成单个细
胞。
细胞接种
4
将分离出的细胞接种到培养容器中。
传代细胞培养
动物细胞工程—细胞核移植与克隆
重组胚胎构建
应用
畜牧业 医疗健康
胚胎移植
克隆动物
细胞核移植与克隆
课后思考 用体细胞核移植方法生产的克隆动物，是否对体细胞供体动物进行了 100%的复制？为什么？
原理
动物细胞核具有全能性
胚胎细胞核移植
细胞分化程度低， 恢复全能性容易
分类
体细胞核移植
细胞分化程度高， 恢复全能性不容 易
细胞核移植与克隆
核移植技术的流程
细胞核移植与克隆
母绵羊A
母绵羊B
取供体细胞 传代培养 10代以内
的细胞
融合方法： 电刺激
乳腺细胞 （体细胞）
核移植
提取细 胞核
新的卵细胞发 育成早期胚胎
动物生物技术
细胞核移植与克隆
第一章
细胞核移植与克隆
细胞核移植与克隆
你 知 道 小 羊 “ 多 莉 ” 吗 ？
细胞核移植与克隆
动物细胞核移植技术
动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去 掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎,这个 新的胚胎最终发育为动物个体。
细胞核移植与克隆
胚胎 移植
母绵羊 C
“多莉”
未受精的卵 细胞
去核卵细 胞
MⅡ期卵 母细胞
细胞核移植与克隆
体细胞核移植技术的应用
加速家畜遗传改良 保护濒危物种 生产医用蛋白质 组织器官的移植 认识胚胎发育和衰老过程 研究疾病的发展历程
细胞核移植与克隆
课堂小结
概念
胚胎细胞核移植
核分类 体细胞核移植来自移 植细胞核采集
过程 去核卵母细胞
动物克隆的技术和原理
动物克隆的技术和原理
动物克隆是指利用细胞核移植技术，从已存在的成年动物体细胞中提取核，通过人工手段将其注入另一动物体的卵细胞内，再用电脉冲作用或化学药物促进卵细胞发育和分裂，最终得到一个与原始动物完全相同的新生体。
动物克隆的原理主要分为三个步骤：
1、提取供体细胞：从原始动物身体中提取一种可培养、生长稳定、有遗传稳定性的成体细胞。
2、细胞核移植：将供体细胞核移植到去核卵细胞内，去核卵细胞可能经过化学或物理处理来保证卵质的完整性，并且具有激活卵细胞的能力。
3、体外培养：将去核卵细胞和供体细胞体外处理，创造一个适合供体细胞所需要的环境，用适当的培养液延长供体细胞和卵细胞的存活寿命。
需要注意的是，动物克隆技术的成功率通常较低，并且会出现许多问题，例如产生遗传缺陷和问题，导致动物寿命变短或生殖亦受到不可修复的损伤。
细胞核移植与动物克隆
C母绵羊子宫 分娩 妊娠 多莉羊
克隆羊——多利
体细胞克隆羊的培育成功，证明了： 高度分化细胞经一定技术处理，也可回复 到类似受精卵时期的功能。 在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细 胞核（包括异源的细胞核）发育的作用。
克隆羊“多莉”的意义和引起的发响
• 在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公 布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植 技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核 移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不 能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体 细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。 这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样， 分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核 中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体 细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞 可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可 对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规 模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。
克隆技术的方法
• （一）、胚胎分割 采用硬质玻璃细管，在拉针仪上拉成玻 璃细丝，成为胚胎分割刀和在磨针机上加工 成适合某种动物的胚胎固定吸管，装在显微 操作器的机械手上，即可施行分割或分散胚 胎。将分好的半胚或胚胎分裂球装进透明带， 再经双层琼脂包埋，在CO2培养箱内（37℃) 培养。在培养中，能发育者移植到受体体内， 着床妊娠及产仔。
世界10年克隆研究之路
• 1996年 第一只成年体细胞克隆羊“多利” 诞生 • 1997年 一头用胎盘克隆而成的荷兰牛亮相。 • 1998年 两头由母牛细胞克隆而成的小牛在东京出生。 一个国际研究小组宣布克隆出了三代实验鼠 2000年 曾参与克隆“多利” 羊的英国公司培育了第一 批克隆猪 2001年 一头稀有品种的克隆亚洲牛诞生，两天后死亡。 2002年 法国研究人员克隆出兔子 2003年 美国科学家推出了一匹克隆骡 爱荷华州的研究人员称他们克隆出了一头濒临灭绝的 爪哇野牛 2004年 美国加利福尼亚的一家公司培育出了第一只克隆猫。 这只猫后来成为第一只被卖出的克隆宠物。 2005年 韩国科学家宣布他们培育出了首条克隆狗叫“斯纳皮”
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卵和体外成熟培养获得
4.去核的方法
1.盲吸法 2.半卵法 3.荧光引导核法 4.微分干涉显微镜去核法 5.功能性去核法 6.离心去核法 7.末期去核法
盲吸去核法一般将脱去颗粒细胞的卵母细胞用 含7.5ug/ml CB的培养液中清洗3-4遍后移入100ul左 右的上述溶液的液滴中，同时将供体细胞加入液滴 中。石蜡油覆盖后于显微操作仪上用固定针吸住卵 母细胞，用去核针拨动之，使第一极体位于1点位置； 去核针从3点处进针，针尖斜面部分刺入卵泡内，吸 出第一极体及其下方的1/4-1/3胞质（包括细胞核）； 然后从操作液中吸取形态圆，边缘略粗糙的核供体 细胞，从原针吸口处注入透明带下并轻压透明带。
MII
期 卵 母 细 胞
去 核过程
5.装核
将准备好的体细胞放入去核卵母细胞的过程。
将体细胞放入带下
A
B
C
D
E
F
A 显微注射针刺入卵母细胞前 B开始吸取第一极体 C 极体已被吸入注射针 D 去除极体 后的卵母细胞 E 注射供体细胞 F 供体细胞已被注入透明带下
直接注射法
6.细胞融合
细胞融合的方法有： 病毒介导融合 化学融合 电融合
提供细胞核的细胞称为----核供体（donor）
接受细胞核的细胞称为----核受体（recipient）
核供体：胚胎细胞、胎儿细胞、体细胞 （somatic cell） 核受体：早期胚胎细胞、受精卵、MII期卵 母细胞
减数分裂分裂期： 减数分裂期Ⅰ：前期Ⅰ、前中期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末
期Ⅰ和胞质分裂期Ⅰ等6个阶段。 减数分裂期Ⅱ：前期Ⅱ、前中期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ、末
• 1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科 学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、 羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究 结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多
• 种动物的成熟细胞核相结合。 1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物 盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大
• 熊猫的早期胚胎， 在异种克隆研究领域，目前国际上仅有印度野 牛和欧洲盘羊取得成功。到目前为止应用异种 核移植技术获得的活体后代都来自于亚种间核
•移植。 中国首例异体克隆动物———濒危动物北山羊 在新疆乌鲁木齐县六十户乡降生
获得克隆动物的方法
1.胚胎分割 2.孤雌生殖 3.细胞核移植
1.胚胎分割
胚胎分割（embryo splitting）是指采用 机械方法用特制的纤维刀片或玻璃微针将早 期胚胎分割成2等分、4等分或多等分，再移 植给受体母畜，从而获得同卵多仔的一项胚 胎工程技术。
期Ⅱ和胞质分裂期Ⅱ等6个阶段。
前期Ⅰ ： 细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期5个阶段。
核移植的机理
•供体细胞的细胞核移入卵母细胞后，
在卵母细胞相关因子的作用下，发生 了重编程回复到发育的起点状态。
•核重编程的过程就是使在体细胞中被
关闭,而在正常胚胎发育中表达的基因 重新被激活的过程.
重编程有三种可能的结果
（1）供核基因组完全没有进行重编程 重构胚很快死亡；
（2）部分重编程,重构胚在不同的发育 阶段死亡 ；
（3）完全重编程,产生正常的克隆动物。
细胞核移植分类
根据核供体细胞来源的不同 1.胚胎细胞核移植 2.胎儿细胞核移植 3.体细胞核移植（SCNT）
根据供体细胞与受体细胞是否来源于同一种动 物又可将其分为
克隆在分子、细胞、个体三个水平上
动物克隆
动物克隆是指通过无性繁殖的手段，从一 个动物细胞获得遗传背景相同的个体群的 过程。
获 得 的 个 体 群 称 为 克 隆 动 物 （ cloned animal）
动物克隆的研究历史
1、最初用胚胎分割的方法获得克隆动物。 2、同卵双生或孤雌生殖的方式获得克隆动物。 3、通过核移植获得克隆动物，但开始仅限于胚 胎细胞和胎儿细胞的克隆。 4、1997年，克隆羊多莉的诞生，标志着体细胞 克隆的成功。 5、现有多种体细胞克隆动物诞生，如牛、猪、 老鼠、猫、羊、兔、猫、狗等。
第八章 克隆动物
克隆羊多利（Dolly）的诞生
1997年2月，英国Roslin研究所宣布克隆羊多利 （Dolly）的诞生揭示一个全新概念：由成年机 体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同 的新生命个体。
是克隆技术的里程碑。
克隆一词变得家喻户晓
克隆来源于英语“clone”或“cloning”的音 译，起源于希腊文“Klone”，原意是用“插 条”繁殖。曾译为无性生殖或无性繁殖.
蜥蜴
蚜虫
问题
在哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分化， 但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新恢复 到发育的起始状态，再重新发育成其它类型细胞 组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能性呢？ 细胞的分化是不是发生了不可逆的变化？
HANS SPEMANN
1935 Nobel Laureate in Medicine for his discovery of the ot.
胚胎分割—— 一卵双生
胚胎分割—— 一卵双生
2.孤雌生殖
孤雌生殖（parthenogenesis）:指卵子不经 受精，直接发育为个体的繁殖方式。
如：蚜虫、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类
（一）偶发性孤雌生殖 (sporadic parthenogenesis)：偶发性孤 雌生殖是指某些昆虫在正常情况下行两性生殖，但雌成虫偶尔产 出的未受精卵也能发育成新个体的现象。常见的如家蚕、一些毒 蛾和枯叶蛾等。
1.同种核移植 2.异种核移植
显微操作仪（micromanipulator）
胚胎细胞核移植
胚胎细胞核移植 (embryo cell unclear transplantation)是指，将一个早期胚胎 的细胞核移植到去核的卵母细胞中，构建 新合子的生物技术。
胚胎细胞核移植流程图
历史回顾
1938年Spemann提出设想：分化了的细胞核 移植能否指导胚胎发育？
1.核供体细胞的准备
常用的体细胞有：
•卵丘细胞 •颗粒细胞 •皮肤成纤维细胞
细胞在体外一般在体外传代8-16次
A 组织块培养的人皮肤成纤维细胞 B 消化培养的人皮肤成纤维细胞
2.细胞周期的调控
1.血清饥饿法 2.Aphidicolin（阿菲迪霉素）法 3.激活卵母细胞法
3.受体细胞准备
目前为止，有三类用于核移植产生了后代 第一类是去除原核的受精卵 第二类是早期胚胎； 第三类即是MⅡ期的卵母细胞。 常用的是MⅡ期的卵母细胞，一般通过超数排
1869-1941 Residence: Germany Affiliation: University of Freiburg im Breisgau
德国胚胎学家Spemann提出通过核移植可以验证不同发育阶段 和不同分化程度的细胞核是否具有全能性。
3.细胞核移植
细胞核移植（nuclear transfer）是指将早 期胚胎细胞、胎儿细胞或成体动物的细胞核 移植到去核的卵母细胞中，重新组成重构胚 （reconstructed embryo）或克隆胚 （cloned embryo）并使之发育成成体动 物的过程。
7. 桑椹胚
滋养层
胚泡腔
8. 囊胚
体细胞核移植技术
-------动物克隆技术的里程碑
体细胞核移植
体细胞核移植技术(somatic cell unclear transplantation)是指，将分化程度较高的 体细胞移植入去核的卵母细胞中构建新合子 的生物技术。
历史回顾
1996年，世界第一例从成年动物细胞克隆出 的哺乳动物绵羊多莉诞生。这个秘密直到 1997年2月才向世人公布。
利用电穿孔的原理来使细胞融合。为使供 /受体细胞的接触面与电场方向垂直,更有利 于融合,可在待融的供/受体复合物移入两微 电极丝所组成的融合小槽内后用一次交流 脉冲或手工排步的方式来达到这一目的。
卵母细胞与体细胞电融合过程
7.重构卵激活
正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后,卵母细胞 质中会出现一系列的反应,如游离Ca2+ 浓度增高、 母源性的mRNA启动转录、MPF等因子活性下降 等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过 这些变化,胚胎就不能正常发育。 核移植过程中的 激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。
2、有的昆虫在自然情况下，雄虫极少，甚至尚未发现雄虫， 几乎或完全行孤雌生殖，如一些竹节虫、粉虱、蚧、蓟马等。
（三）周期性孤雌生殖 (cyclical parthenogenesis)：周期性孤雌生殖也称循环性孤雌 生殖。昆虫通常在进行1次或多次孤雌生殖后，再进 行1次两性生殖。这种以两性生殖与孤雌生殖交替的 方式繁殖后代的现象，又称为异态交替(heterogeny) 或世代交替(alternation of generations)。如棉蚜 从春季到秋末，行孤雌生殖10一20余代，到秋末冬初 则出现雌、雄两性个体，并交配产卵越冬。
（二）经常性孤雌生殖 (constant parthenogenesis)：经常性孤 雌生殖也称永久性孤雌生殖。这种生殖方式在某些昆虫中经常出 现，而被视为正常的生殖现象。可分为两种情况 ：
1、在膜翅目的蜜蜂和小蜂总科的-些种类中，雌成虫产下的卵 有受精卵和未受精卵两种，前者发育成雌虫，后者发育成雄虫。
此后，胚胎细胞的核移植在多种动物上获得了克 隆后代，如绵羊(Willadsen等,1986),牛 (Prather等,1987),兔(Stice等,1988),猪 (Prather等,1989),山羊(张勇等,1991)等。
直到1997年才由 Meng et al成功地克隆出两只 猴,这是灵长类动物的首次被克隆。
1952年Briggs和King在两栖动物证实了 Spemann提出的设想：利用已分化的蛙囊胚 细胞核移植到去核的蛙卵母细胞中，得到了重 新发育的结果，从而证明了不同时期的胚胎细 胞核在相同的卵质中具有重新发育的能力，在 特定条件下，可以恢复其发育的全能性。
4.去核的方法
1.盲吸法 2.半卵法 3.荧光引导核法 4.微分干涉显微镜去核法 5.功能性去核法 6.离心去核法 7.末期去核法
盲吸去核法一般将脱去颗粒细胞的卵母细胞用 含7.5ug/ml CB的培养液中清洗3-4遍后移入100ul左 右的上述溶液的液滴中，同时将供体细胞加入液滴 中。石蜡油覆盖后于显微操作仪上用固定针吸住卵 母细胞，用去核针拨动之，使第一极体位于1点位置； 去核针从3点处进针，针尖斜面部分刺入卵泡内，吸 出第一极体及其下方的1/4-1/3胞质（包括细胞核）； 然后从操作液中吸取形态圆，边缘略粗糙的核供体 细胞，从原针吸口处注入透明带下并轻压透明带。
MII
期 卵 母 细 胞
去 核过程
5.装核
将准备好的体细胞放入去核卵母细胞的过程。
将体细胞放入带下
A
B
C
D
E
F
A 显微注射针刺入卵母细胞前 B开始吸取第一极体 C 极体已被吸入注射针 D 去除极体 后的卵母细胞 E 注射供体细胞 F 供体细胞已被注入透明带下
直接注射法
6.细胞融合
细胞融合的方法有： 病毒介导融合 化学融合 电融合
提供细胞核的细胞称为----核供体（donor）
接受细胞核的细胞称为----核受体（recipient）
核供体：胚胎细胞、胎儿细胞、体细胞 （somatic cell） 核受体：早期胚胎细胞、受精卵、MII期卵 母细胞
减数分裂分裂期： 减数分裂期Ⅰ：前期Ⅰ、前中期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末
期Ⅰ和胞质分裂期Ⅰ等6个阶段。 减数分裂期Ⅱ：前期Ⅱ、前中期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ、末
• 1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科 学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、 羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究 结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多
• 种动物的成熟细胞核相结合。 1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物 盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大
• 熊猫的早期胚胎， 在异种克隆研究领域，目前国际上仅有印度野 牛和欧洲盘羊取得成功。到目前为止应用异种 核移植技术获得的活体后代都来自于亚种间核
•移植。 中国首例异体克隆动物———濒危动物北山羊 在新疆乌鲁木齐县六十户乡降生
获得克隆动物的方法
1.胚胎分割 2.孤雌生殖 3.细胞核移植
1.胚胎分割
胚胎分割（embryo splitting）是指采用 机械方法用特制的纤维刀片或玻璃微针将早 期胚胎分割成2等分、4等分或多等分，再移 植给受体母畜，从而获得同卵多仔的一项胚 胎工程技术。
期Ⅱ和胞质分裂期Ⅱ等6个阶段。
前期Ⅰ ： 细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期5个阶段。
核移植的机理
•供体细胞的细胞核移入卵母细胞后，
在卵母细胞相关因子的作用下，发生 了重编程回复到发育的起点状态。
•核重编程的过程就是使在体细胞中被
关闭,而在正常胚胎发育中表达的基因 重新被激活的过程.
重编程有三种可能的结果
（1）供核基因组完全没有进行重编程 重构胚很快死亡；
（2）部分重编程,重构胚在不同的发育 阶段死亡 ；
（3）完全重编程,产生正常的克隆动物。
细胞核移植分类
根据核供体细胞来源的不同 1.胚胎细胞核移植 2.胎儿细胞核移植 3.体细胞核移植（SCNT）
根据供体细胞与受体细胞是否来源于同一种动 物又可将其分为
克隆在分子、细胞、个体三个水平上
动物克隆
动物克隆是指通过无性繁殖的手段，从一 个动物细胞获得遗传背景相同的个体群的 过程。
获 得 的 个 体 群 称 为 克 隆 动 物 （ cloned animal）
动物克隆的研究历史
1、最初用胚胎分割的方法获得克隆动物。 2、同卵双生或孤雌生殖的方式获得克隆动物。 3、通过核移植获得克隆动物，但开始仅限于胚 胎细胞和胎儿细胞的克隆。 4、1997年，克隆羊多莉的诞生，标志着体细胞 克隆的成功。 5、现有多种体细胞克隆动物诞生，如牛、猪、 老鼠、猫、羊、兔、猫、狗等。
第八章 克隆动物
克隆羊多利（Dolly）的诞生
1997年2月，英国Roslin研究所宣布克隆羊多利 （Dolly）的诞生揭示一个全新概念：由成年机 体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同 的新生命个体。
是克隆技术的里程碑。
克隆一词变得家喻户晓
克隆来源于英语“clone”或“cloning”的音 译，起源于希腊文“Klone”，原意是用“插 条”繁殖。曾译为无性生殖或无性繁殖.
蜥蜴
蚜虫
问题
在哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分化， 但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新恢复 到发育的起始状态，再重新发育成其它类型细胞 组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能性呢？ 细胞的分化是不是发生了不可逆的变化？
HANS SPEMANN
1935 Nobel Laureate in Medicine for his discovery of the ot.
胚胎分割—— 一卵双生
胚胎分割—— 一卵双生
2.孤雌生殖
孤雌生殖（parthenogenesis）:指卵子不经 受精，直接发育为个体的繁殖方式。
如：蚜虫、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类
（一）偶发性孤雌生殖 (sporadic parthenogenesis)：偶发性孤 雌生殖是指某些昆虫在正常情况下行两性生殖，但雌成虫偶尔产 出的未受精卵也能发育成新个体的现象。常见的如家蚕、一些毒 蛾和枯叶蛾等。
1.同种核移植 2.异种核移植
显微操作仪（micromanipulator）
胚胎细胞核移植
胚胎细胞核移植 (embryo cell unclear transplantation)是指，将一个早期胚胎 的细胞核移植到去核的卵母细胞中，构建 新合子的生物技术。
胚胎细胞核移植流程图
历史回顾
1938年Spemann提出设想：分化了的细胞核 移植能否指导胚胎发育？
1.核供体细胞的准备
常用的体细胞有：
•卵丘细胞 •颗粒细胞 •皮肤成纤维细胞
细胞在体外一般在体外传代8-16次
A 组织块培养的人皮肤成纤维细胞 B 消化培养的人皮肤成纤维细胞
2.细胞周期的调控
1.血清饥饿法 2.Aphidicolin（阿菲迪霉素）法 3.激活卵母细胞法
3.受体细胞准备
目前为止，有三类用于核移植产生了后代 第一类是去除原核的受精卵 第二类是早期胚胎； 第三类即是MⅡ期的卵母细胞。 常用的是MⅡ期的卵母细胞，一般通过超数排
1869-1941 Residence: Germany Affiliation: University of Freiburg im Breisgau
德国胚胎学家Spemann提出通过核移植可以验证不同发育阶段 和不同分化程度的细胞核是否具有全能性。
3.细胞核移植
细胞核移植（nuclear transfer）是指将早 期胚胎细胞、胎儿细胞或成体动物的细胞核 移植到去核的卵母细胞中，重新组成重构胚 （reconstructed embryo）或克隆胚 （cloned embryo）并使之发育成成体动 物的过程。
7. 桑椹胚
滋养层
胚泡腔
8. 囊胚
体细胞核移植技术
-------动物克隆技术的里程碑
体细胞核移植
体细胞核移植技术(somatic cell unclear transplantation)是指，将分化程度较高的 体细胞移植入去核的卵母细胞中构建新合子 的生物技术。
历史回顾
1996年，世界第一例从成年动物细胞克隆出 的哺乳动物绵羊多莉诞生。这个秘密直到 1997年2月才向世人公布。
利用电穿孔的原理来使细胞融合。为使供 /受体细胞的接触面与电场方向垂直,更有利 于融合,可在待融的供/受体复合物移入两微 电极丝所组成的融合小槽内后用一次交流 脉冲或手工排步的方式来达到这一目的。
卵母细胞与体细胞电融合过程
7.重构卵激活
正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后,卵母细胞 质中会出现一系列的反应,如游离Ca2+ 浓度增高、 母源性的mRNA启动转录、MPF等因子活性下降 等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过 这些变化,胚胎就不能正常发育。 核移植过程中的 激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。
2、有的昆虫在自然情况下，雄虫极少，甚至尚未发现雄虫， 几乎或完全行孤雌生殖，如一些竹节虫、粉虱、蚧、蓟马等。
（三）周期性孤雌生殖 (cyclical parthenogenesis)：周期性孤雌生殖也称循环性孤雌 生殖。昆虫通常在进行1次或多次孤雌生殖后，再进 行1次两性生殖。这种以两性生殖与孤雌生殖交替的 方式繁殖后代的现象，又称为异态交替(heterogeny) 或世代交替(alternation of generations)。如棉蚜 从春季到秋末，行孤雌生殖10一20余代，到秋末冬初 则出现雌、雄两性个体，并交配产卵越冬。
（二）经常性孤雌生殖 (constant parthenogenesis)：经常性孤 雌生殖也称永久性孤雌生殖。这种生殖方式在某些昆虫中经常出 现，而被视为正常的生殖现象。可分为两种情况 ：
1、在膜翅目的蜜蜂和小蜂总科的-些种类中，雌成虫产下的卵 有受精卵和未受精卵两种，前者发育成雌虫，后者发育成雄虫。
此后，胚胎细胞的核移植在多种动物上获得了克 隆后代，如绵羊(Willadsen等,1986),牛 (Prather等,1987),兔(Stice等,1988),猪 (Prather等,1989),山羊(张勇等,1991)等。
直到1997年才由 Meng et al成功地克隆出两只 猴,这是灵长类动物的首次被克隆。
1952年Briggs和King在两栖动物证实了 Spemann提出的设想：利用已分化的蛙囊胚 细胞核移植到去核的蛙卵母细胞中，得到了重 新发育的结果，从而证明了不同时期的胚胎细 胞核在相同的卵质中具有重新发育的能力，在 特定条件下，可以恢复其发育的全能性。