分光光度法原理
分光光度法
分光光度法
与不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。
但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。
波长范围(1)200～400nm的紫外光区，(2)400～760nm的可见光区，(3)2.5～25μm(按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>)的红外光区。
、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。
为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。
基本原理当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸
收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为:。
选最大吸收波长进行分光光度法的原因
选取最大吸收波长进行分光光度法的原因一、概述分光光度法是一种常用的分析化学方法，通过测量物质在特定波长光线下的吸光度来确定物质的浓度或者其他相关性质。
在进行分光光度法测定时，选择合适的吸收波长对于获得准确的测定结果至关重要。
本文将介绍选取最大吸收波长进行分光光度法的原因。
二、分光光度法的基本原理1.分光光度法的基本原理分光光度法是利用物质对于特定波长的光线的吸收来进行定量或者定性测定的方法。
当一束光通过包含待测物质的溶液时，物质会吸收与其特性相对应的波长的光线，从而使通过溶液的光线强度发生变化。
通过测量入射光和透射光之间的差异，可以计算出物质的吸光度，并通过吸光度和浓度的关系，确定物质的浓度。
2.最大吸收波长的选择最大吸收波长是指在特定波长范围内，物质对光的吸收达到最大值的波长。
分光光度法中，选择最大吸收波长进行测定可以提高测定的准确性和灵敏度。
选择最大吸收波长是进行分光光度法测定时需要考虑的重要因素。
三、选取最大吸收波长进行分光光度法的原因1.提高测定的准确性选择最大吸收波长进行分光光度法测定可以提高测定的准确性。
在最大吸收波长处，物质对光的吸收达到最大值，这意味着此时光线与物质的相互作用最强烈。
在最大吸收波长处测定能够获得最明显的吸光信号，减小测定误差，提高测定的准确性。
2.提高测定的灵敏度选择最大吸收波长进行分光光度法测定可以提高测定的灵敏度。
在最大吸收波长处，物质对光的吸收达到最大值，这意味着即使待测物质浓度较低，也能够获得明显的吸光信号。
在最大吸收波长处测定能够提高测定的灵敏度，使测定结果更加可靠。
3.克服干扰选择最大吸收波长进行测定可以克服干扰。
在最大吸收波长处，物质对光的吸收最强，而其他物质可能对同一波长的光没有吸收，或者吸收较小。
在最大吸收波长处进行测定可以有效地克服干扰，获得准确的测定结果。
4.简化实验过程选择最大吸收波长进行分光光度法测定可以简化实验过程。
在最大吸收波长处进行测定可以消除其他波长光线的干扰，简化了实验所需的步骤和条件，提高了实验的操作性和稳定性。
简述紫外可见分光光度法的基本原理。
简述紫外可见分光光度法的基本原理。
紫外可见分光光度法是一种常用的分析方法，通过测量物质在紫外可见光区的吸光度来分析物质的浓度。
其基本原理如下：
1. 光源：使用特定波长范围的光源，通常是紫外光或可见光。
光源产生的光经过一系列光学元件聚焦后，成为一个具有特定波长范围的光束。
2. 分光器：分光器将光束分离成不同波长的光束。
分光器通常
使用棱镜或光栅等光学元件来分散光束，使其成为不同波长的光谱。
3. 样品池：将待测样品置于样品池中，光束通过样品时，样品
会吸收特定波长的光。
吸收光的强度与样品中某种物质的浓度成正比。
4. 检测器：检测器接收通过样品后的光束，并将光信号转化为
电信号。
光的强度由电压信号表示。
5. 计算和分析：使用计算机或其他数据处理设备对电信号进行
分析和计算，得出样品中某种物质的浓度。
通过测量样品在不同波长下的吸光度，可以得到样品的吸收光谱。
根据光的强度与浓度之间的线性关系，可以通过比较吸收光强度与标准曲线的关系来确定样品中某种物质的浓度。
分光光度比色法的原理
分光光度比色法的原理
一、物质对光的吸收
分光光度比色法的基础是物质对光的吸收。
当光线穿过物质时，物质会吸收特定波长的光线，导致光的强度减弱。
物质对光的吸收程度与物质的浓度成正比，这是分光光度法进行定量分析的基础。
二、光的色散
光的色散是指光线通过棱镜或光栅等光学元件时，被分解成不同波长的光谱。
通过色散，我们可以将一束白光分解成不同颜色的光谱。
分光光度计利用这个原理，将物质吸收的光线分解成特定波长的光谱，从而确定物质对哪些波长的光线有吸收。
三、比色测定
比色测定是指在特定波长下测量物质对光的吸收程度。
通常，我们将待测物质与已知浓度的标准物质在相同条件下进行比色测定，然后根据标准曲线的斜率和截距计算出待测物质的浓度。
比色测定是分光光度比色法的重要步骤，通过它可以对物质进行定量分析。
四、定量分析
通过比色测定得到的数据，我们可以计算出待测物质的浓度。
在分光光度比色法中，我们通常使用标准曲线法或标准加入法来进行定量分析。
标准曲线法是通过绘制标准物质浓度与吸光度的关系曲线，然后根据待测物质的吸光度在曲线上找到对应的浓度。
标准加入法则是将已知浓度的标准物质加入待测样品中，然后根据吸光度的变化计算待测物质的浓度。
总之，分光光度比色法的原理主要包括物质对光的吸收、光的色散、比色测定和定量分析等方面。
通过这些原理的应用，我们可以快速、准确地测定物质的浓度，广泛应用于化学、生物学、医学等领域。
第十章 分光光度法
注：溶液的透光率T反映了物质对光的吸收程度， T越大表示它对光的吸收越弱；反之，T越小，表 示对光的吸收越强。
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
T
全部吸收
T = 0.0 %
全部透射 T = 100.0 %
2.吸光度： 为透光率的负 A lg I0 lg 1 ＝ lgT
（四）吸光系数 1．定义（物理意义）
一定条件下，吸光物质在单位浓度及单位液层 厚度时的吸光度，叫这个物质的吸光系数。
2．两种表示方法
(1) 摩尔吸光系数( ε )：表示一定波长下，吸光物质的溶液
浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
(2)百分吸光系数(
E1% 1cm
)：表示一定波长下，吸光物质的溶
黄 橙
红
/nm 颜色 400-450 紫
450-480 蓝 480-490 青蓝 490-500 青 500-560 绿 580-610 黄 610-650 橙 650-760 红
互补光 绿
黄 橙 红 紫 蓝 青蓝 青
物质的颜色与光的关系：
完全吸收
光谱示意 复合光
表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
二.物质对光的选择性吸收
A. A~λ曲线
B. A~c曲线
C. A~V曲线
D. E~V曲线
4、紫外分光光度法中，为了使测定结果有较高 的灵敏度和准确度，入射光的波长应（ ）
A．最大吸收波长
B．最小吸收波长
检测器 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管
信号输出 表头、记录仪、屏幕、数字显示
第十章
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源适用350nm-800nm，用于可见 光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源适 用150nm-400nm，用于紫外光区，如氢灯 和氘灯。
分光光度法的原理及应用
分光光度法的原理及应用1. 原理介绍分光光度法是一种常见的分析化学技术，用于测量溶液中化合物的浓度和吸收光谱。
分光光度法基于分子在特定波长下对光的吸收现象，通过测量被溶液吸收的光强度来确定溶液中化合物的浓度。
1.1 光吸收现象分子在特定波长的光照射下，能够吸收光的能量，使得分子内部电子发生激发跃迁，从基态到激发态。
这种吸收是根据化合物的分子结构和电子能级之间的能量差异来决定的。
1.2 分光光度计分光光度计是用于测量溶液吸收光强度的仪器。
它包含一个光源、一个选择特定波长的单色仪、一个样品室和一个光电探测器。
分光光度计能够通过测量样品吸收光的强度来确定溶液中的化合物浓度。
2. 应用分光光度法在许多领域中得到广泛的应用，包括环境监测、食品安全、药物分析等。
以下是一些常见的应用：2.1 环境监测分光光度法常被用于环境中有害物质的检测和监测。
例如，通过测量水样中某种化学物质的吸光度，可以确定水体中的污染程度。
这种方法在水质监测和环境保护中起着重要的作用。
2.2 食品安全分光光度法可以用于检测食品中的添加剂、农药残留物和重金属等有害物质。
常见的应用包括测量食品中的某种营养成分的含量以及检测污染物的浓度。
2.3 药物分析在药物研究和制造过程中，分光光度法用于测量药物的浓度和纯度，以及监测反应的进程。
这种方法是药物研究和制造中常用的一种分析手段。
2.4 生物化学分光光度法在生物化学研究中也具有重要的应用。
例如，通过测量生物样品中特定化合物的吸光度，可以确定样品中的含量，进而研究生物反应的机制和动力学。
3. 测量步骤以下是使用分光光度法测量溶液中化合物浓度的一般步骤：1.设置分光光度计的工作波长和仪器条件，根据所测化合物的特性选择合适的波长。
2.校准仪器，使用标准样品测量光强度。
根据标准样品的光强度和浓度的线性关系，建立校正曲线。
3.取待测样品，使用适当的溶剂将其稀释至合适的浓度范围。
4.在分光光度计中将样品放入样品室，调节波长和仪器条件。
分光光度法及分光光度计使用方法
I0 I
值大，表示溶液吸收光线较多；
当I 0时，lg I0 值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收，即溶液不透光。 I
由此可见， lg I0 表示溶液对光吸收的程度，称作吸光度（absorbance）， I
用A表示，即A lg I0 I
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
如何求被测组分的含量
分光光度法
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2012春季学期
内容
1 分光光度法的原理 2 如何求被测组分的含量
3
3 分光光度计的基本结构 4 分光光度计的使用与注意事项
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法
• 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来 鉴别物质或测定其含量的一项技术。
lg Io k l ＋ lg Io k c ＝ lg Io k c l
I
I
I
2012春季学期
A k cl
生物化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法的原理
lg Io k c l IΒιβλιοθήκη 公式的意义：当I
I
时，
0
lg
I0 I
0，表示溶液完全不吸收光线；
当I＜I0时，lg
若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然 得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线 。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测 定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度
。
A
0.8 0.6 0.4
紫外分光光度法原理
紫外分光光度法原理
紫外分光光度法是一种广泛应用于化学、生物、环境等领域的分析方法，它利
用物质对紫外光的吸收特性来进行定量或定性分析。
其原理是基于物质分子在紫外光照射下，能够吸收特定波长的光线，吸收量与物质的浓度成正比。
接下来我们将详细介绍紫外分光光度法的原理及其应用。
首先，紫外分光光度法的原理是基于兰伯-比尔定律，即溶液中吸光度与浓度
和光程的乘积成正比。
当紫外光通过溶液时，溶液中的物质会吸收特定波长的光，吸光度与溶液中物质的浓度成正比。
这种吸收特性可以用来确定物质的浓度，从而实现定量分析。
其次，紫外分光光度法的原理还涉及到分子的电子跃迁。
在紫外光照射下，分
子的电子会发生跃迁，从基态跃迁到激发态，吸收特定波长的光。
不同的物质由于其分子结构的不同，会吸收不同波长的光，因此可以通过测量吸光度来确定物质的种类和浓度。
紫外分光光度法广泛应用于药物分析、环境监测、生物化学等领域。
在药物分
析中，可以用紫外分光光度法来确定药物的含量和纯度；在环境监测中，可以用来检测水体中有机物的浓度；在生物化学中，可以用来研究生物分子的结构和功能等。
总之，紫外分光光度法是一种简单、快速、准确的分析方法，其原理基于物质
对紫外光的吸收特性。
通过测量溶液的吸光度，可以确定物质的浓度和种类，具有广泛的应用前景。
希望本文能够帮助读者更好地理解紫外分光光度法的原理及其应用。
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分光光度法原理
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分光光度法
目录
第一节基本原理
第二节仪器结构
第三节显色与测量条件的选择
第四节 723N型分光光度计操作维护
第一节基本原理
在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有:
红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围1000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。
紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400 nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。
可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750 nm ，
主要用于有色物质的定量分析。
光的吸收定律
1.朗伯—比耳定律
布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度成正比：A∝b
1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有成正比的关系：A∝c 二者的结合称为朗伯—比耳定律：当一束平行的单色光通过均匀、非散射的稀溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。
朗伯—比耳定律
朗伯—比耳定律
是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。
应用于各种光度法的吸收测量。
它不仅适用于可见光，也适用于紫外光和红外光；不仅适用于均匀非散射的液体，也适用于固体和气体。
朗伯—比耳定律，数学表达式
其数学表达式为
式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度
b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；
c：溶液的摩尔浓度，单位mol/L；
ε：摩尔吸光系数，单位L/mol/cm；
摩尔吸光系数ε的讨论
摩尔吸光系数ε在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时,该溶液在某一波长下的吸光度；
摩尔吸光系数ε的讨论
（1）摩尔吸光系数是吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；
（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。
在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；
（3）可作为定性鉴定的参数；
（4）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。
在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。
εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。
摩尔吸光系数ε的讨论
（5）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。
ε>105：超高灵敏；
ε=(6～10）×104：高灵敏；
ε<2×104：不灵敏。
摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度
桑德尔灵敏度指数：S （μg/cm 2 ）
在λmax 时，A= 下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量。
最佳读数范围与最佳值
吸光度A与透光度T的关系:
A ＝－lg T
用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T %=20～65% ,最佳读数范围：A =～
可求出浓度相对误差最小时的透光度T min为：
T min＝%, A min＝
第二节仪器结构
仪器基本组成
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～1000 nm。
紫外区：氢、氘灯。
发射185～400 nm的连续光谱。
2.单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；
②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；
③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；
④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；
⑤出射狭缝。
3. 样品室（吸收池）
样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。
吸收池主要有石英池和玻璃池两种。
在紫外区须采用石英池（玻璃能够吸收紫外光），可见区一般用玻璃池。
4. 检测器
利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计（721）
数字显示（7230）
微机进行仪器自动控制和结果处理
（723N是带微电脑智能化的分光光度计）
第三节显色与测量条件的选择
显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。
M＋L＝ML 显色反应要求：
（1）选择性好；
（2）灵敏度高，ε>104；
（3）有色化合物ML要稳定，不分解；
（4） ML的组成要一定（只ML 无MLn）；
（5） ML与 L 颜色差别大,吸收峰波长差：Δλ>60nm.
选择合适的参比溶液
为什么需要使用参比溶液
测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。
参比溶液的选择一般遵循以下原则：
参比溶液的选择
1．M、L 均无色，可用蒸馏水作参比。
2. L 无色，M 有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。
3. L有色，M 无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。
4．L、M 均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。
5．改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。
第四节 723N型分光光度计操作维护
开机操作
1、开启主机电源，仪器自动完成初始化，显示主菜单。
2 、仪器预热30分钟。
（要不要打开样品室盖子）
停机操作
1、分析完毕，按“菜单”键，返回主菜单。
（是否一定要返回主菜单，才能关电源）
2、按电源开关键，关闭仪器，切断电源。
3、检查样品室是否有溢出的溶液。
清扫仪器内外卫生，作好仪器使用登记，罩上防尘罩。
日常维护
6.1.1 每次使用后应检查样品室是否积存有溢出溶液，经常擦拭样品室，以防废液对部件或光路系统的腐蚀。
6.1.2 仪器使用完毕后，应盖好防尘罩，可在样品室及光源室内放置硅胶袋防潮，但开机时一定要取出。
6.1.3 长期不用仪器时，尤其要关注环境的温度、湿度，定期更换硅胶。
常见故障和处理
定量分析分为两大部分：
1，化学分析法：（1）容量分析法：酸碱滴定法，氧化还原滴定法，络合滴定法，沉淀滴定法
（2）重量分析法
2，仪器分析法：（1）色谱分析法：气相色谱法，高效液相色谱法
（2）电化学分析法：伏安分析法，库仑分析法，电位分析法
（3）光学分析法：原子吸收法，原子发射法，红外光谱法，紫外光谱
法，
吸光光度法，拉曼光谱法
（4）质谱分析法
（5）核磁共振法。