转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
细胞转染步骤
细胞转染步骤细胞转染是一种将外来脱氧核糖核酸（DNA）或核苷酸序列引入细胞内的技术。
这个过程可以用于研究基因功能、病毒感染和基因治疗。
在细胞转染过程中，有几个重要步骤需要注意。
下面是一个关于细胞转染步骤的简要介绍。
第1步：提取DNA或RNA在细胞转染前，需要先准备好DNA或RNA。
其中，DNA可通过PCR扩增、酵母合成，或从细胞中提取。
RNA则可通过反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）反转录，然后进行DNA扩增。
第2步：选择转染方法目前有很多种不同的细胞转染方法，包括电穿孔、热休克、化学转染等。
要选择适合的转染方法，需要考虑许多因素，如细胞类型、转染效率和毒性等。
常用的转染剂有聚乙烯醇、脂质体、钙磷酸盐等。
第3步：制备转染复合物转染复合物是转染时添加的液体溶液，用于将DNA或RNA引入细胞。
制备复合物通常需要将DNA或RNA与转染剂混合，然后使其与乙醇或其他化学物质形成稳定的颗粒，最终形成复合物。
转染时需要将制备好的转染复合物直接加入培养基中，让细胞与其接触。
接触后，DNA或RNA会被吸附到细胞表面并被内吞到细胞内部。
转染过程通常需要一定程度的时间，具体时间取决于细胞类型和转染复合物的选用。
第5步：培养和维护转染成功后需要对细胞进行培养和维护。
这通常需要注意以下几个因素：1）细胞浸润度：细胞密度应该适合，以便观察细胞形态和产物的表达量。
2）培养基成分：为了保持细胞生长，需要选择适当的培养基成分。
3）药物筛选：转染后可能需要添加药物对细胞进行筛选，以便筛选出目标基因。
4）稳定性维护：为了保证目标基因稳定的表达，需要适当地维护和稳定细胞系。
以上是细胞转染过程中的几个关键步骤。
在进行细胞转染时，需要注意步骤的顺序和方法的选择，以便提高转染效率和成功率。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项稳转细胞系筛选是细胞工程和生物医学研究中非常重要的一环。
以下是关于稳定细胞系筛选的50条注意事项，并对每一条进行详细描述：1. 选择合适的细胞系来源：在进行稳转细胞系筛选前，首先要选择合适的细胞系来源，以确保细胞系的稳定性和易转染性。
常用的细胞系来源包括HEK293、CHO、MDCK等。
2. 确定转染条件：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定适合的转染条件，包括转染试剂种类、浓度、转染时间和细胞密度等。
3. 标定荧光素酶检测试剂盒：在进行稳转细胞系筛选时，需要使用荧光素酶检测试剂盒来检测稳定转染细胞系的活性。
4. 建立适当的质粒载体：选择适当的质粒载体对稳转细胞系的构建和筛选至关重要。
常用的载体包括pCDNA3.1、pcDNA3.1+、pEGFP-N1等。
5. 筛选适宜的筛选标记物：在进行稳转细胞系筛选前，需要选择适宜的筛选标记物，如抗生素、蛋白荧光标记等。
6. 确定稳定转染细胞系的稳定性：在进行稳定转染细胞系筛选时，需要对转染细胞系的稳定性进行验证，通常采用长期培养和连续传代的方式来确保转染细胞系的稳定性。
7. 选择适合的培养基和培养条件：在进行稳转细胞系筛选时，需要选择适合的培养基和培养条件以促进细胞系的稳定生长和表达。
8. 确定荧光素酶基因的稳定插入：在进行稳转细胞系筛选前，需要确保荧光素酶基因在细胞基因组中的稳定插入，通常采用PCR、Southern blotting等方法来验证。
9. 考虑基因组的稳定性：在进行稳转细胞系筛选前，需要考虑基因组的稳定性，并尽量避免对细胞基因组的不良影响。
10. 确定筛选标准：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定筛选标准，如荧光素酶基因活性的阈值、抗生素的最佳浓度等。
11. 使用酶切鉴定：使用酶切鉴定来确保质粒载体的正确构建和稳定转染细胞系的正确筛选。
12. 建立稳定转染细胞系的储备：在进行稳转细胞系筛选后，需要建立稳定转染细胞系的储备，以备后续实验使用。
sirna转染实验步骤及实验要点
sirna转染实验步骤及实验要点siRNA转染实验步骤如下：1.细胞接种：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
2.转染过程：•取0.67μg (50pmol) 的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
•取1μl的EntransterTM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。
室温静置5分钟。
•将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
•将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
•转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。
3.观察和检测：根据具体实验需求，可以在转染后的不同时间点观察细胞状态、检测基因表达、蛋白质表达等。
实验要点：1.细胞接种密度要适宜，一般在30%左右汇合度较好。
2.无血清稀释液的选择对于siRNA的稳定性和转染效率至关重要。
建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640等品牌。
3.在制备转染复合物时，要保证各个步骤的混合均匀，避免产生气泡。
4.在将转染复合物加入细胞时，要保证细胞的生存环境，避免对细胞造成损伤。
5.在转染后的观察和检测中，要注意保证实验结果的准确性和可靠性。
以上信息仅供参考，建议查阅专业文献获取更准确的信息。
真核转染稳定筛选标记及原理
G418。适用于所有的真核细胞
氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统
❖ 遗传标记：CAT，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素 乙酰化反应的蛋白质
❖ 编码产物：氯霉素乙酰转移酶 ❖ 筛选药物：氯霉素 ❖ 作用机理：真核细胞缺乏CAT，将CAT作为报告基因与目
的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中 选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。
潮霉素抗性选择系统
❖ 遗传标记：HPH ❖ 编码产物：潮霉素B磷酸转移酶 ❖ 筛选药物：潮霉素B ❖ 作用机理：HPH灭活潮霉素B
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小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者）
滕达 曾欣宜 席杰 赖惠英 邓宇星
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外源基因表达的三个概念
分类
转化
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入原核细 胞中 。
转染
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入真核细 胞中 。
转导
通过病毒介导 ，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且 在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT） 基因选择系统
❖ 遗传标记：XGPRT ❖ 编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ❖ 筛选药物：霉酚酸
❖ 作用机理：XGPRT合成GMP。
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌 呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）， 可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可 通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
稳转细胞系构建方法总结
稳转细胞系构建方法总结
稳定细胞系构建是生物学研究中非常重要的一部分，它可以用
于基因功能研究、药物筛选、疾病模型构建等多个领域。
稳定细胞
系的构建方法有多种，下面我将从多个角度对稳定细胞系构建方法
进行总结。
首先，稳定细胞系构建的关键步骤包括转染、筛选和鉴定。
转
染是将外源基因导入目标细胞中的过程，常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体法。
化学法包括钙磷沉淀法和脂质体转染法，电穿孔法则利用电脉冲使细胞膜通透性增加，病毒载体法则利
用病毒作为基因导入的载体。
转染后，需要进行筛选以筛选出含有
外源基因的稳定细胞系，通常使用抗生素筛选或者荧光蛋白标记等
方法。
最后，对所得到的细胞系进行鉴定，确认其是否稳定表达外
源基因。
其次，稳定细胞系构建的选择合适的细胞系也是非常重要的。
常用的细胞系包括HEK293、CHO、Hela等，选择合适的细胞系可以
影响到后续的稳定细胞系构建和应用效果。
另外，稳定细胞系构建方法还需要考虑外源基因的选择和构建。
外源基因可以是编码蛋白质的基因、RNA干扰基因、CRISPR-Cas9系统等，根据研究的需要选择合适的外源基因进行构建。
此外，稳定细胞系构建的过程中还需要考虑细胞毒性、稳定性和表达水平等因素，以确保所得到的稳定细胞系能够稳定、高效地表达外源基因。
总的来说，稳定细胞系构建是一个复杂的过程，需要综合考虑转染方法、细胞系选择、外源基因选择和构建以及细胞系鉴定等多个因素，才能够成功地构建稳定细胞系。
希望以上总结能够对你有所帮助。
用G418建立稳定细胞系
实验步骤1
1. 转染：
用CHO或者N2a细胞转染BACE-HA后培养48小时，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；
2. 加G418:
去掉培养液，PBS洗一次，加入浓度为800ug/ml的G418筛选培养基。
3. 换液：
根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。
筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；
4. 挑单克隆：
制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/5ul。
在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液5ul/孔。
待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
5. 单克隆鉴定：
细胞大量扩增后，同时用原细胞系转染PCDNA3.1,并设置对照组即空白对照，提蛋白，做western blot检测。
实验步骤2
1. 将处于对数生长期的CHO或者N2a细胞按比例接种于12孔板，待细胞长到60%时转染。
转染方法同瞬时转染。
2. 待24-48小时后换为含800ug/mlG418的选择性培养基，将细胞按1:10稀释后稳定培养两周换为含600ug/mlG418的选择培养基
3. 将混合细胞吹打成单细胞悬浮计数，调整细胞数为每孔20个/孔，加入100ul含200ug/mlG418的选择培养基，待抗性克隆长出后挑选良好的克隆，逐步放大，压力由含200ug/mlG418的培养基增加至含800ug/mlG418的培养基继续筛选，最后稳定用含800ug/mlG418培养基培养。
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转染细胞的稳定筛选
1、药物筛选前的准备
药筛前应确定药物筛选浓度，不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。
药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可。
2、药物筛选注意事项
（1）药筛的时间
加药时间一般为转染后48h。
但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h
空白对照
加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药。
（2）换液
如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。
另外，随着细胞的代谢，抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。
3、克隆筛选注意事项
若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞。
若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑。
不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。
因此，挑克隆时，应尽量多挑几个克隆，20个左右。
4、稳定克隆筛选步骤
（1）有限稀释法步骤
a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可,若细胞生长很快药筛时可以在
10cm的dish中进行）用胰酶消化下来
b)对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数）
c)计算后，用枪头吸取约200个细胞（其中有部分为死细胞）到10ml培养
液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种
d)然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul，这样有的孔就可
能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔
板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2-3个96孔板）
e)待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔
划叉，只有一个细胞的孔划勾，以做好标记，如果只有一个细胞的孔数
量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾，但这样克隆就可能不纯。
f)等细胞长起来以后，从96孔板到24孔板，再到6孔板逐渐扩大培养
g)细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克隆
是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克
隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆
并大量培养
h)首次验证成功的克隆养两周后再次验证，若仍能保持特性，表示筛出的
克隆较稳定，这样较为稳定克隆即可大量培养保种，并进行后续实验（2）无限稀释法
a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可）用胰酶消化下来
b)对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数）
c)计算后，吸出约5000个细胞，铺到10cm的dish中，摇匀
d)待细胞贴壁后，在显微镜下找到单个细胞，用马克笔在dish的底部做好
标记，然后放到孵箱里培养
e)待单个细胞长成了细胞团（约10个），在显微镜下观察，如果有两个细
胞团靠得很近，则用马克笔在底部做好标记，然后在安全柜内用白枪头
刮掉周围舍弃的细胞团，并不断在显微镜下观察，看周围的细胞是否已
经都被刮掉。
然后换培养液（将刮掉的细胞弃去）
f)放到孵箱里培养数天（细胞团较大，约一两百个），克隆在肉眼下可见
g)将培养液倒掉，用PBS洗两遍，再吸10ul的胰酶在标记好细胞团的地方
不停的快速吹打约1-2min，最后将枪头里细胞悬液打到24孔板内培养
即为挑出的一个克隆，此过程切记不能过长，以免dish太干导致细胞死
亡
h)照7的方法每种细胞至少挑出15个克隆，培养一段时间后，消化到六孔
板中培养（处理时间根据24孔板内的细胞数量而定）
i)细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克隆
是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克
隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆
并大量培养
j)首次验证成功的克隆养两周后再次验证，若仍能保持特性，表示筛出的克隆较稳定，这样较为稳定克隆即可大量培养保种，并进行后续实验。