细胞工程(一)
高二生物植物细胞工程1(1)
细胞工程习题(答案)(1)
细胞培养技术习题（含答案）第一章动物细胞培养概述一、名词解释细胞培养：是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬浮液，然后放在类似于体内生存环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。
组织培养：从生物体内取出活的组织在体外进行培养的方法。
器官培养：将活体内的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基取出，在体外培养的方法。
二、填空题1.体外培养（或组织培养）主要包括_细胞培养_，_组织培养_，和_器官培养_ 三种类型。
2._Harrison_的实验开创了动物组织和细胞培养的先河，他建立了_盖玻片悬滴_培养法3.在卡氏瓶原理的启发下，出现了用试管培养，继而又出现了多种类型的_培养瓶、_培养皿和_多孔培养板_的培养。
从20世纪40年代开始，大多数培养工作都过渡到用_瓶子_培养4.在动物细胞培养方法的发展过程中，具有历史意义的培养方法有盖玻片悬滴培养法，_旋转管培养的方法_，_灌注小室培养法_，和目前普遍应用的单层细胞培养法5.早期细胞培养采用_天然_培养基，现在广泛采用添加___血清_____的_人工合成培养基，近二十年来，动物细胞培养朝着无血清_培养基的方向发展。
三问答题1、动物细胞培养技术现已应用到那些领域？请举例说明。
动物细胞培养技术几乎已应用到生物、医学研究的各个领域。
这门技术自创立至今，已在多个学科领域乃至生产实践中均发挥了巨大的作用。
一、在生物学领域的基础研究中的应用离体培养的动物细胞具有培养条件可人为控制且便于观察检测的特点，因而可广泛应用于生物学领域的基础研究中。
1．在细胞生物学上的应用2．在遗传学上的应用除了可用培养的动物细胞进行染色体分析外，还可结合细胞融合技术建立细胞遗传学，进行遗传分析和杂交育种。
3．在胚胎学上的应用通过体外培养卵母细胞，并进行体外受精、技术而应用于家畜的繁殖生产中。
4．在病毒学上的应用胚胎分割和移植己发展成了一种较成熟的在制备减毒活疫苗和诊断用抗原时，离不开细胞这一病毒增殖的场所。
细胞工程原理-第一章 动物细胞的培养
（二）合成培养基
主要是指通过人工设计、配制而成的，使用时需 添加一定量血清的一类培养基，可在体外较好用 于动物细胞培养。目前已经设计出适合不同类型 细胞的培养基，如DMEM、TC199等。 优点：创制出与体内相似的生存环境，又便于控 制，实现标准化。
主要成分：氨基酸、糖、无机盐、维生素及其他 辅助物质。
定 1.鉴定指标 ① 纯度： 何种细胞为主 ② 细胞学特征： 细胞形态、结构、染色体组型、生长曲线、分 裂指数、倍增时间等
③ 稳定性：传代过程中，细胞学特征是否发生变化 ④ 污染情况： 是否有微生物和其他细胞系污染
2.鉴定方法
① 细胞形态学观察： 光镜和电镜观察形态特征 ② 绘制生长曲线，计算分裂指数 ③ 进行染色体组型和带型分析 ④ 检测同工酶酶谱
人心肌成纤维细胞 成纤维细胞
人乳腺
（3）游走细胞型
特点：细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游 走或变形运动，一般不连接成片。 举例：人单核细胞、巨噬细胞以及某些肿 瘤细胞。
人单核细胞
（4）多行型细胞
特点：呈多角形，是一些形态上不规则的细胞 ，不规则形态是由宽扁的胞质突起所致，细胞 一举般 例分 ：胞 神体 经和 元胞细突胞两、部神分经。胶质细胞。
（一）细胞的冷冻保存
细胞超低温保存的基本原理：细胞在-70℃以下时 ，细胞内的酶活性降低，代谢处于完全停止状态 ，故可长期保存。
细胞低温保存的关键：通过-20-0℃阶段的处理过 程。因为在此温度范围内，易造成细胞的严重损 伤，因此，常常在培养液中加入保护剂来减少对 细胞的伤害。
细胞冷冻过程：将对数期细胞用冻存液（DMSO+血 清或者+培养基+血清）、甘油+血清等）重悬，分
（二）建立细胞系、株
细胞工程___第一章细胞工程绪论
•
第二节
细胞工程
一、细胞工程
细胞工程是运用细胞生物学和分子生物学的方 法，通过类似工程学的步骤，在细胞整体水平或细 胞器水平上，按照人们的意愿改变细胞内的遗传物 质以获得新型生物或特种产品的一门综合性科学技 术。(p7)
应用的原理和方法 概念 研究的水平 研究的目的 细胞工程
细胞生物学和 分子生物学
•
生物化学工程：生物化学工程是由生物科学与化学工程
相结合的交叉学科，主研究新型生物反应器和新型分离技术以及 设备的开发、生物反应过程的数学模型建立和在线检测及控制手 段完善。
四、生物工程在国民经济中的地位
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1)生物制药 2)绿色食品 3)环境保护 4)培育超级农业品种 5)农业现代化 6)提高人类健康水平 7)全面仿生技术
讨论：生命科学未解的八大奥秘？ 思考题：现代生命科学研究的热点？ 作业： 1. 生物工程的概念及研究内容？ 2.细胞工程的概念，研究范围，在生命科学 中与其它学科的关系。 3. 细胞工程技术的标志性成就有哪些？ 4.细胞工程的作用与应用领域？
参考书目： 1、李志勇，《细胞工程》科学出版社。 2、罗立新《细胞工程》华南理工大学出版社。 3、谢从华，《植物细胞工程》高等教育出版社。 4、朱至清，《植物细胞工程》化学工业出版社。 5、安利国，《细胞工程》科学出版社。 6、《动物组织培养技术及其应用》 陈瑞铭 科学 出版社。 7、鄂征 ，《组织培养技术》人民卫生出版社。 8 、司徒镇强 吴军生《细胞培养》 世界图书出版 公司。
这一领域已达到世界先进水平，以花药单倍体育种途径，培育出的水稻品种 或品系有近百个，小麦有30个左右。其中河南省农科院培育的小麦新品种， 具有抗倒伏、抗锈病、抗白粉病等优良性状。
细胞工程(1)
第一章绪论细胞工程（Cell Engineering)：以细胞生物学与分子生物学为基础理论，采用原生质体融合、亚细胞操作、细胞培养等方法与技术，在细胞水平上改造生物遗传物质，以获得新的性状的细胞系、生物体及生物次生代谢物质。
细胞工程核心技术：细胞的培养与繁殖目的：获得新性状、新个体、新物质。
细胞工程研究内容: 细胞体外培养技术、细胞融合、细胞质工程（核移植）、染色体组工程、染色体工程、基因工程细胞工程：细胞体外培养技术、细胞融合技术、细胞器移植技术细胞工程应用意义：利用组织培养技术——大量生产苗木改善农业生产技术——动植物品种改良保护自然资源——名贵中药细胞生产。
保护自然环境——生物工业代替化学工业生物医药开发与利用生物材料开发与利用第二章实验室设置与基本技术细胞工程实验室三个基本的需要：实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌等）；无菌操作；控制培养。
实验室布局的其基本要求：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察实验室组成：基本实验室、辅助实验室基本实验室：准备室、接种室、培养室准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。
要求宽敞明亮、通风条件好。
接种室：功能是进行无菌操作。
要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌；房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定；除了出入口和通气口外，应行密闭。
培养室：功能是对离体材料进行控制培养。
首要要求是要能控制光照和温度；其次为防止微生物感染；培养室应保持干燥和清洁。
辅助实验室：细胞学实验室、摄影室及暗室、生化分析室细胞学实验室：功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。
要求清洁、明亮、干燥；使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。
生化分析室：培养物的有效成分随时进行取样检查。
要求清洁、明亮、干燥；使各种仪器不受潮湿和灰尘污染。
摄影室及暗室：功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。
要求暗；不受潮湿和灰尘污染。
基本设备：天平、酸度计、电炉、培养基分装器、微波炉、冰箱、纯水器灭菌设备：紫外灯、干热消毒柜、喷雾消毒器、蒸汽压力灭菌锅、过滤灭菌装置无菌操作设备：接种箱、净化工作台光温控制设备：时间程序控制器、空调、温度感应器细胞培养设备：培养箱、培养架、摇床、生物反应器细胞学鉴定设备：实体显微镜、倒置显微镜、光学研究显微镜生化分析设备：真空冷冻干燥器、超临界CO2仪、层析冷柜、蛋白质分离纯化仪、培养器皿及实验用具：玻璃器皿、金属材质用具、新型材料器皿洗涤液：碱性洗涤液：洗衣粉；加酶洗衣粉；洗洁精铬洗涤液：铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制要求：玻璃器皿透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。
植物细胞工程实验 (1)
植物细胞工程实验一 培养基母液的制备一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。
当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。
二、实验器材电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。
三、实验药品NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。
四、实验步骤每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制表1 MS 培养基大量元素母液制备序号 药品名称培养基浓度（mg/L ）扩大20称量(mg)备注1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml2 KNO3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 44004 MgSO 4·7H 2O 370 37005 KH 2PO 41701700各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。
后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。
高中生物思维导图-选修一-细胞工程
植物材料（由具有分生能力的不定形薄壁细胞组成）外植体消毒接种到培养基＋适宜条件（恒温避光）脱分化变异材料诱变处理愈伤组织细胞产物细胞处于不断分生状态，易产生突变。
胚状体再分化接种到分化培养基人工薄膜包装幼苗人工种子体现细胞全能性体细胞花粉新个体单倍体①②③④⑤植物繁殖新途径作物新品种的培育细胞产物的工厂化生产单倍体育种突变体利用微型繁殖作物脱毒人工种子应用植物组织培育技术①②③④⑤④利用分生区（如茎尖）保持优良性状；缩短育种年限；不受季节、气候、地域的限制。
（也可包裹不定芽、腋芽、顶芽。
）胚状体无性生殖有性生殖植物体细胞杂交技术发酵罐培养纤维素酶果胶酶物理：离心、振动、电激化学：聚乙二醇（PEG ）诱导人工诱导原生质体A 原生质体B A 细胞B 细胞去壁正在融合的原生质体再生出细胞壁植物组织培养杂种植株××筛选动物细胞单个分散细胞细胞悬液贴壁生长分瓶培养10代细胞50代细胞不死细胞胰蛋白酶或胶原蛋白酶胃蛋白酶？加培养液蛋白酶处理原代培养传代培养少数少数无菌、无毒环境——加抗生素；定期更换培养液36.5±0.5℃、pH 为7.2-7.4；95%空气+5%CO 2糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素；血清、血浆。
CO 2维持pH 条件使用或冷冻保存10代以内：保持细胞正常的二倍体核型转入培养液＋接触抑制癌化应用生产生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体用于基因工程受体细胞培养用于生理、病理、药理等研究动物细胞培养技术供体体细胞供体细胞卵巢卵母细胞MⅡ中期卵母细胞去核卵母细胞细胞培养（10代以内）去核注入细胞融合重组胚胎胚胎早期培养代孕母体与供体遗传物质基本相同的个体细胞培养使克隆动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物 1.克隆动物绝大部分DNA 来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA ，即线粒体中的DNA 是来自于受体卵母细胞。
2.生物的性状还受环境的影响。
高中生物第章细胞工程.1动物细胞培养学案选择性3
动物细胞培养必备知识·素养奠基一、动物细胞培养概念从动物体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
二、动物细胞培养的条件1。
营养条件:(1)合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成。
（2)天然成分：血清等.（3）一般使用液体培养基,即培养液。
2。
无菌、无毒的环境：(1）培养液和培养用具灭菌处理。
(2）无菌环境下操作.（3）培养液定期更换的目的：清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
3。
温度、pH和渗透压:(1)适宜的温度：哺乳动物多以36。
5±0。
5℃为宜。
(2）适宜的pH:多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。
(3)适宜的渗透压。
动物细胞培养能否体现动物体细胞的全能性？说明你的理由。
提示:不能。
动物细胞培养只是细胞的增殖，没有体现细胞的全能性。
4.气体环境：95％空气和5%CO2。
（1)O2作用：细胞代谢所必需的。
(2）CO2的主要作用：维持培养液的pH。
三、动物细胞培养的过程填一填：基于动物细胞培养的过程，完成下面的问题:（1)过程①处理方法有:机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法.(2）过程②为原代培养,培养的动物细胞有两类:①悬浮在培养液中生长增殖;②贴附于某些基质表面生长增殖。
(3）进行过程③时,悬浮培养的细胞直接用离心法收集;贴壁细胞需要使用胰蛋白酶等处理，然后用离心法收集.（4)过程③为传代培养，进行过程③的原因主要有:细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏和接触抑制等。
四、干细胞培养及其应用1。
干细胞分布：早期胚胎、骨髓和脐带等。
2.种类：胚胎干细胞和成体干细胞。
3.判一判：基于干细胞的类型和应用,判断下列说法的正误。
(1)胚胎干细胞和成体干细胞都具有形成机体的所有组织和器官,甚至个体的潜能. (×)提示:成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
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2）动物细胞培养的环境特性 A 生物特性
具有精细分工、职能专一的 细胞器
能够进行蛋白质翻译后的修 饰。
B 营养要求
开始的培养基主要是全血清培养基，但由于 血清的缺陷，目前开发无血清培养基是细胞培养 的主要方向。
3 动物细胞培养方法
动物细胞的离体培养方法有两种方式： 1）贴壁培养：贴附在比表面积较大的微载
获得原代细胞的步骤： 解剖分离 培养液淋洗和切成碎片 再淋洗 酶法分离成单个细胞 离心分离后再培养
B 连续化培养
❖ 大多数细胞系在有限的代数内以不变的形 式增殖，当超过有限世代后，它们可能有 两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永 久细胞系或称连续细胞系。
❖ 适应在体外培养条件下持续传代培养的细 胞称为传代细胞。
教材：P53～56
二、动物细胞工程
（一）、动物细胞研究历史进展和应用 （二）、哺乳动物细胞培养 （三）、动物细胞融合和单细胞克隆等技术
简介
（一）动物细胞研究历史进展和应用
1、动物细胞工程发展历史 1）、细胞融合现象的发现
19世纪30年代到50年代，Muller 等相继在肺结核、天花 等病理组织中和正常组织中（如骨髓和肺等）观察到多核 细胞现象；到1959年，自然界中广泛存在着多核细胞的事 实，才被接受。 2）、动物细胞培养技术的建立
❖ 一般情况下，非致死细胞可直接转化为连 续细胞，可以连续增殖；而其他细胞需要 经过环境适应（如啮齿动物细胞）、杂交 或基因修饰才能转化为连续细胞。
细胞系：经过原代培养，细胞逐渐形成具有 相似生理即代谢特性的稳定细胞系，可供 繁殖和多次传代培养。一旦原代细胞进行 了传代培养即成为细胞系。
细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用 单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单 细胞增殖形成的细胞群，称细胞株 。细胞 株具有特殊的表型性质。
细胞工程(一)
2020年7月12日星期日
举例：干扰素（IFN）是人体细胞分泌的一 种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿 瘤和免疫调节活性。早期的干扰素是用病 毒诱导人体白血球或白细胞产生的，其产 量低、价格昂贵。现在可以利用基因工程 生产干扰素。
细胞工程（一）
一、细胞工程概述
（一）细胞工程的定义 （二）细胞工程分类和研究对象 （三）细胞的主要培养技术
3）、细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958年, Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。 60年代，Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活。 1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的
小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细 胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力， 并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。
1907年，Harrison首先培养了蛙胚神经管区细胞，并观 察到从中长出的轴突细胞（神经纤维），他的工作被认为 是动物细胞培养开始的标志；
1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长 促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。
1914年，Thomson建立了器官培养技术。 1940年，1951年，Earle和Gay分别建立了c3H小鼠结缔 组织细胞系的L系和人体细胞系－人体宫颈癌Hela细胞系。
体上或直接贴附在反应器器壁上， A 对象：大多数原代细胞 Ｂ贴壁基质要求：要求是单层膜和正电荷；
通常是用玻璃或一次性塑料 C 实验室培养：多空板培养皿和培养瓶等小
2、动物细胞工程的应用 ❖ 动物细胞培养生产医药产品（单克隆抗体） ❖ 新品种培育 ❖ 试管动物与婴儿 ❖ 组织工程 ❖ 珍稀动植物资源的保存与保护
（二）、哺乳动物细胞培养
1、培养对象细胞和性质 ❖ 培养对象：哺乳动物细胞和昆虫动物细胞 ❖ 哺乳动物细胞种类与性质 根据细胞的寿命，分为
非致死细胞：在体外培养基中不断增殖，数目以指数式 形式增加，当细胞密度达到一定程度时，细胞停止分 裂，不再生长。但当被放到新鲜培养基中，细胞重新 生长。这样可以连续传代。这种细胞包括癌细胞、表 皮细胞和成纤维细胞。
B、根据研究水平来划分 组织水平 细胞水平 细胞器水平 基因水平
C、根据实验操作对象可分为： 细胞与组织培养 细胞融合 细胞核移植 染色体操作 转基因生物等
（三）细胞的主要培养技术
1、无菌操作技术 2、细胞培养技术：指生物细胞和组织在体外无菌条
件下和适当的温度、气体和营养环境中的保存、生 长和增殖。是细胞工程的最基本技术。 3、细胞融合技术：是指在离体条件下，用人工方法 将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无 性方式融合为一个杂合细胞的技术。包括病毒融合 、化学融合、和电融合 4、细胞核移植技术：利用显微操作技术将细胞核与 细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形 成杂种细胞。
（一）细胞工程的定义
➢ 细胞工程是在细胞水平上的工程，它应用 细胞生物学和分子生物学的方法，以细胞 和细胞器为对象进行操作，在体外条件下 进行培养、繁殖，或人为的使细胞某些生 物学特性按人们的意愿发生改变，最终获 得人们所需要的组织、细胞或个体。（ P51）
（二）细胞工程分类和研究对象
A、根据研究对象划分 动物细胞工程 植物细胞工程 微生物细胞工程
4）、动物克隆技术的建立 1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种
或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1％ 的重组卵发育成为成熟蛙。
这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献 在于： ① 证明了动物细胞仍然具有全能性； ② 初步建立了体细胞核移植的实验体系， ③ 卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用
致死细胞：能在体外生存和增殖，但不能连续传代，往 往分裂几代或几十代后就会死亡。大多数细胞属于这 类细胞。
2、培养过程ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1）动物细胞分离和传代培养过程 A 获得原代细胞 原代培养：从特定功能组织器官中分离后，
无法增殖或处于稳定传代培养前动物细胞 ，又叫初代细胞。 获得原代细胞是一系列细胞培养的第一步