过氧化氢酶活性的测定

植物体内过氧化氢酶活性的测定

一、目的

过氧化氢酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系，故常加以测定。通过实验可了解过氧化氢酶的作用，并掌握测定过氧化氢酶活性的原理和方法。

二、原理

过氧化氢酶把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，以一定时间内分解的过氧化氢量来表示，当酶与底物（H2O2）反应结束后，用碘量法测定未分解的H2O2量。以钼酸铵作催化剂，使H2O2与KI反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，其反应式为：

H2O2 + 2KI + H2SO4 —→I2 + K2SO4 + 2H2O

I2 + 2Na2S2O3 —→2NaI + Na2S4O6

根据空白和测定二者硫代硫酸钠滴定用量之差，即可求出过氧化氢酶分解H2O2的量。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：水稻叶、甘蔗叶及其他植物叶片。

2. 仪器设备：分析天平；恒温水浴；研钵；100ml容量瓶；100ml三角瓶；滴定管；滴定管架；移液管；移液管架；漏斗；洗耳球等。

3. 试剂及配制

1.8mol·L－1H2SO4

10﹪(NH4.)6M O7O4

0.02 mol·L－1 Na2S2O3

20﹪KI

1﹪淀粉液

CaCO3粉

石英砂

0.018﹪H

2O

2

溶液配制：吸取30﹪H2O2原液0.3ml至50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻

度，摇匀后再稀释10倍。

四、实验步骤

1. 过氧化氢酶的提取

选取甘蔗功能叶片，擦净去主脉剪成碎片，混匀后迅速称取1g放入经冷冻过的研钵中，加少量CaCO3粉末及石英砂，并加入3～4ml蒸馏水，在冰浴上研磨至匀浆，用蒸馏水将匀浆通过漏斗洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后过滤。然后再取滤液10ml 至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀即为酶稀释液。

2. 酶活性测定

2.1取100ml容量瓶4个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10ml，立即向3、4号瓶中加入1.8mol·L－1H2SO4 5ml以终止酶活性，作为空白测定。

2.2将各瓶放在20℃水浴中保温5～10min（若室温超过20℃则以室温为准）。保温后向各瓶准确加入 0.018﹪H2O2 5ml, 摇匀并记录酶促反应开始时间。

2.3将各瓶放在20℃水浴中让酶与底物（H2O2）作用5min。时间到后迅速取出，立即在1、2号瓶中加入1.8mol·L－1H2SO4 5ml以终止酶活性。

2.4向4个瓶中各加入20﹪KI 1ml和3滴10﹪(NH4.)6M O7O4，摇匀，用0.02 mol·L－1 Na2 S2O3

滴定至淡黄色后再加入5滴1﹪淀粉液作指示剂，再用0.02 mol·L－1 Na2S2O3滴定至蓝色刚消失为滴定终点，记录Na2S2O3用量。

五、酶活性计算

空白与样品两个重复滴定值取平均值按下公式计算出过氧化氢酶活性：

被分解H2O2（mg）= 〔空白滴定值（ml）－样品滴定值（ml）〕× C × 17.17

被分解H2O2（mg）×酶液稀释倍数过氧化氢酶活性（mgH2O2·g－1Fw·min－1）= ————————————————————

样品鲜重（g）×酶促反应时间（min）

公式中：C － Na2S2O3量浓度

17.17 —H2O2摩尔质量